侵染大蒜12種病毒CP基因的原核表達(dá)、抗血清制備及其病毒檢測

侵染大蒜12種病毒CP基因的原核表達(dá)、抗血清制備及其病毒檢測大蒜(A.sativumL.)是我國重要的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物,它的口感非常獨(dú)特,與眾不同,營養(yǎng)價(jià)值也很高,在我們的日常生活中常作為佐料來使用,同時(shí)在對抗細(xì)菌、降低血脂濃度、降低血糖含量,預(yù)防癌癥發(fā)生等多方面有重要功效,除了作為調(diào)味品外,在醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用上也占有重要地位。用鱗莖無性繁殖是大蒜種植普遍采用的方式,經(jīng)多代多次無性繁殖后病毒的含量會(huì)不斷積累增加,造成產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降。大蒜感染病毒后的田間癥狀多種多樣,主要有植株矮化,葉片變黃,并出現(xiàn)不同程度的斑點(diǎn)和皺縮等,還有的感染病毒后不表現(xiàn)任何癥狀。大蒜病毒病是大蒜生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害,且很難用藥物治療,解決此問題最經(jīng)濟(jì)和有效的措施就是培育脫毒或者低毒的種子,確定種子是否帶病毒,首先要制備出病毒的抗體,然后選擇簡便經(jīng)濟(jì)高效的方法檢測病毒。侵染蔥屬植物的病毒主要包括三個(gè)屬的病毒,一是蔥屬X病毒屬(Allexivirus),Allexivirus主要有6種病毒,分別是大蒜A病毒(GarlicvirusA,GarVA)、大蒜B病毒(GarlicvirusB,GarVB)、大蒜C病毒(GarlicvirusC,GarVC)、大蒜D病毒(GarlicvirusD,GarVD)、大蒜E病毒(GarlicvirusE,GarVE)、大蒜X病毒(GarlicvirusX,GarVX);二是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),Potyvirus主要有3種病毒,分別是韭蔥黃條病毒(Leekyellowstripevirus,LYSV)、洋蔥黃矮病毒(Onionyellowdwarfvirus,OYDV)、胡蔥黃條病毒(Shallotyellowstripevirus,SYSV);三是香石竹潛隱病毒屬(Garlavirus),Garlavirus主要有3種病毒,分別是大蒜潛隱病毒(Garliclatentvirus,GarLV)、大蒜普通潛隱病毒(Garliccommonlatentvirus,GarCLV)、青蔥潛隱病毒(Shallotlatentvirus,ShLV)等。從全國各地采集大蒜葉片。根據(jù)GenBank報(bào)道的序列設(shè)計(jì)病毒的引物,采用PCR法擴(kuò)增GarVA、GarVB、GarVC、GarVD、GarVE、GarVX、LYSV、OYDV、SYSV、GarLV、GarCLV、ShLV這12種病毒的CP基因。在T-A連接酶的作用下,將12種病毒的CP基因與表達(dá)載體pSBET相連,用堿裂法提取高拷貝的質(zhì)粒,送到上海生工測定重組質(zhì)粒的序列。在雙酶切的作用下,將CP基因與大腸桿菌BL21(DE3)PlysE表達(dá)載體連接,擴(kuò)大培養(yǎng)含有目的基因的菌株,添加定量的IPTG,誘導(dǎo)CP基因原核表達(dá),12%SDS凝膠電泳檢測表達(dá)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)表明目的基因在大腸桿菌內(nèi)成功表達(dá)。采用兩次電泳的方法純化CP蛋白,先是12%SDS,然后是5%-20%SDS,將純化的CP蛋白研磨均勻后免疫小白鼠,就可以獲得抗CP血清。蛋白質(zhì)印跡法檢測制得的抗血清,結(jié)果顯示抗血清特異性都很高,說明均合格,用制得的12種抗血清分別與原核表達(dá)的病毒蛋白做Westernblot分析,GarVD和GarVE的CP之間有交叉反應(yīng),其他病毒之間無交叉反應(yīng)。酶聯(lián)免疫法檢測得出,天然病毒粒子的表達(dá)蛋白都能與抗血清特異性結(jié)合。檢測大蒜是否感染12種病毒采用3種方法,分別是蛋白質(zhì)印跡法、間接ELISA法和Dot-ELISA法。其中,蛋白質(zhì)印跡法的陽性顯示和對照不明顯,因此不能用于檢測,間接ELISA法和Dot-ELISA法的檢測效果都很好,并且實(shí)驗(yàn)過程都相對比較簡單