電泳八年制(法)

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(八年制）細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)

電泳課程安排生化四大基本技術(shù)電泳（P5,P14,P16）層析（P23,P30,P32,P35）分光光度法（比色法）離心法分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（鼠肝actin基因的檢測(cè)）（P109,P58）（P123）課程要求重視過(guò)程，重視結(jié)果分析注意融會(huì)貫通，方法應(yīng)用考試平時(shí)成績(jī)實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)記用鉛筆在薄膜無(wú)光澤面一端2cm處畫一細(xì)線，在右上角做好標(biāo)記。

浸泡將醋酸纖維素薄膜無(wú)光澤面向下，在緩沖溶液中浸泡，使其充分浸透。

點(diǎn)樣

用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體(不要太干），利用載玻片

一側(cè)蘸取樣品，于細(xì)線處點(diǎn)樣。

電泳

將薄膜無(wú)光澤面朝下，平懸于電泳槽支架的濾紙橋上，點(diǎn)樣一端靠近負(fù)

極；通電后先使U=80V，待10min后，使U=120V電泳40min。

染色將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑，染色5min。

漂洗將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次。醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白電泳技術(shù)發(fā)展概念基本原理影響因素種類應(yīng)用

TheNobelPrizeinChemistry1948

Arne

Tiselius

1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年瑞典科學(xué)家Tiselius首先設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，并建立了“移界電泳”分離模式。以電泳作為一種分離技術(shù)，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白組成的。

"forhisresearchonelectrophoresisandadsorptionanalysis,especiallyforhisdiscoveriesconcerningthecomplexnatureoftheserumproteins"發(fā)展20世紀(jì)50年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。1967年在凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。90年代又推出了分辨率極高的高效毛細(xì)管電泳。如今，各類電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。電泳的基本概念帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)

。帶電粒子由于帶電性質(zhì)及電荷量不同，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下具有不同的移動(dòng)速度及方向。電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。電泳用于分離物質(zhì)的原理（1）電荷量及方向：蛋白質(zhì)為例等電點(diǎn)電泳用于分離物質(zhì)的原理（2）遷移率：以來(lái)表示，即單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，取決于帶電粒子的電荷量Q、粒子大小γ和形狀。電泳用于分離物質(zhì)的原理（3）具體實(shí)驗(yàn)中：

V:泳動(dòng)速度cm/秒or分d:泳動(dòng)距離cmt:電泳時(shí)間(秒/分)E:電場(chǎng)強(qiáng)度伏特/cmu:泳動(dòng)率or泳動(dòng)度(cm2/伏·秒or分)U:電壓l:支持場(chǎng)的長(zhǎng)度(有效長(zhǎng)度)設(shè)：混合物中有A、B兩物質(zhì)：物質(zhì)A在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為:dA=

AVt/l

物質(zhì)B的移動(dòng)距離為：dB=BVt/l

則兩物質(zhì)移動(dòng)距離之差為：

Δd=(dA-dB)=(A-B)Vt/l

即：物質(zhì)A、B能否分離取決于兩者的遷移率

影響電泳速度的因素：內(nèi)因

1.凈電荷：被分離物帶電荷量與電泳速度成正比

2.質(zhì)點(diǎn)大?。侯w粒直徑愈小愈快，分子大小與電泳速度成反比

3.質(zhì)點(diǎn)形狀：球形分子比纖維狀分子泳動(dòng)快。影響電泳速度的因素：外因（1）溶液的pH值

決定帶電粒子的解離的程度，即該物質(zhì)帶凈電荷多少的決定因素。對(duì)蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動(dòng)速度也越快，反之，則越慢。為了使電泳過(guò)程中溶液pH值恒定，必須采用緩沖溶液。一般常用的電泳緩沖液pH范圍在4.5~9.0。影響電泳速度的因素：外因（2）溶液的離子強(qiáng)度

維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān)。I=1/2CZ2

緩沖液I越大，樣品電流減小，泳動(dòng)速度變慢，區(qū)分條帶清晰；過(guò)高會(huì)壓縮質(zhì)點(diǎn)的雙電層，最后破壞膠體，不能泳動(dòng)。

I越小，則泳動(dòng)速度快，條帶分離差，過(guò)低，緩沖容量小，PH不穩(wěn)定，樣品易擴(kuò)散。一般在0.02-0.2。

影響電泳速度的因素：外因（3）電場(chǎng)強(qiáng)度

是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆粒泳動(dòng)速度慢。電壓越高，產(chǎn)熱增加，高壓電泳需備冷卻裝置。

否則？影響電泳速度的因素：外因（4）支持介質(zhì)：(1)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過(guò)程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學(xué)惰性：在電泳過(guò)程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾生物大分子的電泳過(guò)程。(3)分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復(fù)性好電滲：液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，在電場(chǎng)中，由于多孔支持物吸附水中的正或負(fù)離子使溶液相對(duì)帶電，在電場(chǎng)作用下，溶液就向一定方向移動(dòng)。

種類：自由界面電泳區(qū)帶電泳：紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳、凝膠電泳。連續(xù)系統(tǒng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)盤狀平板式垂直板式電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。電泳技術(shù)的應(yīng)用分離純化樣品測(cè)定分子量組建物理圖譜鑒定重組體分子雜交測(cè)序PCR檢測(cè)分子標(biāo)記檢測(cè)醋酸纖維薄膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中。（醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白）聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。（等電聚焦電泳分離血紅蛋白和細(xì)胞色素C）瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。

聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

原理：以醋酸纖維薄膜為支持物，在PH=8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白的PI均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。由于遷移率不同而被分離，醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白表-1血清中各蛋白質(zhì)的相關(guān)特性種類分子量(萬(wàn)）PI分布(%)清蛋白1-球蛋白2-球蛋白-球蛋白-球蛋白6.95.09.013.011.04.85.05.05.26.8-7.5552.1~30.84.1~72.51.2~2515.6蛋白質(zhì)染料氨基黑10B

酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。這類染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)結(jié)合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質(zhì)的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應(yīng)用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍(lán)所代替。優(yōu)缺點(diǎn)醋酸纖維薄膜廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡(jiǎn)單快速、對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象，染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶更清晰等優(yōu)點(diǎn)，電滲作用雖然較高但很均一，不影響樣品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度小（約10～100μm），樣品用量很少，不適于制備

前清蛋白

清蛋白-球蛋白-球蛋白臨床意義：白蛋白：主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關(guān)。α球蛋白的增加與發(fā)熱有關(guān)，與炎癥有關(guān)。Β球蛋白增加常伴隨血中脂質(zhì)的增加。Γ球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在Β球蛋白與Γ球蛋白之間出現(xiàn)一個(gè)尖峰：M蛋白肝硬化病人Γ球蛋白增加，白蛋白降低。聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分離Hb和細(xì)胞色素C細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)Xu_weirong@163.com

聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(IsoelectricFocusing，簡(jiǎn)稱IEF)：

利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)，兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自PI形成從陽(yáng)極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶。原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)蛋白質(zhì)由于等電點(diǎn)的不同而帶有不同的電荷性質(zhì)。在電場(chǎng)下發(fā)生移動(dòng)，當(dāng)它們達(dá)到凈電荷為零時(shí)停止遷移，分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置，這種行為稱為聚焦反應(yīng)。蛋白質(zhì)在等電聚焦電泳中的分離僅僅決定于其等電點(diǎn)，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，如果它要正極或負(fù)極任何一側(cè)擴(kuò)散，均會(huì)受到相應(yīng)的pH制約，迫使其擴(kuò)散后退回原位。因此，蛋白質(zhì)能在等電點(diǎn)位置被聚焦成一條穩(wěn)定的窄帶。分辨率高，有濃縮效應(yīng)。

等點(diǎn)聚焦特點(diǎn)在等電聚焦電泳中，分離是在連續(xù)的pH梯度中進(jìn)行的，用兩性電解質(zhì)建立電場(chǎng)中連續(xù)線性pH梯度。只適用于兩性解離的物質(zhì)電泳以聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegelelectrophorsis，簡(jiǎn)稱PAGE)為電泳支持物,分辨率高用于分離、鑒定蛋白質(zhì)pH梯度的形成載體兩性電解質(zhì)定義：許多異構(gòu)體與同系物的混合物，化學(xué)本質(zhì)是多羧基多氨基脂肪族化合物，具有連續(xù)的PI值。在沒(méi)有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷,只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等,凈電荷為零.引入電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽(yáng)極移動(dòng),最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移.pH梯度的形成靠近陽(yáng)極端的載體兩性電解質(zhì),電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì),電正性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力,使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陽(yáng)極順延。在正極注入酸液如：硫酸，磷酸；負(fù)極注入堿液如NaOH，避免樣品和兩性電解質(zhì)載體在陽(yáng)極氧化，或在陰極還原。加酸加堿pI小大關(guān)鍵是形成pH梯度pH低高理想的兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。(2)在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)及相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場(chǎng)。(3)分子量小，可通過(guò)透析或分子篩法除去，便于與生物大分子分開(kāi)。(4)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無(wú)變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。兩性電解質(zhì)載體的pI愈連續(xù)，形成的pH梯度愈平滑。pH梯度的形成：Ampholine(瑞典LKB)

它是由許多脂肪族的多氨基,多羧基的異構(gòu)體和同系物組成的,具有連續(xù)的氨基羧基比，pH范圍3.5-10.分子量300-1000280nm紫外吸收低抗對(duì)流支持介質(zhì)：聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebi

sacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。用此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophorsis，簡(jiǎn)稱PAGE)。反應(yīng)方程式：聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過(guò)提供氧游離基(freeradicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redoxsystems)來(lái)完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP—TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素——TMTED）體系。單體：丙烯酰胺（Acr）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；催化劑：過(guò)硫酸胺或核黃素；加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠AP-TMTED催化體系：TMTED是一種脂肪族叔胺，·TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82－→2SO4·ˉ硫酸自由基的氧原子激活A(yù)cr單體并形成單體長(zhǎng)鏈：影響聚丙烯酰胺凝膠聚合的因素

試劑的純度溫度氧氣〔AP〕〔TEMED〕原則：盡量少的催化劑并在最佳時(shí)間內(nèi)聚合。聚丙烯酰胺凝膠為支持介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，幾乎無(wú)帶電基團(tuán)，電內(nèi)滲小?；瘜W(xué)惰性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，親水性好。具有很好的光學(xué)透明度和一定的剛性。抗對(duì)流和擴(kuò)散。具有可控的孔徑大小。樣品的預(yù)處理鹽離子可干擾pH梯度形成并使區(qū)帶扭曲。為防止上述影響，進(jìn)行IEF時(shí)，樣品應(yīng)透析或用SephadexG-25脫鹽，也可將樣品溶解在水或低鹽緩沖液中使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。為提高疏水蛋白在水中的溶解度，可添加尿素，無(wú)離子/兩性離子去污劑。加樣量則取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目以及檢測(cè)方法的靈敏度。如用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，加樣量可為50-150

g；一般樣品濃度以0.5-3mg/mL為宜操作方法：1.凝膠柱的制備（1）玻璃管的一端7cm處作標(biāo)記用膠布封底，插入插座，垂直放置（2）配膠

10mL7.5%凝膠的配制試劑名稱 體積(mL) 凝膠貯液 2.0 兩性電解質(zhì)載體 0.2 蛋白質(zhì)樣品 各0.1 蒸餾水