基于轉(zhuǎn)錄組測序枇杷EST-SSR標記的開發(fā)與利用

基于轉(zhuǎn)錄組測序枇杷EST-SSR標記的開發(fā)與利用枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)起源于我國東南部,是中國特色水果,具有極高醫(yī)療保健價值,栽培歷史悠久,品種繁多,與其他國家相比我國枇杷種質(zhì)資源更為豐富。但目前對枇杷的遺傳研究及基因組信息研究較少,因此我們需要對枇杷進行更深一步的分子基因組研究,為其種質(zhì)資源分類、遺傳多樣性分析及分子標記輔助選育等研究奠定基礎(chǔ)。本試驗通過對洞庭枇杷的轉(zhuǎn)錄組進行大規(guī)模測序,利用獲得的轉(zhuǎn)錄組序列進行EST-SSR分子標記的開發(fā),將開發(fā)的標記進行枇杷及其近緣物種間的通用性分析和遺傳多樣性分析,并對洞庭野生型和突變型枇杷進行特異EST-SSR片段克隆進而對其差異基因進行探討,主要研究結(jié)果如下：1.我們總共獲得61587個Unigene,對其進行微衛(wèi)星搜索,得到6693個Unigene包含7649個SSR位點。在對SSR位點進行重復類型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在二核苷酸到六核苷酸之間,重復類型最多的是二核苷酸其數(shù)量總計4593,占所有重復類型的60.05%;最少的重復類型是五核苷酸,占總數(shù)的2.08%。在對重復類型最多的序列進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),重復序列中出現(xiàn)頻率最高的是二核苷酸重復類型中的AG/CT,占所有重復序列的52.6%；其次是三核苷酸重復類型中的AAG/CTT和AGG/CCT,分別占所有重復序列的6.6%和6%;而在二核苷酸重復序列類型中沒有出現(xiàn)CG/GC重復序列。2.通過MISA搜索獲得到7649個SSR位點,成功設(shè)計出278對引物,我們用這278對引物在‘洞庭紅肉’和‘洞庭白肉,枇杷中進行擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中246對引物都可以得到清晰明亮條帶,擴增效率達到88.5%。3.從278對EST-SSR引物中選擇擴增效果好、條帶明亮和具有高多態(tài)性的25對引物分別對18份枇杷種質(zhì)、6份蘋果種質(zhì)以及3份桃種質(zhì)進行擴增,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這25對引物在這三種材料中擴增效果都達到了92%,說明我們在洞庭枇杷上開發(fā)的EST-SSR分子標記在其他枇杷品種及其近緣物種上也具有一定通用性；并且我們發(fā)現(xiàn)Ejl、Ej46、Ej229這三對引物可以用于區(qū)分這三大類試材。4.在25對引物中其中22對都分別在三類材料上表現(xiàn)出了多態(tài)性,占88%。我們對22條EST-SSR引物在18份枇杷種質(zhì)上擴增的條帶數(shù)進行統(tǒng)計,計算其等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、多態(tài)信息含量、期望雜合度和觀察雜合度,發(fā)現(xiàn)所有遺傳參數(shù)的結(jié)果保持一致,其中Ej76引物的等位基因數(shù)為4.000、有效等位基因數(shù)為3.429、香農(nóng)指數(shù)為1.297、多態(tài)信息量為0.654、期望雜合度為0.729,表現(xiàn)出最高的多態(tài)性；而Ej193、Ej229這兩對引物等位基因數(shù)為2.000、有效等位基因數(shù)為1.385、香農(nóng)指數(shù)為0.451、多態(tài)信息量為0.239、期望雜合度為0.286,表現(xiàn)出最低的多態(tài)性。通過建立0-1矩陣數(shù)據(jù)表計算出18份枇杷種質(zhì)的SM遺傳相似系數(shù),根據(jù)相似系數(shù)進行聚類,當SM相似系數(shù)D1=0.666時,將18份枇杷種質(zhì)分為4大類,表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。5.我們將278對引物在野生型‘洞庭紅肉’枇杷和突變型‘洞庭白肉’枇杷上進行多次驗證,Ej85和Ej94兩對引物因其在兩個材料上的差異表現(xiàn)出穩(wěn)定性好、重復性高的特點而被我們選擇進行差異EST-SSR片段克隆測序。Ej85引物在兩種枇杷上擴增的差異條帶大小為134bp,具體序列如下：TCCGTCTTCGTCGTCTTCTTTTATTTCTCTCTCTGTTCCGCCCTCCTCCTTTACACACACACACACCTCCCACCTCTCTGAACGATTGAAAGCAAAATTAATGGAGTGGGATGGTAATTCGGATCTGGGCTTTGEj94在‘洞庭紅肉’枇杷擴增的差異條帶大小為259bp,具體序列如下：ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGAGATTGACAAAGAAGGATGGAGCTTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGGTGAAGCCATTTGGCTTTAAGCTATCAAGTATCAACCGTTCTTTTTGTCAACATAACTGTGTTCGGAATTTGCTTTTCTGCAAATTTTTATGGCCTTAGGGTTTTGATGGGATTAGAGTAAAGATACGGCCGTTTGGEj94在‘洞庭白肉’枇杷擴增的差異條帶大小為221bp,具體序列如下：ATTGCTGGAGCTCGAAAGAAACGTCTTCAGAAACTGGGTTTTTCAGTGGTACAATTTGATATCGATCAGAGATTGACAAAGAAGGATGGAGCTTTTGGCTTTAAGCTATCAAGTATCAA