融合His Tag重組蛋白的基因克隆、表達(dá)及親和純化的綜述報(bào)告

融合HisTag重組蛋白的基因克隆、表達(dá)及親和純化的綜述報(bào)告重組蛋白已成為生命科學(xué)研究、藥物開發(fā)和工業(yè)應(yīng)用的重要工具。融合HisTag的重組蛋白廣泛應(yīng)用于免疫組化、酶標(biāo)測(cè)定、晶體學(xué)研究、藥物篩選等方面。本篇綜述將介紹HisTag重組蛋白的基因克隆、表達(dá)及親和純化的技術(shù)原理和方法。一、基因克隆基因克隆是制備HisTag重組蛋白不可或缺的步驟。常用的基因克隆方法有PCR擴(kuò)增、限制酶切和基因合成等。PCR擴(kuò)增是在模板DNA的基礎(chǔ)上，通過引物特異性結(jié)合目的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所需的基因片段。這種方法簡(jiǎn)單易行，擴(kuò)增效率高，適用于小片段基因的克隆。限制酶切則是在目的基因序列兩端引入合適的限制酶切位點(diǎn)，在反轉(zhuǎn)錄模板的基礎(chǔ)上采用限制酶消化和連接酶連接等流程構(gòu)建重組質(zhì)粒。這種方法可以得到完整的基因序列，擴(kuò)增長度適中，利于后續(xù)操作?；蚝铣墒切录夹g(shù)中的一種，將目的基因序列按照設(shè)計(jì)合成，可克服PCR擴(kuò)增和限制酶切不便的困境?；蚝铣傻膬?yōu)勢(shì)在于可以避免了PCR擴(kuò)增過程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤引物或反向轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的不同導(dǎo)致的克隆失敗的情況。二、表達(dá)表達(dá)是實(shí)現(xiàn)HisTag重組蛋白高效制備的關(guān)鍵步驟。表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)基因來源不同，包括哺乳類、昆蟲、真菌、細(xì)菌等多種類型。其中，細(xì)菌表達(dá)體系最為常用，主要包括大腸桿菌表達(dá)體系和其他細(xì)菌表達(dá)體系。（1）大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌表達(dá)體系是最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一。大腸桿菌能夠快速生長，維護(hù)成本低且容易操作。該系統(tǒng)一般采用pET表達(dá)載體，其中包括T7啟動(dòng)子、啟動(dòng)子上游T7啟動(dòng)子和空載體、抗性標(biāo)記等基本元件。基因的表達(dá)和過表達(dá)皆可通過不同激勵(lì)劑的作用來實(shí)現(xiàn)，其中最常用的是IPTG（異丙硫代半乳糖醛）。（2）其他細(xì)菌表達(dá)體系除大腸桿菌之外，真核生物來源的HisTag重組蛋白在其他細(xì)菌表達(dá)體系中表達(dá)的效率也較高。Biobrick是一種新穎的細(xì)菌表達(dá)體系，通過設(shè)計(jì)基因表達(dá)序列，避免了大腸桿菌表達(dá)時(shí)常見的一些問題。Biobrick表達(dá)體系在固定的表達(dá)序列中嵌入目的蛋白序列，在其上下游質(zhì)粒中加入多種啟動(dòng)子，進(jìn)一步增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá)。除了上述細(xì)菌表達(dá)外，還有酵母表達(dá)體系和豌豆球菌表達(dá)體系等。三、親和純化親和純化是純化HisTag重組蛋白的一種廣泛應(yīng)用的方法，其基本原理是通過蛋白與金屬離子配對(duì)的親和性實(shí)現(xiàn)特異性分離。其中最為常用的是Ni-NTA親和純化和Co-NTA親和純化。（1）Ni-NTA親和純化Ni-NTA親和純化利用Ni2+與His標(biāo)簽之間的親和性實(shí)現(xiàn)蛋白的選擇性結(jié)合，并通過蛋白質(zhì)電泳技術(shù)或其他方法檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)蛋白純度。使用該方法純化的HisTag重組蛋白具有高純度和高產(chǎn)量，適用于多種規(guī)模的分離和純化。（2）Co-NTA親和純化Co-NTA親和純化是一種與Ni-NTA親和純化相似的方法，區(qū)別在于采用Co2+離子替代Ni2+離子。Co-NTA親和純化優(yōu)點(diǎn)在于Co2+離子對(duì)His標(biāo)簽的親和性較強(qiáng)，其吸附能力更強(qiáng)，并且不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的活性產(chǎn)生影響。四、總結(jié)HisTag重組蛋白的基因克隆、表達(dá)和親和純化涉及到很多精細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和技術(shù)細(xì)節(jié)。經(jīng)過系