山莨菪堿抗休克作用的α7尼古丁受體和β-arrestins抗炎機(jī)制

山莨菪堿抗休克作用的α7尼古丁受體和β-arrestins抗炎機(jī)制目的:山莨菪堿是中國(guó)科學(xué)家1965年從茄科植物唐古特莨菪中提取出的生物堿,其人工合成品為654-2。山莨菪堿是托品酸和有機(jī)堿形成的酯類(lèi),結(jié)構(gòu)與阿托品和東莨菪堿相類(lèi)似,在托品基的6位炭原子上有不對(duì)稱(chēng)的羥基。山莨菪堿屬于非選擇性的毒蕈堿受體阻斷劑,能夠阻斷M1—M5受體亞型。因此,山莨菪堿有一系列相似于阿托品的藥理作用如抑制唾液分泌、抑制胃酸和汗液分泌,抑制胃腸蠕動(dòng)及膀胱收縮、散瞳、擴(kuò)張支氣管。臨床上已經(jīng)用于由平滑肌痙攣、胃、十二指腸潰瘍、膽道痙攣而引起的疼痛,類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,胃潰瘍,急性腎小球腎炎,偏頭痛,過(guò)敏性紫癜,肺炎、有機(jī)磷酸酯類(lèi)中毒的解救等多種疾病的治療。自1965年以來(lái),山莨菪堿被用于治療循環(huán)性休克,特別是感染性休克的治療取得了很好的治療效果,如北京友誼醫(yī)院兒科使用山莨菪堿治療爆發(fā)型流行性腦脊髓膜炎,使死亡率從66.9%下降到12.4%,用山莨菪堿治療中毒性細(xì)菌性痢疾,使死亡率從20-30%下降到0.5%。目前關(guān)于山莨菪堿抗休克的機(jī)制主要包括改善微循環(huán);抑制血栓形成和纖維蛋白溶解作用;穩(wěn)定溶酶體及抑制組織蛋白酶等,但是其相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制很少報(bào)道。Wang等報(bào)道乙酰膽堿與巨嗜細(xì)胞上尼古丁受體結(jié)合能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子TNFα,IL-1β,IL-6,IL-18等分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿的作用主要是通過(guò)與巨嗜細(xì)胞上的α7尼古丁受體結(jié)合,通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)傳遞,最終抑制了Jak2-STAT3和NF-κB信號(hào)的激活,從而抑制了炎癥因子的產(chǎn)生。在內(nèi)毒素休克大鼠模型中,切斷迷走神經(jīng)能夠明顯加重內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克反應(yīng),動(dòng)物對(duì)內(nèi)毒素的致死效應(yīng)更加敏感。直接刺激迷走神經(jīng)能夠降低內(nèi)毒素血癥大鼠血漿和組織中TNFα和IL-6的含量,阻止血壓的持續(xù)下降,減緩內(nèi)毒素引起的低血壓休克的發(fā)生時(shí)相。由于乙酰膽堿是迷走神經(jīng)末梢分泌的主要神經(jīng)遞質(zhì),因此,他們把這條通路命名為膽堿能抗炎通路(cholinergicanti-inflammatorypathway)。膽堿能抗炎通路是通過(guò)神經(jīng)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)程度的重要通路。山莨菪堿是非選擇性的M受體阻斷劑,因此,我們的第一個(gè)假設(shè)是:山莨菪堿通過(guò)阻斷M受體,使迷走神經(jīng)分泌的乙酰膽堿更多的與α7尼古丁受體結(jié)合激活了膽堿能抗炎通路,發(fā)揮了抗休克作用。β-arrestins是一組多功能的小分子蛋白質(zhì),它的經(jīng)典作用是參與G蛋白偶聯(lián)受體的脫敏。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),β-arrestins作為腳手架蛋白,也參與了許多非G蛋白偶聯(lián)受體激活的信號(hào)傳導(dǎo),如ERK,JNK,p38,Akt和PI3激酶信號(hào)通路等,因此β-arrestins也參與了趨化作用,凋亡作用及腫瘤轉(zhuǎn)移等過(guò)程。2006年,Nature上報(bào)道了β-arrestins可以和TRAF6結(jié)合,負(fù)向調(diào)節(jié)內(nèi)毒素休克時(shí)的信號(hào)傳導(dǎo)通——TLR-IL-1R(toll-likereceptor-interleukin-1receptor)信號(hào)通路,最終抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活化,從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生。此外,Witherow等報(bào)道了β-arrestins,特別是β-arrestin-1能夠直接與NF-κB的抑制因子IKBα結(jié)合,使得IKBα-NF-κB復(fù)合體滯留在胞漿中,從而阻止NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核而抑制其活化。Gao等研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結(jié)合,抑制IkBα的磷酸化降解,從而抑制NF-κB信號(hào)的激活及炎癥因子的表達(dá),并發(fā)現(xiàn)刺激β2腎上腺素能受體能夠加強(qiáng)β-arrestin2-IkBα復(fù)合體的穩(wěn)定,從而為交感系統(tǒng)的抗炎作用提供了理論依據(jù)。Luan等的研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin-2能夠與IkBα結(jié)合,抑制紫外線(xiàn)照射引發(fā)的NF-κB信號(hào)活化。阮等的研究發(fā)現(xiàn)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,山莨菪堿能夠抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化,山莨菪堿也能夠完全阻斷內(nèi)毒素誘導(dǎo)的NF-κB活化。因此,我們的第二個(gè)假設(shè)是:山莨菪堿增加了β-arrestins蛋白的表達(dá),β-arrestins蛋白表達(dá)增加抑制了NF-κB信號(hào)的活化,參與了與山莨菪堿的抗休克作用。方法:本研究以?xún)?nèi)毒素誘導(dǎo)的休克為模型,研究了α7尼古丁受體阻斷劑甲基牛扁堿對(duì)山莨菪堿抗休克作用的影響;在受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,利用激光共聚焦觀(guān)察了山莨菪堿對(duì)乙酰膽堿與α7尼古丁受體結(jié)合的影響;在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的RAW264.7巨嗜細(xì)胞,利用分子生物學(xué)技術(shù)研究了山莨菪堿對(duì)RAW264.7巨嗜細(xì)胞β-arrestin-1蛋白表達(dá)的影響及β-arrestin-1蛋白在山莨菪堿抗休克中的作用。結(jié)果:第一部分:山莨菪堿通過(guò)激活膽堿能抗炎通路發(fā)揮了抗休克作用1、α7尼古丁受體特異性阻斷劑甲基牛扁堿顯著地阻斷了山莨菪堿對(duì)大鼠內(nèi)毒素休克低血壓的改善作用,同時(shí)也阻斷了山莨菪堿降低內(nèi)毒素休克大鼠血清和肝臟炎性細(xì)胞因子TSFα和IL-1β水平的作用;甲基牛扁堿也能顯著地阻斷山莨菪堿改善內(nèi)毒素休克小鼠存活率的作用;在單側(cè)迷走神經(jīng)切斷的小鼠模型上,山莨菪堿的抗休克作用下降;α7尼古丁受體基因敲除的小鼠與其野生對(duì)照小鼠相比,山莨菪堿降低內(nèi)毒素休克小鼠血清中TNFα和IL-1β的作用顯著下降。這些結(jié)果說(shuō)明α7尼古丁受體參與了山莨菪堿的抗休克作用。2、受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,在RAW264.7巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿能夠通過(guò)阻斷M受體,增加乙酰膽堿與α7尼古丁受體結(jié)合的數(shù)量;以α7尼古丁受體基因敲除小鼠和其野生對(duì)照小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞為模型,發(fā)現(xiàn)在野生小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿能夠加強(qiáng)乙酰膽堿抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)TNFα分泌的作用,但是在α7尼古丁受體基因敲除小鼠的腹腔巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿則沒(méi)有此作用。第二部分:山莨菪堿通過(guò)增加β-arrestin-1蛋白的表達(dá)發(fā)揮了抗休克作用1、在培養(yǎng)的RAW264.7巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿能夠劑量和時(shí)間依賴(lài)性地上調(diào)β-arrestin-1蛋白和mRNA表達(dá);山莨菪堿的這個(gè)作用能夠被蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮和防線(xiàn)菌素D阻斷;山莨菪堿也能夠顯著的逆轉(zhuǎn)由內(nèi)毒素引起的細(xì)胞內(nèi)cAMP含量下降;用cAMP-PKA信號(hào)通路的特異性阻斷劑H-89預(yù)處理細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)山莨菪堿上調(diào)β-arrestin-1的作用被阻斷;以?xún)?nèi)毒素誘導(dǎo)的休克小鼠為模型,山莨菪堿能夠顯著增加脾臟β-arrestin-1的表達(dá)。2、在β-arrestin-1干擾的RAW264.7巨嗜細(xì)胞,山莨菪堿抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TNFα和IL-1β分泌的作用顯著下降。