分子生物學：第四章 DNA復制

第四章DNA復制

(DNAReplication)第一節(jié)基本概念第二節(jié)復制概況第三節(jié)DNA復制的酶學

第四節(jié)DNA復制的半不連續(xù)性第五節(jié)原核生物DNA復制（E.coli）

第六節(jié)真核生物DNA復制

第一節(jié)基本概念

(BasicConcept)DNA復制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP,

合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！?/p>

復制子（Replicon）；又稱復制單位或復制元AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

DNA中含有一定復制起點和復制終點的復制單位

1.3萬～90萬不等●復制體（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA復制叉處的許多酶和蛋白組成的復合體，協(xié)同動作合成DNADNA復制在細胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min第二節(jié)復制概況

(SurveysofReplication)一、DNA的半保留復制

（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl

設計的CsCl超離心試驗證實了

DNA復制的這一特性概念：復制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模

板合成其互補鏈，新生的互補鏈與母鏈構成子

代DNA分子15N標記實驗·細胞生長在15N標記培養(yǎng)基中·轉入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標記DNA未標記DNA

CsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml

二、復制起點、方式和方向1、復制起點（originori或o復制原點）復制開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單復制起點即－－整個染色體只有一個復制單位

真核生物（Eukaryote）:多復制起點即－－一個genome中有多個復制單位Replicationfork

復制叉（Replicationfork）：染色體中參與復制的活性區(qū)域，即復制正在發(fā)生的位點

2、復制方向（復制過程的順序性）

復制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA，復制的區(qū)域形如一只眼睛真核生物的多復制子多個復制眼

（1）單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉

單向復制

雙向復制（2）

復制的多模式單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向（原核）多起點、雙方向（真核）3、復制方式大多數(shù)以對稱方式進行－－即兩條鏈同時復制也有一定時期內DNA只復制一條鏈的情況

（1）θ

復制或從新起始（denovoinitiation

）或復制叉式（replicationfork

）

雙鏈環(huán)狀DNA的復制眼可以形成一種θ結構，形狀像希臘字母θ，因而叫….

AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.

單、雙向θ

復制模式圖單向復制雙向復制

（2）D環(huán)復制（Displacementform

）

又稱置換式

線粒體和葉綠體

DNA的復制方式（3）σ復制或滾環(huán)式復制（rollingcirclereplication）或共價延伸方式（covalenceelongation）

由于復制時產生的滾環(huán)結構形狀象σ，稱σ復制

病毒、細菌因子，如含有單鏈環(huán)狀DNA的φX174、G4、M13F質粒的共價整合圖不是σ復制(4)線性DNA雙鏈的復制單一起點、單向，如：腺病毒單一起點、雙向，如：T7噬菌體多個起點、雙向第三節(jié)

DNA復制的酶學

(EnzymologyofDNAReplication)

一、DNA聚合反應和聚合酶1957ArthurKornberg首次發(fā)現(xiàn)DNApolⅠ

DNApol

Ⅱ

DNApol

Ⅲ

（E.coli）

聚合反應：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP

→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH

＋

2Pi

二、三種DNA聚合酶的結構和功能

其中DNApolⅢ

全酶有十種共22個亞基β二聚體－－滑動鉗DNApolⅢ全酶的非對稱二聚體

DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能

1、DNA聚合酶活性：兩者都有條件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修復和RNA引物的替換

DNApolⅢ－－DNA鏈的延長聚合方向：5’－3’

2、3’－5’外切核酸酶活性（兩酶都具有）

校對功能(proofreading)

3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三個特點：

?必須有5’－磷酸末端?被除去的核苷酸必須是已經配對的

?被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）4、子鏈DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使鏈按5’－3’方向生長5’OHTCATCAC5’OH3’ppp

OH

C++

ppi

如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHGATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOH

G

5’

pppa、因能量的需要，

DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG

在0.2MNacl

的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端

需要其他機制以解脫

b、堿基發(fā)生錯配后的校正……費時、費能、增加加磷酸的能量消耗

ATCG

pppOH+

pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH

三、DNA連接酶（DNALigase）

所需條件：

a、

切刻的3’－OH和5’－P相鄰

b、

切刻各自堿基處于配對狀態(tài)

c、需要能量原核（ATP、NAD）

真核（ATP）

用途：復制過程中，5’端RNA引物被置換后切刻的連接修復、重組

四、與DNA幾何學性質相關的酶1、解螺旋酶（helicase）:又稱解旋酶單鏈結合蛋白（SSBsingle-strandbindingprotein2、

DNA旋轉酶：消除復制叉前進過程中產生的正超螺旋，產生負超螺旋第四節(jié)

DNA復制的半不連續(xù)性（Semi-DiscontinuousReplication）

3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘

一、DNA復制的半不連續(xù)性

事實上沒有發(fā)現(xiàn)DNA能按3‘→5’合成的證據(jù)先導鏈連續(xù)復制后隨鏈按Okazaki片段不連續(xù)復制

先導鏈（leadingstrand）：DNA復制時，與復制叉向前移動的方向一致，以3’→5’鏈為模板，按

5’→3’方向連續(xù)合成的一條鏈

后隨鏈（laggingstrand）：岡崎片段(Okazakifragment):DNA復制不連續(xù)合成鏈中形成的短DNA片段

原因－－后隨鏈的片段合成需要一個周期性的起始信號

二、引物（Primer）和引發(fā)酶（Primase）

DNApolymerase

只能使DNA從引物的3’端延伸

DNA復制如何起始？？？

RNA可能提供了DNA復制的3’端1、實驗證據(jù)：M13phage的DNA復制顯示出對轉錄抑制劑

的敏感性E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliM13+S.S.DNAvirus+RF無M13RFRifampicinM13Rifampicin有M13RF

Rifampicin

是E.coliRNApolymerase

的抑制劑

M13RF的形成需要RNApolymerase發(fā)動合成一段RNA分子作為引物（RNA提供復制的3‘端）

RF啟動后，Rifalmpin

的抑制無效結論（Conclusion）：

2、后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：

?細菌中先導鏈的合成受Rifalmpin

的抑制

?后隨鏈的合成不受Rifalmpin限制原因：

?先導鏈的起始需要RNApol的轉錄激活

?而后隨鏈的起始由引發(fā)酶合成引物，而引發(fā)酶不受Rifalmpin的抑制

DNA復制的轉錄激活

(transcriptionalactivation）：

DNA復制起始時通過RNApolymerse的轉錄過程而解開局部的雙鏈

轉錄激活時產生的RNA能否作為引物目前尚未得出普遍結論質粒ColE1的DNA復制起始引物RNA為RNA聚合酶轉錄（經過剪切）

該RNA與起始區(qū)域DNA緊密結合3.引發(fā)酶：合成RNA引物的酶。引發(fā)體：引發(fā)酶單獨存在時不具有酶活性，只有與有關的蛋白質相互結合成為一個復合體時才有活性，這種復合體….（1）

RNApol(RNApolymerase)[RifS]（2）

dnaG(primase)[RifR]

組裝成引發(fā)體

完成對后隨鏈（先導鏈）引物的合成

（3）完成引物合成后

DNApo

lII

進行DNA鏈的延伸

DNApolⅠ

Ligase

主要實現(xiàn)DNA復制的轉錄激活起始較先導鏈的啟動落后一個Okazaki片斷4、總結：復制叉如何誕生？有機體選擇RNA作為引物的可能原因

最終避免由于最初幾個核苷酸的復制錯誤導致的致死突變!!a、采用RNA引物作為過渡形式，減少發(fā)生錯誤的機會

從模板拷貝的最初幾個核苷酸對的堿基堆積力弱,氫鍵結合力也弱，因此發(fā)生錯誤的幾率大；且還沒有形成穩(wěn)定的雙鏈結構，DNA的聚合酶的3’－5’校對功能很難發(fā)揮b、RNA的過渡形式在不需要時容易被剔除

,容易被DNApol

Ш識別而停止聚合,且便于DNApol

?進行切刻平移,由于DNApol

?具有5’－3’校對功能,所以發(fā)生錯誤的幾率很小后隨鏈上所包含的事件？

三、后隨鏈的合成及前體片段的連接

引發(fā)體（包括引發(fā)酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseRNAprimedDNAreplicationRemovalofRNAprimersandfillingofgaps第五節(jié)原核生物DNA復制

(DNAreplicationinProkaryote)

一、DNA復制機構的研究

利用突變表型來考察基因的功能

但只能利用條件型突變溫度敏感突變體

材料:E.coli

或噬菌體

二、DNA復制大腸桿菌的DNA復制噬菌體?×174的復制腺病毒的復制4.線性DNA的末端復制的問題5、復制忠實性的保證（1）OriCinE.colichromosomalDNA

1、大腸桿菌的DNA復制?四個9bp的重復序列

dnaA結合位點?三個13bp的重復序列若干GATC位點（2）簡單復制過程

a、涉及主要酶系：

DnaA、RNApol是必不可少的，此外涉及到

DnaB（解旋酶）、DnaC、Hu、Gyrase、

SSB、

DnaG、Top?和DNApol

Ш全酶

b、簡單步驟：

*

轉錄激活

*DnaA

識別并結合復制起點，DnaB－DnaC六聚體與oriC

形成預引發(fā)體

*

DnaG加入形成引發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA*引物合成后，DNApol

組裝到引發(fā)的RNA上，完成復制體的組裝DnaASSB13bprepeats涉及轉錄激活一分子的DNApolIII.協(xié)同合成前導鏈和后隨鏈

（3）復制終止a、終止序列

E.coli

有兩個終止區(qū)域，分別結合專一性的終止蛋白

序列一：terE

terD

terA

序列二：terF

terB

terC

每個區(qū)域只對一個方向的復制叉起作用

b、專一性終止蛋白

E.coli

中由tusgene

編碼

（terminusutilizationsubstance）通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用每次復制時只使用一個終止位點ter（4）細菌(E.coli)DNA每個細胞周期只復制一次每個細胞周期復制一次可能受OriC甲基化的控制11copiesinOriC（5）E.coli細胞加倍時間與復制起始加倍時間37℃<20min～10h復制時間：40min左右（850核苷酸／秒）分裂過程中其它事件約需20min（組分、隔膜）因此－－加倍時間少于60min的細胞兩輪復制有共用時間

（1）Φx174phage復制起始Φx型引發(fā)體的組裝以PriA識別引發(fā)體組裝位點（primosomeassemblysitepas）開始，首先形成預引發(fā)體其中－－引發(fā)體組裝位點唯一，但引發(fā)位點是不唯一的

Φx型引發(fā)體或其部分組分可沿單鏈

DNA移動到每一個岡崎片段的起點PriA提供引發(fā)體移動的動力2、ФX174的復制

（2）

Φx174DNA的復制

a、SS→RFⅠ

Φx型引發(fā)體起始后，由DNApolⅢ、Ⅰ和連接酶等協(xié)同合成

（后隨鏈的起始過程）

b、多拷貝RF的合成

（滾環(huán)復制）

（先導鏈的合成過程、后隨鏈合成）

c、后代單鏈（SS）DNA的合成（DNA復制過程是上一過程的一部分先導鏈）

A蛋白（gpA）：

?

Φx174基因A的產物

?結合到RFⅠDNA的復制原點的結合位點（引發(fā)體的幫助）

?誘導相鄰的識別位點的熔解(負超螺旋、富含A/T)

?其核酸內切酶活力切割（＋）鏈的4305與4306堿基的酯鍵，并共價連接于5’端（A），另一端為自由的

3’－OH（G）

Rep蛋白－－解旋酶

SS→RFⅠ單鏈（+）DNA的合成

3、腺病毒（Adnovirus-2）DNA的復制

IR:包括50bp的復制原點、富含A/T、有一個高度保守的G／C對pTP:末端蛋白的前體

80kd

→TP55kdSSB:單鏈DNA結合蛋白

72kd

Ad2DNApolymerase;140kd

TP:可以共價結合到5’末端上的末端蛋白

腺病毒DNA復制起始G復制起始復合體引發(fā)復制（不需引物）

避免5’-endshortent

pTP-Ser-dCMP

CG●過程

SSB+ATPDNA末端解鏈

TP

pTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OHIRIR長的發(fā)夾結構

4、線性DNA的末端復制的問題（1）線狀DNA的復制5’末端短縮的解決模式

a、從開始就采取環(huán)化的形式

－－－λ噬菌體

b、象T7噬菌體一樣采取連環(huán)分子的形式

利用自身線性DNA末端的重復序列－－通過末端互補形成連環(huán)分子

c、最直接的辦法－－－引入蛋白質直接從末端起始復制

如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰質炎病毒

d、痘病病毒的末端由發(fā)夾結構連接

復制完成后錯切連接a.環(huán)化??二聚體3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHb.T7噬菌體的末端復制專一性核酸內切酶痘病毒d.末端形成發(fā)夾復制從內部起始點開始復制使發(fā)夾結構轉變成雙鏈分子內部交錯切割分子重排末端回折痘病毒

5、復制忠實性的保證

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、堿基配對協(xié)同性導致最初幾個堿基錯配率高，且不易校正

b、RNA引物最終被降解而避免錯誤

3、后隨鏈的不連續(xù)合成

因其有利于錯配堿基的校正

3.6.真核生物DNA的復制(DNAreplicationinEukaryote)

1、復制概況

a、多個復制元（multiplereplicon

），雙向復制

b、復制元相對較小(13-900kb),

復制速度較慢,大約

500~5000bp/min

（3000bp/min）岡崎片段100～200NTc、復制終止通過復制叉的相遇而終止multiplereplicon

例；果蠅3500replicons

平均40Kb

酵母500replicons

哺乳動物平均100Kb

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五種

位置

核內核內核內核內

線粒體

合成

與引發(fā)

修復合成合成,修復復制功能酶結合前導鏈

后隨鏈3’－5’校NONOYesYes

Yes正活性

α

β

δ

ε

γ

3.真核生物DNA復制的引發(fā)酶

●DNApolα+primase形成緊密的復合物

6-9NtRNAasprimer

●引發(fā)酶（primase）：50-60kd

●作用方式為陣發(fā)性的，每次作用拷貝6～15個核苷酸

●既能利用NTP，又能利用dNTP

●SV40體外DNA復制情況分析

ε

δ

4、真核生物的復制起始受許可因子的控制

5、真核生物染色體DNA末端補齊模式

(1)端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含

G鏈)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(富含C鏈)

（2）端粒酶（

Telomerase）1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling

四膜蟲端粒酶（telomerase）將T2G4

末端重復延伸

Telomerase

=RNACAAAACCCC

鏈+

末端結合蛋白（TBP）端粒酶－－－逆轉錄酶a、核蛋白（ribonucleoproteinRNP）b、含約長150NT的RNA，其中含1～5拷貝的CxAy重復序列，是合成端粒T2G4的模板c、延長的3’-T2G4端（一段cDNA）作為5’-端DNA合成的模板（3）補齊過程

通過TG鏈的回折形成發(fā)夾結構（G·G氫鍵）－－－尺蠖模型

→→實現(xiàn)端粒酶位置的調整GGhoogsteen

氫鍵

G鏈–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----G鏈–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC鏈--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorG鏈–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----實驗表明－－人體細胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復數(shù)而計數(shù)細胞分裂次數(shù)，當端粒長度下降到某一臨界值時，細胞終止分裂－－－衰老、死亡“多莉”的衰老

研究端粒丟失的速率，預測人類的壽命

＞XXXYwhy?研究推測端粒酶與腫瘤的關系

6、真核生物復制過程中的核小體結構

（1）組蛋白的合成在細胞核中與DNA復制同步進行（2）且組蛋白H3、H4的四聚體在DNA復制時隨機分配給某一子DNA鏈（3）H2A,H2B解離參與競爭，從新組裝

（4）組蛋白修飾，調控基因表達a、復制子的大?。⊿izesofreplicon）:Yeastorfly 平均40kbMammals 平均100kbProkaryoticDNA: >1000kbb、岡崎片段(Okazakifragments):ProkaryoticDNA: 1000-2000ntEukaryoticDNA: 100-200ntc、復制速度（Rateofreplication）:EukaryoticDNA: ca.3,000bp/min(50/sec)ProkaryoticDNA: 50,000bp/min(900/sec)原核生物和真核生物DNA復制的比較1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,Ssb4.RNApriming5.校正閱讀（Proofreading）1.復制起點（單、多）2.復制子（大小、多少）3.復制起始的許可因子的控制（復制周期的重疊與否）4.復制叉移動的速度(900/50nt/S)5.岡崎片段的大小6.端粒和端粒酶7.DNA聚合酶Polymerases相同點：不同點：名詞解釋復制復制體半保留復制崗崎片段復制單位θ復制先導鏈后隨鏈DNA復制的轉錄激活DNA復制的半不連續(xù)性簡答題1、圖示說明DNA半保留復制的機制證明。2、DNA復制方向為5’→3’，請說明復制為什么不能從3’→5’。3、為什么崗崎證明DNA半不連續(xù)性復制的實驗中出現(xiàn)兩條鏈都是不連續(xù)的假象。4、DNA復制為何選擇RNA作為引物？5、復制叉誕生的過程如何，后隨鏈上都包含哪些事件（涉及的酶的情況）6、E.coli的DNA復制終止機制7、原核生物線性DNA復制5’末端短縮的解決辦法有哪幾種。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端復制過程中的作用機制9、真核生物DNA復制過程中核小體復制和保留機制。10、保證復制忠實性的主要機制11、真核與原核復制起始調控的差別12、真核與原核復制的比較內容回顧1：1、基本概念

DNA復制復制子復制體復制時期2、半保留復制3、復制起點結構特征復制方向：復制叉復制眼單雙向復制的決定條件復制的多模式復制方式：復制叉式（從頭起始）