利用密度感應抑制技術控制水產養(yǎng)殖細菌性病害的基礎研究

利用密度感應抑制技術控制水產養(yǎng)殖細菌性病害的基礎研究水產養(yǎng)殖業(yè)是全球食物生產增長最快的系統(tǒng)之一，但是病害頻發(fā)阻礙了其進一步健康地發(fā)展。目前，抗生素是公認的治療細菌性疾病的有效方法?？股氐臑E用使藥物殘留問題嚴重，并進一步加快了細菌抗藥性的出現(xiàn)。密度感應（quorumsensing,QS）是微生物之間的一種交流機制，用于調控基因的表達以及協(xié)調微生物的群體性行為，如生物被膜的形成、生物發(fā)光和毒力因子的分泌等。研究發(fā)現(xiàn)在多種致病菌中，致病因子的分泌和QS密切相關?？股氐臑E用使得細菌抗藥性問題越來越嚴重。由于QS不是微生物生存所必需的，因此淬滅致病菌的密度感應系統(tǒng)（quorumquenching,QQ）可以在不殺死細菌的情況下大大地降低其毒力因子的表達，同時降低環(huán)境中的選擇壓力和出現(xiàn)細菌抗藥性的幾率，因此密度感應淬滅技術是一種極具開發(fā)前景的細菌性病害的控制手段。相關研究表明海洋中蘊含著豐富的QQ酶資源，而目前發(fā)現(xiàn)的QQ活性物質特別是QQ酶主要來源于陸地微生物。本論文建立了一種高通量的QQ菌株篩選方法，從牙鲆體內及養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選土著QQ菌株，對具有強QQ活性的耐油具柄菌（Muricaudaolearia）Th120的QQ活性物質進行了鑒定，并完成了該菌株的全基因組測序及分析。本論文研究結果可為發(fā)展以密度感應淬滅技術為基礎的、健康可持續(xù)發(fā)展的水產養(yǎng)殖細菌性疾病的預防和控制手段提供理論基礎。為了能從數(shù)量龐大的海洋微生物中快速鑒定QQ細菌，本論文建立了一種簡單快速的QQ菌株高通量篩選方法。該方法采用的AHL報告菌根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）對AHL分子具有高靈敏度的檢測能力，為達到高通量篩選的目的，在檢測方法上主要有兩個關鍵步驟：一方面通過標準化檢測吸光度值，消除報告菌細胞的影響，從而大大提高了檢測的準確度并實現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性的定量檢測；另一方面通過使用緩沖液PIPES，有效地排除了因pH值過高而導致的假陽性QQ菌株。該方法能同時對大批量的待測菌株進行高效地篩選。利用該方法從分離自健康牙鲆腸道、鰓、粘液以及養(yǎng)殖環(huán)境的366株土著菌中篩選到了25株QQ細菌。這些QQ細菌分別屬于黃桿菌綱、α變形菌綱以及γ變形菌綱的14個種，其中12個種的細菌其AHL降解活性為首次報道。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些QQ細菌的AHL降解特性各不相同，部分菌株的AHL降解活性被證明是內酯酶活性。具強QQ活性的海黏奧雷氏菌（Olleyamarilimosa）T168、居珊瑚假交替單胞菌（Pseudoalteromonasprydzensis）Th125以及耐油具柄菌（M.olearia）Th120能夠提高斑馬魚抗嗜水氣單胞菌侵染的能力，表明其具有進一步開發(fā)為水產養(yǎng)殖有益菌的潛力。對強QQ活性菌株耐油具柄菌Th120的進一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌株可能同時具有QQ酶和QS小分子阻抑物。利用膠內QQ活性檢測、蛋白質譜檢測以及全基因組測序技術發(fā)現(xiàn)菌株Th120的5個蛋白具AHL降解活性。包括一個AHL內酯酶及一個AHL酰基轉移酶，分別將其命名為MomL（Muricaudaoleariamarinelactonase）和MomA（M.oleariamarineacylase）。在已鑒定的AHL內酯酶中，MomL與AiiA的氨基酸序列相似度最高（一致性為28.85%）。MomL具有信號肽序列，是目前金屬-β-內酰胺酶家族中唯一一個分泌到胞外的AHL內酯酶。MomL具有高效的AHL降解活性，對C6-HSL的降解效率是AiiA的10倍左右，能降解不同碳鏈長度（C4-C14）的AHL分子，對長鏈以及3號碳位帶羰基的AHL分子具有更高的降解效率。MomL的最適反應溫度為40°C，經60°C處理30min后，保留32%的活性。MomL是一種金屬蛋白，對Mg2+的親和性高，但是不易結合Co2+，推測Be2+可促進其AHL降解活性，而AiiA的結合金屬主要是Zn2+。定點突變研究發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基位點His117，His119，Asp121，His122，His189和His214對其AHL降解活性是必需的。BLAST檢索發(fā)現(xiàn)MomL的同源蛋白主要分布于海洋黃桿菌科細菌中，因此MomL的分泌特性、AHL降解機制以及活性位點等結果均表明其代表一類新型海洋AHL內酯酶。重組MomL能夠有效抑制銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）胞外蛋白酶的分泌以及綠膿菌素的產生，表明其具有進一步開發(fā)應用的潛力。采用Illumina高通量測序技術對Th120的全基因組進行了測序及分析，經RAST服務器分析后共得到17條contigs和11條scaffolds序列，測得的基因組大小為3.94Mbp，G+C含量為43.86%。共預測到3730個基因。通過COG，KEGG等數(shù)據(jù)庫對菌株Th120基因組的注釋分析發(fā)現(xiàn)，相比于其他代表性的海洋黃桿菌科細菌，菌株Th120中參與糖類轉運與代謝、轉錄、信號轉導、無機離子的轉運和代謝以及防御機制等生物過程的基因比例較高。其中鐵元素代謝相關的基因尤其豐富，Th120含有22個鐵運輸相關的基因，其中5個為鐵載體受體蛋白編碼基因。菌株Th120中主要由SufABCDSE組成的SUF系統(tǒng)來合成Fe-S簇，而MomL的編碼基因處于suf操縱子之內；由于MomL的活性受Fe2+的抑制作用，因此推測MomL可能參與調控Fe-S簇的合成。此外，通過本地BLAST檢索預測到一個N-酰基氨基酸水解酶，可能具有降解N-?；呓z氨酸（MomL降解AHL的產物）的活性。本論文篩選到的QQ細菌中，海黏奧雷氏菌T168、鰨魚附著桿菌（Tenacibaculumsoleae）T133和異色附著桿菌（T.discolor）T84都屬于黃桿菌科細菌，其中菌株T168和T133的AHL降解活性被證明為內酯酶活性，但是這三種細菌的QQ酶編碼基因還未得到鑒定。以AHL降解酶MomL和MomA的氨基酸序列為基礎，結合NCBI數(shù)據(jù)庫中的附著桿菌屬以及奧雷氏菌屬的細菌的全基因組序列，預測發(fā)現(xiàn)海黏奧雷氏菌、鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌可能都具有MomL的同源蛋白，而鰨魚附著桿菌和異色附著桿菌同時具有MomA的同源蛋白。綜上所述，本論文建立了一種QQ菌株的高通量篩選方法，用這種方法篩選到25株共14個種的QQ細菌，其中12種細菌的QQ活性為首次報道。耐油具柄菌Th120有5個蛋白具有AHL降