幾丁糖膠液復(fù)合物對(duì)腹腔粘連模型大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

幾丁糖膠液復(fù)合物對(duì)腹腔粘連模型大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究腹腔粘連是腹部手術(shù)后的常見(jiàn)臨床難題,術(shù)后發(fā)病率極高,并且伴有多種并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的身體及心理健康。目前在臨床外科手術(shù)中應(yīng)用的抗粘連藥物種類(lèi)繁多,大部分藥物僅可以在一定程度上減輕粘連的嚴(yán)重程度,卻無(wú)法做到根本性地防止粘連的發(fā)生,應(yīng)用效果較為有限。因此,術(shù)后抗粘連藥物的優(yōu)化和創(chuàng)新是改變腹腔粘連現(xiàn)狀的必要途徑。防治術(shù)后腹腔粘連的方法主要分為藥物防治和屏障防治兩大類(lèi),二者各具有優(yōu)缺點(diǎn)。藥物防治主要是從提高腹腔纖溶活性、降低組織炎癥反應(yīng)、加速細(xì)胞外基質(zhì)及膠原蛋白纖維的降解角度出發(fā)發(fā)揮預(yù)防腹腔粘連的作用。其缺點(diǎn)是大部分抗粘連藥物均為液體材料,成膜性較差,導(dǎo)致其在創(chuàng)面受損部位滯留時(shí)間短,并且單組份藥物的使用只能從單一方面發(fā)揮作用,無(wú)法做到多效保護(hù)。而屏障防治的優(yōu)點(diǎn)在于可以阻隔受損部位與腹腔其他器官直接接觸,為受損腹膜提供良好的修復(fù)環(huán)境,延長(zhǎng)間皮細(xì)胞自我修復(fù)時(shí)間。其缺點(diǎn)是固體屏障類(lèi)材料在手術(shù)過(guò)程中使用不便,且機(jī)體會(huì)發(fā)生異物反應(yīng),導(dǎo)致術(shù)后腹腔感染。由于腹腔粘連的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜涉及多種因素,僅使用藥物治療或屏障治療都很難達(dá)到預(yù)期效果,若將藥物聯(lián)合使用將會(huì)在很大程度上改變腹腔粘連的發(fā)生程度。目前,多糖類(lèi)藥物在抗炎、抗纖維化疾病、抗氧化及抗凝血等方面的作用已逐漸被學(xué)者們關(guān)注。幾丁糖作為外科預(yù)防粘連發(fā)生的常用多糖類(lèi)藥物已在臨床中廣泛使用。幾丁糖無(wú)毒、無(wú)刺激性,不會(huì)引起機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng),是一種良好的生物材料,可被生物體高度吸收和降解。幾丁糖的優(yōu)勢(shì)在于具有促進(jìn)血液凝固、抗菌、加速上皮細(xì)胞增殖、提高組織纖溶活性等特點(diǎn)。但幾丁糖的缺陷是其急性止血作用不理想,無(wú)法做到快速且有效地止血。海藻多糖作為一種常用的醫(yī)用敷料具有很好的止血作用,并且具有免疫調(diào)節(jié)功能。最為重要的是,海藻多糖成膜性好,海藻中的活性物質(zhì)可以與皮膚蛋白結(jié)合生成生物膜,是很好的隔離屏障材料。但其對(duì)受損組織的修復(fù)功能較弱,遠(yuǎn)不如幾丁糖對(duì)機(jī)體的生理性修復(fù)功能。多聚合纖維素作為術(shù)后防粘連材料不僅具有止血作用,還具有提高纖溶活性、促進(jìn)纖維蛋白溶解的作用。幾丁糖、多聚合纖維素和海藻多糖各有優(yōu)勢(shì),缺陷互補(bǔ),三者的聯(lián)合應(yīng)用既起到了藥物防治粘連的作用,又可以作為屏障材料在受損部位成膜,延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間,為機(jī)體提供良好的修復(fù)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)藥中幾丁糖含量最多,且對(duì)術(shù)后腹腔粘連的保護(hù)起到主要作用,因此,將該材料命名為幾丁糖膠液復(fù)合物(ChitosangelliquidComplex,CGLC),其具有一定黏性,保證藥物發(fā)揮作用的同時(shí),起到了屏障防治的作用。研究目的:通過(guò)建立大鼠腹腔粘連模型,探討CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連的保護(hù)作用并對(duì)其預(yù)防機(jī)制進(jìn)行研究。研究方法:將90只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為9組,每組10只。分別為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、幾丁糖溶液組、多聚合纖維素組、羧甲基殼聚糖組、CGLC低劑量組、CGLC中劑量組、CGLC高劑量組。除正常對(duì)照組和假手術(shù)外,其余各組利用手術(shù)刀片反復(fù)輕微刮擦盲腸末端及對(duì)應(yīng)腹壁處至出現(xiàn)滲血點(diǎn),并暴露大鼠盲腸于空氣中使其充分干燥,通過(guò)此方法建立大鼠術(shù)后腹腔粘連模型。其中假手術(shù)組僅開(kāi)腹后縫合,不進(jìn)行造模。其余各組關(guān)腹前將藥物滴加在各組大鼠受損盲腸表面及腹壁創(chuàng)面處。術(shù)后第14天開(kāi)腹觀察各組粘連形成情況,根據(jù)Nair、Zuhlke兩種粘連評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將粘連進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)。取盲腸創(chuàng)面組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè),通過(guò)HE染色觀察盲腸組織的損傷程度、成纖維細(xì)胞的增殖情況;通過(guò)Masson和天狼星紅染色觀察盲腸組織中膠原蛋白的沉積情況。利用ELISA、QPCR、免疫組化等方法觀察CGLC對(duì)受損盲腸組織中致纖維化因子TGF-β1的表達(dá)調(diào)控作用。利用ELISA、QPCR方法檢測(cè)大鼠血清中及受損盲腸組織中tPA、PAI-1表達(dá)量以及炎癥相關(guān)因子IL-6、TNF-α的表達(dá)。利用WesternBlot方法,檢測(cè)各組大鼠受損盲腸組織中纖維組織特異性蛋白ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的表達(dá)水平以及MAPK炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白(TAK1/p-TAK1、JNK/p-JNK、P38/p-P38)的表達(dá)情況。采用超氧化物歧化酶試劑盒和丙二醛試劑盒利用分光光度法檢測(cè)CGLC對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)因子SOD和MDA的作用。研究結(jié)果:1.CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連的保護(hù)作用。根據(jù)Nair和Zuhlke粘連分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),在術(shù)后第14天觀察大鼠腹腔內(nèi)粘連形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CGLC可以顯著降低大鼠腹腔粘連程度及粘連發(fā)生率。HE染色結(jié)果顯示,CGLC各劑量組盲腸壁結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn),腸壁外粘連組織少而薄,漿膜層結(jié)構(gòu)基本修復(fù),炎癥細(xì)胞及成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少,膠原沉積程度顯著下降。Masson染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示,CGLC各組盲腸結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn),漿膜層外膠原沉積程度顯著降低,其中CGLC中、高劑量組中漿膜層幾乎無(wú)膠原蛋白沉積。2.CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連模型中纖溶系統(tǒng)活性的影響。與正常對(duì)照組相比,模型組中受損盲腸組織及血清中的TGF-β1表達(dá)量均顯著升高(P<0.01);與模型組相比,CGLC各劑量組均可以明顯下調(diào)TGF-β1表達(dá)水平;與三組陽(yáng)性藥比較發(fā)現(xiàn),CGLC各劑量組中TGF-β1表達(dá)量顯著降低(P<0.05);CGLC各劑量組之間未出現(xiàn)顯著性差異,但呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系趨勢(shì)。在免疫組化結(jié)果中可以更直觀地發(fā)現(xiàn),與模型組相比,CGLC各組的TGF-β1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,CGLC各劑量組均可以顯著提高大鼠血清及受損盲腸組中tPA表達(dá)量,同時(shí)降低PAI-1表達(dá)水平(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各劑量組中tPA表達(dá)量升高,PAI-1含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,CGLC各劑量組ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的蛋白含量顯著降低(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維溶液組和羧甲基殼聚糖組相比CGLC中、高劑量組ICAM-1、Fibrinogen的蛋白含量顯著降低(P<0.05),CGLC三組α-SMA蛋白含量顯著降低(P<0.05)。3.CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響及機(jī)制研究。與模型組相比,CGLC各劑量組中的炎癥因子(IL-6、TNF-α)在大鼠血清中和盲腸組織中含量均顯著降低(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各劑量組中的炎癥因子(IL-6、TNF-α)含量顯著降低(P<0.05)。WesternBlot結(jié)果顯示:與模型組相比,CGLC可以顯著降低磷酸化TAK1、磷酸化JNK、磷酸化P38的表達(dá),抑制MAPK信號(hào)通路的激活。4.CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔內(nèi)組織損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。與模型組相比,CGLC各組中抗氧化酶SOD酶活性顯著升高(P<0.05),與多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各組SOD酶活性顯著升高(P<0.05)。同時(shí),與模型組相比,CGLC各組中MDA含量顯著降低(P<0.05),CGLC各劑量組之間未出現(xiàn)顯著性差異,但具有良好的量效關(guān)系趨勢(shì)。結(jié)論:1.CGLC可以減輕大鼠術(shù)后粘連形成程度,降低粘連發(fā)生率。改善粘連部位的病理?yè)p傷,對(duì)于術(shù)后腹腔粘連的形成具有良好的預(yù)防效果。2.CGLC可以抑制纖維化重要介質(zhì)TGF-β1的表達(dá),并且可以通過(guò)提高纖溶酶原激活劑tPA表達(dá)水平,抑制纖溶酶原激活劑抑制劑PAI-1的表達(dá),提高大鼠術(shù)后纖溶活性,減輕腹腔纖維化程度。CGLC可以降低成纖維細(xì)胞表面特異性蛋白(ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen)的表達(dá)水平,抑制成纖維細(xì)胞的增殖,從而達(dá)到預(yù)防腹腔粘連的作用。3.CGLC通過(guò)降低術(shù)后腹腔內(nèi)炎癥因子的表達(dá)水平,下調(diào)控MAPK炎癥通路的表達(dá),從而抑制腹腔內(nèi)的炎癥反應(yīng)。4.CGLC可以提高抗氧化酶活性,清除機(jī)體過(guò)多的自由基及過(guò)氧化物,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),防止機(jī)體因氧化損傷導(dǎo)致的生理性病變?？偨Y(jié):本研究首先證實(shí)了CGLC對(duì)大鼠術(shù)后腹腔粘連的形成具有保護(hù)作用。減輕術(shù)后粘連形成程度的同時(shí),降低了大鼠術(shù)后腹腔粘連發(fā)生率。CGLC可以有效地保護(hù)大鼠術(shù)后受損盲腸的過(guò)度損傷,并且通過(guò)降低成纖維細(xì)胞的增殖及膠原蛋白在盲腸漿膜層的聚集,發(fā)揮其預(yù)防腹腔粘連的作用效果。隨后,我們對(duì)CGLC發(fā)揮防粘連作用的機(jī)制進(jìn)行探討,明確了CGLC可以顯著抑制纖維化重要因子TGF-β1的表達(dá),降低了腹腔內(nèi)纖維化程度。另外,我們通過(guò)觀察纖溶系統(tǒng)相關(guān)因子tPA和PAI-1的表達(dá)水平,證實(shí)了CGLC可以激活纖溶酶原激活劑對(duì)纖維蛋白的溶解作用,并且CGLC可以有效地降低成纖維細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平,抑制成纖維細(xì)胞的增殖。另一方面,由于腹腔