幾丁糖膠液復(fù)合物對腹腔粘連模型大鼠的保護作用及其機制研究

幾丁糖膠液復(fù)合物對腹腔粘連模型大鼠的保護作用及其機制研究腹腔粘連是腹部手術(shù)后的常見臨床難題,術(shù)后發(fā)病率極高,并且伴有多種并發(fā)癥,嚴重影響患者的身體及心理健康。目前在臨床外科手術(shù)中應(yīng)用的抗粘連藥物種類繁多,大部分藥物僅可以在一定程度上減輕粘連的嚴重程度,卻無法做到根本性地防止粘連的發(fā)生,應(yīng)用效果較為有限。因此,術(shù)后抗粘連藥物的優(yōu)化和創(chuàng)新是改變腹腔粘連現(xiàn)狀的必要途徑。防治術(shù)后腹腔粘連的方法主要分為藥物防治和屏障防治兩大類,二者各具有優(yōu)缺點。藥物防治主要是從提高腹腔纖溶活性、降低組織炎癥反應(yīng)、加速細胞外基質(zhì)及膠原蛋白纖維的降解角度出發(fā)發(fā)揮預(yù)防腹腔粘連的作用。其缺點是大部分抗粘連藥物均為液體材料,成膜性較差,導致其在創(chuàng)面受損部位滯留時間短,并且單組份藥物的使用只能從單一方面發(fā)揮作用,無法做到多效保護。而屏障防治的優(yōu)點在于可以阻隔受損部位與腹腔其他器官直接接觸,為受損腹膜提供良好的修復(fù)環(huán)境,延長間皮細胞自我修復(fù)時間。其缺點是固體屏障類材料在手術(shù)過程中使用不便,且機體會發(fā)生異物反應(yīng),導致術(shù)后腹腔感染。由于腹腔粘連的發(fā)生機制較為復(fù)雜涉及多種因素,僅使用藥物治療或屏障治療都很難達到預(yù)期效果,若將藥物聯(lián)合使用將會在很大程度上改變腹腔粘連的發(fā)生程度。目前,多糖類藥物在抗炎、抗纖維化疾病、抗氧化及抗凝血等方面的作用已逐漸被學者們關(guān)注。幾丁糖作為外科預(yù)防粘連發(fā)生的常用多糖類藥物已在臨床中廣泛使用。幾丁糖無毒、無刺激性,不會引起機體發(fā)生免疫反應(yīng),是一種良好的生物材料,可被生物體高度吸收和降解。幾丁糖的優(yōu)勢在于具有促進血液凝固、抗菌、加速上皮細胞增殖、提高組織纖溶活性等特點。但幾丁糖的缺陷是其急性止血作用不理想,無法做到快速且有效地止血。海藻多糖作為一種常用的醫(yī)用敷料具有很好的止血作用,并且具有免疫調(diào)節(jié)功能。最為重要的是,海藻多糖成膜性好,海藻中的活性物質(zhì)可以與皮膚蛋白結(jié)合生成生物膜,是很好的隔離屏障材料。但其對受損組織的修復(fù)功能較弱,遠不如幾丁糖對機體的生理性修復(fù)功能。多聚合纖維素作為術(shù)后防粘連材料不僅具有止血作用,還具有提高纖溶活性、促進纖維蛋白溶解的作用。幾丁糖、多聚合纖維素和海藻多糖各有優(yōu)勢,缺陷互補,三者的聯(lián)合應(yīng)用既起到了藥物防治粘連的作用,又可以作為屏障材料在受損部位成膜,延長藥物作用時間,為機體提供良好的修復(fù)環(huán)境。本實驗藥中幾丁糖含量最多,且對術(shù)后腹腔粘連的保護起到主要作用,因此,將該材料命名為幾丁糖膠液復(fù)合物(ChitosangelliquidComplex,CGLC),其具有一定黏性,保證藥物發(fā)揮作用的同時,起到了屏障防治的作用。研究目的:通過建立大鼠腹腔粘連模型,探討CGLC對大鼠術(shù)后腹腔粘連的保護作用并對其預(yù)防機制進行研究。研究方法:將90只Wistar雄性大鼠隨機分為9組,每組10只。分別為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、幾丁糖溶液組、多聚合纖維素組、羧甲基殼聚糖組、CGLC低劑量組、CGLC中劑量組、CGLC高劑量組。除正常對照組和假手術(shù)外,其余各組利用手術(shù)刀片反復(fù)輕微刮擦盲腸末端及對應(yīng)腹壁處至出現(xiàn)滲血點,并暴露大鼠盲腸于空氣中使其充分干燥,通過此方法建立大鼠術(shù)后腹腔粘連模型。其中假手術(shù)組僅開腹后縫合,不進行造模。其余各組關(guān)腹前將藥物滴加在各組大鼠受損盲腸表面及腹壁創(chuàng)面處。術(shù)后第14天開腹觀察各組粘連形成情況,根據(jù)Nair、Zuhlke兩種粘連評價標準將粘連進行分級評價。取盲腸創(chuàng)面組織進行病理學檢測,通過HE染色觀察盲腸組織的損傷程度、成纖維細胞的增殖情況;通過Masson和天狼星紅染色觀察盲腸組織中膠原蛋白的沉積情況。利用ELISA、QPCR、免疫組化等方法觀察CGLC對受損盲腸組織中致纖維化因子TGF-β1的表達調(diào)控作用。利用ELISA、QPCR方法檢測大鼠血清中及受損盲腸組織中tPA、PAI-1表達量以及炎癥相關(guān)因子IL-6、TNF-α的表達。利用WesternBlot方法,檢測各組大鼠受損盲腸組織中纖維組織特異性蛋白ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的表達水平以及MAPK炎癥信號通路相關(guān)蛋白(TAK1/p-TAK1、JNK/p-JNK、P38/p-P38)的表達情況。采用超氧化物歧化酶試劑盒和丙二醛試劑盒利用分光光度法檢測CGLC對氧化應(yīng)激相關(guān)因子SOD和MDA的作用。研究結(jié)果:1.CGLC對大鼠術(shù)后腹腔粘連的保護作用。根據(jù)Nair和Zuhlke粘連分級評價標準,在術(shù)后第14天觀察大鼠腹腔內(nèi)粘連形成情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CGLC可以顯著降低大鼠腹腔粘連程度及粘連發(fā)生率。HE染色結(jié)果顯示,CGLC各劑量組盲腸壁結(jié)構(gòu)清晰可見,腸壁外粘連組織少而薄,漿膜層結(jié)構(gòu)基本修復(fù),炎癥細胞及成纖維細胞數(shù)量顯著減少,膠原沉積程度顯著下降。Masson染色和天狼星紅染色結(jié)果顯示,CGLC各組盲腸結(jié)構(gòu)清晰可見,漿膜層外膠原沉積程度顯著降低,其中CGLC中、高劑量組中漿膜層幾乎無膠原蛋白沉積。2.CGLC對大鼠術(shù)后腹腔粘連模型中纖溶系統(tǒng)活性的影響。與正常對照組相比,模型組中受損盲腸組織及血清中的TGF-β1表達量均顯著升高(P<0.01);與模型組相比,CGLC各劑量組均可以明顯下調(diào)TGF-β1表達水平;與三組陽性藥比較發(fā)現(xiàn),CGLC各劑量組中TGF-β1表達量顯著降低(P<0.05);CGLC各劑量組之間未出現(xiàn)顯著性差異,但呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系趨勢。在免疫組化結(jié)果中可以更直觀地發(fā)現(xiàn),與模型組相比,CGLC各組的TGF-β1的表達水平顯著降低(P<0.01)。與模型組相比,CGLC各劑量組均可以顯著提高大鼠血清及受損盲腸組中tPA表達量,同時降低PAI-1表達水平(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各劑量組中tPA表達量升高,PAI-1含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,CGLC各劑量組ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen的蛋白含量顯著降低(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維溶液組和羧甲基殼聚糖組相比CGLC中、高劑量組ICAM-1、Fibrinogen的蛋白含量顯著降低(P<0.05),CGLC三組α-SMA蛋白含量顯著降低(P<0.05)。3.CGLC對大鼠術(shù)后腹腔內(nèi)炎癥反應(yīng)的影響及機制研究。與模型組相比,CGLC各劑量組中的炎癥因子(IL-6、TNF-α)在大鼠血清中和盲腸組織中含量均顯著降低(P<0.01);與幾丁糖溶液組、多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各劑量組中的炎癥因子(IL-6、TNF-α)含量顯著降低(P<0.05)。WesternBlot結(jié)果顯示:與模型組相比,CGLC可以顯著降低磷酸化TAK1、磷酸化JNK、磷酸化P38的表達,抑制MAPK信號通路的激活。4.CGLC對大鼠術(shù)后腹腔內(nèi)組織損傷引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。與模型組相比,CGLC各組中抗氧化酶SOD酶活性顯著升高(P<0.05),與多聚合纖維素溶液組和羧甲基殼聚糖組相比,CGLC各組SOD酶活性顯著升高(P<0.05)。同時,與模型組相比,CGLC各組中MDA含量顯著降低(P<0.05),CGLC各劑量組之間未出現(xiàn)顯著性差異,但具有良好的量效關(guān)系趨勢。結(jié)論:1.CGLC可以減輕大鼠術(shù)后粘連形成程度,降低粘連發(fā)生率。改善粘連部位的病理損傷,對于術(shù)后腹腔粘連的形成具有良好的預(yù)防效果。2.CGLC可以抑制纖維化重要介質(zhì)TGF-β1的表達,并且可以通過提高纖溶酶原激活劑tPA表達水平,抑制纖溶酶原激活劑抑制劑PAI-1的表達,提高大鼠術(shù)后纖溶活性,減輕腹腔纖維化程度。CGLC可以降低成纖維細胞表面特異性蛋白(ICAM-1、α-SMA、Fibrinogen)的表達水平,抑制成纖維細胞的增殖,從而達到預(yù)防腹腔粘連的作用。3.CGLC通過降低術(shù)后腹腔內(nèi)炎癥因子的表達水平,下調(diào)控MAPK炎癥通路的表達,從而抑制腹腔內(nèi)的炎癥反應(yīng)。4.CGLC可以提高抗氧化酶活性,清除機體過多的自由基及過氧化物,降低氧化應(yīng)激反應(yīng),防止機體因氧化損傷導致的生理性病變。總結(jié):本研究首先證實了CGLC對大鼠術(shù)后腹腔粘連的形成具有保護作用。減輕術(shù)后粘連形成程度的同時,降低了大鼠術(shù)后腹腔粘連發(fā)生率。CGLC可以有效地保護大鼠術(shù)后受損盲腸的過度損傷,并且通過降低成纖維細胞的增殖及膠原蛋白在盲腸漿膜層的聚集,發(fā)揮其預(yù)防腹腔粘連的作用效果。隨后,我們對CGLC發(fā)揮防粘連作用的機制進行探討,明確了CGLC可以顯著抑制纖維化重要因子TGF-β1的表達,降低了腹腔內(nèi)纖維化程度。另外,我們通過觀察纖溶系統(tǒng)相關(guān)因子tPA和PAI-1的表達水平,證實了CGLC可以激活纖溶酶原激活劑對纖維蛋白的溶解作用,并且CGLC可以有效地降低成纖維細胞表面標志蛋白的表達水平,抑制成纖維細胞的增殖。另一方面,由于腹腔