蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)

關(guān)于蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)第2頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙向電泳簡(jiǎn)介2-DE是目前唯一種可以僅通過(guò)一次操作解析上千種蛋白質(zhì)的技術(shù)。第一向—等點(diǎn)聚焦(IEF)pH梯度載體pI第二向—十二烷基硫酸鈉(SDS) SDS作為變性劑和助溶劑分子量第3頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品等點(diǎn)聚焦(第一向)雙向電泳的基本原理與流程示意分子量pH梯度(pI)SDS兩性電解質(zhì)pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向第4頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天雙向電泳具體步驟樣品制備緩沖液的配制IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色成像及圖像分析第5頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天為什么要進(jìn)行樣品制備目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬(wàn)種以上。待研究樣本(如臨床樣本)常是各種細(xì)胞和組織混雜，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細(xì)胞類型。？第6頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天1保證樣品蛋白質(zhì)完全溶解，分級(jí)效果好，干擾因素少盡量使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白）。避免樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。通過(guò)超離心去除所有顆粒狀物質(zhì)，防止其堵塞凝膠孔路。2最大限度減少樣品的損失低溫保存樣品(一般需低于-86℃)盡量縮短處理時(shí)間除鹽，省略不必要的過(guò)程保證樣品在聚焦時(shí)不發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。樣品制備原則第7頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品制備流程及注意事項(xiàng)溶解預(yù)處理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分級(jí)富集除雜第8頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品的破碎原則－最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解樣品的來(lái)源易碎的細(xì)胞堅(jiān)硬的組織植物細(xì)胞真菌方法溫和劇烈第9頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天溫和破碎法滲透壓沖擊(培養(yǎng)的細(xì)胞)低滲液中的懸浮細(xì)胞反復(fù)凍融法(細(xì)菌)液氮冷凍去污劑降解(酵母、霉菌)降解緩沖液(含尿素和去污劑)SDS(應(yīng)在IEF前去除)酶降解(植物、細(xì)菌、真菌)溶菌酶(細(xì)菌)纖維素酶，果膠酶(植物)溶壁酶(酵母)第10頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天劇烈破碎法超聲破碎(細(xì)胞懸浮液)需以冰冷卻避免過(guò)熱弗式細(xì)胞壓碎器(Frenchpressurecell，帶壁微生物細(xì)胞在剪切力作用下破碎研磨(固體組織，微生物)液氮中將固體組織磨成細(xì)粉末樣品研磨器(用于少量樣品的處理)用于精確樣品珠磨法(胞懸液，微生物)通過(guò)磨珠研磨破壞細(xì)胞壁第11頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天作用去除雜質(zhì)濃縮樣品抑制蛋白酶活性關(guān)鍵-可溶性獲得可以重新溶解的蛋白常用方法硫酸銨沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸銨/甲醇/苯酚抽提樣品的沉淀

對(duì)于疏水性特別強(qiáng)的蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型兩性表面活性劑(如磺基甜菜堿)第12頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品中雜質(zhì)的去除去除原則盡量不丟失蛋白減少蛋白的修飾雜質(zhì)的主要種類DNA/RNA脂質(zhì)多糖鹽離子去污劑其他固體雜質(zhì)

第13頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA/RNA的去除樣品中含核酸的不利影響能被銀染色法染色在凝膠酸性部分產(chǎn)生水平條紋當(dāng)樣品到達(dá)IEF凝膠酸性端時(shí)，與蛋白質(zhì)一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase處理超聲(機(jī)械破壞)、超高速離心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)第14頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天其他雜質(zhì)的去除脂質(zhì)使蛋白質(zhì)不易溶解且會(huì)影響其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦TCA、硫酸銨或醋酸銨/甲苯/苯酚沉淀；超速離心和高pH鹽使膠條導(dǎo)電能力增強(qiáng)，共聚焦不易發(fā)生透析；膠體過(guò)濾；沉淀或重新懸浮離子去污劑如SDS，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電不能聚焦丙酮沉淀；將含SDS的蛋白溶于含兩性或非離子去污劑如CHAPS，TritonX-100，NP-40等的緩沖液中并使SDS終濃度＜0.25%固體雜質(zhì)阻塞膠體，影響蛋白質(zhì)沉淀、聚焦過(guò)濾第15頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品的溶解2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一溶解的目標(biāo)樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除溶解方法要保證樣品在電泳過(guò)程中保持溶解狀態(tài)第16頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天增加樣品溶解性的手段變性劑改變氫鍵結(jié)構(gòu)，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性劑溶解疏水基團(tuán)離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS等還原劑使變性蛋白進(jìn)一步伸展溶解含自由巰基的DTT或

-巰基乙醇，不帶電荷的磷酸三丁酯(TPB)起載體作用的兩性電解質(zhì)到達(dá)平衡位置形成pH梯度，“運(yùn)載”電流、pH捕獲樣品中少量鹽分濃度應(yīng)小于0.2％（w/v，濃度過(guò)高會(huì)使IEF的速度降低)第17頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品液的準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚藍(lán)見(jiàn)下表0.2%兩性電解質(zhì)載體385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量試劑第18頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天IPG

用兩親性電解液的組成250

l25

l20%8-10125

l12.5

l40%7-97-10250

l25

l40%5-85-8125

l12.5

l40%4-6250

l25

l40%3-53-6125

l12.5

l40%5-7125

l12.5

l40%4-64-7250

l25

l40%3-103-10樣品溶液體積(/5ml)樣品溶液體積(/5ml)兩親性電解液濃度(w/v)兩親性電解液范圍IPG膠pH范圍第19頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品制備注意事項(xiàng)

蛋白質(zhì)水解低溫Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)蛋白抑制劑特殊樣品的制備低豐度蛋白的分離預(yù)分級(jí)窄pH膠(<2個(gè)pH單位)強(qiáng)堿性蛋白(如核糖體)的處理預(yù)處理富集特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦極端分子量蛋白的處理小于8kD對(duì)流混合，產(chǎn)生絨毛狀或模糊的帶大于200kD的蛋白，變性為多肽第20頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)膠條的制備ACBFED酸堿

pH3pH10第21頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定pH梯度(IPG)示意圖聚丙烯酰胺凝膠CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺單體酸緩沖基團(tuán)：堿緩沖基團(tuán)：NH3+R

第22頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天寬pH梯度及窄pH梯度寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加載樣能力以檢測(cè)、分析更多蛋白

第23頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天IPG膠的重泡漲及上樣2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍(lán)IPG膠條支架IPG

膠條定位泡漲目的：使樣品能完全以可溶形式進(jìn)入IPG膠條內(nèi)第24頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白載樣量IPG膠條對(duì)蛋白載樣量的影響因素：待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析待研究蛋白的豐度樣品的復(fù)雜度復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍預(yù)試驗(yàn)確定先寬后窄先線性后非線性先短后長(zhǎng)第25頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一向：等點(diǎn)聚焦1.放置電極墊

(?)2.200V

維持

1.5h3.500V維持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh時(shí)間電壓支架蓋IPG

膠條電極電極墊第26頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天IPG

膠條的平衡

平衡液6M尿素和30%甘油減少電內(nèi)滲第一步平衡加DTT使變性的非烷基化蛋白處于還原狀態(tài)第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止其在電泳過(guò)程中重新氧化第27頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

使被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚藍(lán)SDSSDSSDS向電泳緩沖液中加

0.5%的瓊脂糖SDS標(biāo)記紙片IPG膠條第28頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天膠體考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍可實(shí)現(xiàn)PAGE的無(wú)背景染色會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果胺基黑染色轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白質(zhì)的染色轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色銀染可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響染色方法第29頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天銀染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M檸檬酸5%乙酸25%甲醇第30頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天負(fù)染主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用能專門(mén)提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白質(zhì)的生物活性不能用于膜上染色適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析膠體擴(kuò)散染料主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似不用于膠內(nèi)染色染色方法第31頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類，后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成靈敏度為2~10ng其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì)金屬螯合染料與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的專門(mén)與常用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合染色方法第32頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天凝膠的圖像處理分析典型流程凝膠圖像的掃描圖像加工斑點(diǎn)檢測(cè)和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立2-DE分離的可溶性

E.coli蛋白第33頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天目前雙向電泳需解決的問(wèn)題樣品的制備及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核內(nèi)蛋白)難分離蛋白(如毛發(fā)及皮膚中的蛋白)載樣量的提高初步分離低豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白定量分析靈敏度及可重復(fù)性第34頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)于雙向電泳的建議首先采用寬pH范圍的膠條，確定蛋白的分布范圍，通常采用pH3-10的膠條如果pH線性分布的膠條分離效果不好，可采用非線性膠條加大蛋白上樣量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范圍的膠條，提高某pH范圍蛋白的分辨率第二向采用梯度膠進(jìn)行分離去除高豐度蛋白，進(jìn)行蛋白的分級(jí)處理，富集低豐度蛋白第35頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)第36頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜基礎(chǔ)

樣品離子源質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質(zhì)量分選(過(guò)濾)檢測(cè)根據(jù)m/z分選離子數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜檢測(cè)離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子3.檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖第37頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)質(zhì)量范圍速度靈敏度分辨率精確度第38頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天+++自由漂移區(qū)檢測(cè)器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對(duì)強(qiáng)度MH+MH+MH+特點(diǎn)：靈敏度高準(zhǔn)確度高分辨率高質(zhì)量范圍廣圖譜簡(jiǎn)明速度快第39頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天ESI四級(jí)桿質(zhì)量分析器碰撞室反射器MCP檢測(cè)器碰撞氣體串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)ESI-Q-TOF質(zhì)譜儀步驟：1質(zhì)量分析

2碰撞(離子裂解)3質(zhì)量分析TOF質(zhì)量分析器第40頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天強(qiáng)的抗背景干擾能力極高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度可用來(lái)分析復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)豐富的檢測(cè)信息，高通量鑒別蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)第41頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線

通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的鑒定鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)第42頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1234.5396

783.9147375.2561多肽已測(cè)得質(zhì)譜數(shù)據(jù)或理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)MALDI-TOF檢測(cè)的多肽指紋

胰酶消化凝膠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)?123比較:??是否相同

??質(zhì)譜3235.2256第43頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫(kù)中匹配

不成功的可能原因樣品量太少，PMF圖信噪比太低，輸入庫(kù)中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量不好。2-DE膠上所取的一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)并非單一蛋白質(zhì)，所獲PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)的混合圖。第44頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天

操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫(kù)中未有記載所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多未知的新蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模太小續(xù)：第45頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)？查詢串聯(lián)質(zhì)譜圖從頭測(cè)序輸入輸出序列片段PNT①②③串聯(lián)質(zhì)譜鑒定多肽的計(jì)量方法第46頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS）表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）聯(lián)合技術(shù)精確鑒定蛋白質(zhì)第47頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略

原理：對(duì)于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過(guò)比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量。

第48頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法靶蛋白制備蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定基本步驟：第49頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

基本原理：將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液過(guò)柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。第50頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天先決條件得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait）

獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì)第51頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天利用含靶蛋白的融合蛋白獲得

相互作用蛋白質(zhì)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白第52頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質(zhì)與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會(huì)均等檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間的相互作用第53頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

原理：以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。

第54頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天研究鼻咽癌細(xì)胞系中的p53相互作用蛋白抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀SDS分離免疫沉淀復(fù)合物切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相應(yīng)的肽序列標(biāo)簽搜索數(shù)據(jù)庫(kù)第55頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)

生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)之間的相互作用所有蛋白質(zhì)與靶蛋白的相互作用可檢測(cè)依賴于修飾的蛋白質(zhì)相互作用

第56頁(yè),共64頁(yè)，2024