細(xì)胞因子檢測(cè)方法

關(guān)于細(xì)胞因子檢測(cè)方法背景細(xì)胞因子檢測(cè)是判斷機(jī)體免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)疾病的診斷、病程觀察、療效判斷及細(xì)胞因子治療監(jiān)測(cè)等第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（一）依賴性細(xì)胞株：生物分析法

（二）功能檢測(cè)：生物分析法

（三）免疫測(cè)定：免疫分析法

（四）功能測(cè)定與抗體抑制（五）分子雜交技術(shù)：mRNA的測(cè)定

（六）多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測(cè)定

第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天生物分析法第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（一）依賴性細(xì)胞株一些腫瘤細(xì)胞株必須依賴于細(xì)胞因子方能在體外增殖，如DTLL細(xì)胞株依賴IL-2；FDC-PL細(xì)胞株依賴于小鼠IL-3；TF-1細(xì)胞株依賴于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用這些依賴細(xì)胞株檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞因子。這種方法敏感性高，特異性也不錯(cuò)，但可異的是并非所有細(xì)胞因都能找到相應(yīng)的細(xì)胞株，因而限制了它的應(yīng)用。第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天（二）功能檢測(cè)利用一些細(xì)胞因子的功能特性，可建立相應(yīng)的活性測(cè)定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用等。這樣的方法敏感性高，但特異性不夠，容易受一些擾因素的影響。第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天免疫分析法（1）放免實(shí)驗(yàn)（RIA）（2）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天mRNA的測(cè)定（1）分子雜交實(shí)驗(yàn)（2）逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天小結(jié)生物學(xué)檢測(cè)法比較敏感，又可直接測(cè)定生物學(xué)功能，是最可靠的方法，適用于各種實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，是科研部門最常用的技術(shù)，但需要長期培養(yǎng)依賴性細(xì)胞株，檢測(cè)耗時(shí)長，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學(xué)檢測(cè)法比較簡單，迅速，重復(fù)性好，但所測(cè)定的只代表相應(yīng)細(xì)胞因子的量而不代表活性，同時(shí)敏感度也低于生物活性檢測(cè)法（約低10～100倍）。分子生物學(xué)法只能檢測(cè)基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)因子的濃度及活性等資料，主要用于機(jī)制探討。第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天影響因素原理與方法靈敏度準(zhǔn)確度和特異性精密度：免疫分析法的精密度較其生物分析法有較大提高；批內(nèi)變異通常為20%～25%，因此有必要進(jìn)行2次或3次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化生物分析法和免疫分析法結(jié)合使用

第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天免疫分析法ELISA細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

ELISPOT第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISA

Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay1．間接ELISA（IndirectELISA）：用于篩檢抗體（抗特定抗原成分的特異性抗體）。此法是測(cè)定抗體最常用的方法。2．夾心ELISA（SandwichELISA）：用于檢測(cè)目的抗原的量。其優(yōu)點(diǎn)是避免了對(duì)特異性抗體的直接標(biāo)記，但增加了操作步驟和測(cè)定時(shí)間。3．競(jìng)爭(zhēng)ELISA（CompetitiveELISA）用于確定抗原特異性或待檢標(biāo)本中含交叉反應(yīng)成分時(shí)為了提高實(shí)驗(yàn)的特異性而使用的一種方法。根據(jù)標(biāo)記抗原與同種未標(biāo)記待測(cè)抗原與抗體間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，主要用于測(cè)定小分子抗原。

第12頁,共50頁，2024年2月25日，星期天夾心ELISA第1步，包被捕獲抗體到96孔板中，BSA阻斷后加入標(biāo)準(zhǔn)品或者標(biāo)本第2步，加入酶標(biāo)的抗體，結(jié)合被捕獲的細(xì)胞因子第3步，加入酶的底物顯色，酶標(biāo)儀或者化學(xué)發(fā)光議讀取結(jié)果（OD：opticaldensity）第4步，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)本中細(xì)胞因子的含量第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)前：確定試劑盒在有效期內(nèi)仔細(xì)閱讀說明書按說明書確定所有試劑齊全（數(shù)量、體積）根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量確定所需試劑的量按說明書將所用試劑平衡至室溫，配制所需試劑

第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)標(biāo)本的制備和貯存：血清、血漿標(biāo)本：盡快分裝，貯存在-70℃，避免反復(fù)凍融。使用前將標(biāo)本平衡至室溫，不能用水浴鍋細(xì)胞培養(yǎng)上清液：1500g離心10～15分鐘去除細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)?。?6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天注意事項(xiàng)試劑盒貯存條件和有效期未開封試劑盒：貯存在2-8℃開封/復(fù)溶試劑：2-8℃可以1個(gè)月左右標(biāo)準(zhǔn)品：分裝并貯存在-20℃以下，1個(gè)月，避免反復(fù)凍融微孔板：將未使用的板條用箔紙包好，加上干燥劑沿四周封口。2-8℃可以1個(gè)月左右

第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天檢測(cè)方法的進(jìn)展高通量細(xì)胞因子檢測(cè)CBA(CytometricBeadArray)是一種微珠多用途檢測(cè)分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測(cè)物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時(shí)檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測(cè)樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個(gè)樣本的多個(gè)數(shù)據(jù)。第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天夾心ELISA缺點(diǎn)：不能顯示出單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的同一性和頻率性的直接信息細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的免疫熒光檢測(cè)ELISPOT原位雜交單一細(xì)胞PCR第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)原理：Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)方法，使得細(xì)胞因子聚集、蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)，可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用途：檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子；并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法：用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的最小熒光背景。特點(diǎn)：快速

簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)；

高效：在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群；

接近生物體的分析條件：全血檢測(cè)保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天所需儀器流式細(xì)胞儀

第22頁,共50頁，2024年2月25日，星期天所需試劑１．細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑２．熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體３．激活劑：①Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)②Ionomycin③StaphylococcalenterotoxinB(SEB)４．蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑：阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，以利于準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力①Brefeldin-A(BFA)：10mg/ml．在激活過程最后4-5小時(shí)使用BFA，過度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降②Monensin：3uM/files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin/files/FLOWapplicaion/TH1TH2/brefeldin%20a.pdf第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天所需試劑５．固定劑：含4%的多聚甲醛PBS溶液細(xì)胞在體外刺激后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。６．破膜劑：含1％皂甙、0.05％疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）將細(xì)胞膜穿孔，以利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合

第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小時(shí)人TNF-α：使用PMA(50ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激６小時(shí)人IL-2：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小時(shí)小鼠IL-2：細(xì)胞在包被抗小鼠CD3抗體(25ug/ml)的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時(shí)第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天基本過程（以全血為例）１、收獲細(xì)胞２、阻斷Fc受體：消除非特異性的結(jié)合染色３、細(xì)胞表面染色４、固定和破膜５、細(xì)胞內(nèi)染色第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天免疫分析法ELISA細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

ELISPOT第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOTEnzyme-linkedImmunospotAssay

第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT發(fā)展歷史1963年：Jerne等人創(chuàng)立的溶血空斑技術(shù)(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),這項(xiàng)技術(shù)可用于檢測(cè)并計(jì)數(shù)單個(gè)抗體形成細(xì)胞。1983年：Czerkinsky等成功地檢測(cè)出因受刺激而分泌抗體的B細(xì)胞頻率接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，藉由檢測(cè)T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因子，來定量機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者PrecursorT亞群的大小，預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進(jìn)行的下游免疫反應(yīng)。1996：俄亥俄卅CaseWesternReserve大學(xué)PaulLehmann團(tuán)隊(duì)引進(jìn)PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuberetal.,Science,1996），解決了低敏感度的問題。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法來提高這種方法的敏感性Herr用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)自動(dòng)分析TNF-α酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)的大小和數(shù)量,計(jì)算與負(fù)載抗原肽的靶細(xì)胞接觸后PBMC中抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量Vaquerano等將數(shù)碼相機(jī)和計(jì)算機(jī)結(jié)合起來,開發(fā)出類似的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)系統(tǒng),認(rèn)為當(dāng)每孔斑點(diǎn)數(shù)大于100時(shí),這種方法更客觀、可重復(fù)性高且節(jié)省時(shí)間第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天檢測(cè)原理細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過顯微鏡或ELISPOT酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果。第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D1ELISPOT包被程序

每孔加入15μl70%的乙醇預(yù)濕30秒，PVDF膜變成半透明狀（加樣注意！）加入100μl去離子水洗滌三次，盡量減少乙醇的殘留每孔加入100μl包被抗體工作液，4°C包被過夜第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D2傾倒包被液，用PBS洗滌5次，最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干200μl試劑盒自帶的稀釋好的封閉液，37°C封閉1小時(shí)傾倒封閉液，無須洗滌，直接可以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。（也可以用PBS緩沖液或者純水洗滌一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存數(shù)周。）第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D2鋪細(xì)胞,加入刺激物，培養(yǎng)正對(duì)照（PHA刺激）10μl，終濃度4ug/mL樣品負(fù)對(duì)照（不加刺激物）背景負(fù)對(duì)照（不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基和所有的檢測(cè)試劑）：100μl的U-Cytech無血清培養(yǎng)基設(shè)置2-4個(gè)孔的重復(fù)第36頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D2以前做的封閉，可加入200μl的U-Cytech無血清培養(yǎng)基，室溫靜置10分鐘，傾倒，然后再重復(fù)一次加入不同濃度的細(xì)胞，100μl/well，細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻加入刺激物（配制成10X終濃度，10μl/well）到實(shí)驗(yàn)孔不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板蓋上板蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，37°C培養(yǎng)18-24hr在整個(gè)培養(yǎng)過程中避免移動(dòng)、碰撞培養(yǎng)板。避免開關(guān)培養(yǎng)箱的箱門！

第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D3培養(yǎng)后操作

傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，低滲法將細(xì)胞裂解：每孔加200μl冰冷的去離子水，將板置于冰上冰浴10分鐘200μl的PBST洗滌10遍，洗滌最后一遍之后，將板倒扣在吸水紙上拍干稀釋檢測(cè)抗體，每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37°C1小時(shí)200μl的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D3在一個(gè)淺托盤中盛上干凈的PBST，將膜板的底面浸入，輕輕搖晃幾次即可。（注意：一定要將膜的背面和塑料保護(hù)層上的液體甩干之后，再合攏，蓋上，不要傷害到膜！）第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D3稀釋酶標(biāo)的鏈霉親和素，每孔加入100μl，37°C1小時(shí)200μl的PBST洗滌5遍，洗滌最后一遍時(shí)，將PVDF膜板的背面的塑料保護(hù)層取下，同時(shí)洗滌膜的正反兩面，蓋上保護(hù)層，將板倒扣在吸水紙上拍干解凍已配好的顯色液，每孔加入100μl的顯色液，室溫靜置20-30分鐘，注意避光。第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)操作程序D3待斑點(diǎn)生長到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30分鐘，讓膜自然晾干注意不要將板放到烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆、破裂!ELISPPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自動(dòng)讀板儀內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)，作統(tǒng)計(jì)分析。第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判定儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像；這些影像可以進(jìn)一步使用手動(dòng)、或是自動(dòng)方式計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)目使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件，然后同時(shí)分析斑點(diǎn)的大小，以推估細(xì)胞因子分泌的多寡?？朔鹘y(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費(fèi)人力、及人為客觀性等缺點(diǎn)ImmunoSpot影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個(gè)小孔中的斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中的平均斑點(diǎn)數(shù)目、每個(gè)小孔中斑點(diǎn)大小的直方統(tǒng)計(jì)圖。第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判定計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析第43頁,共50頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)優(yōu)勢(shì)------與ELISAELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過計(jì)算機(jī)輔助的分析系統(tǒng)對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率）由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細(xì)胞中檢出1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時(shí)，不會(huì)影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。第44頁,共50頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)優(yōu)勢(shì)------與有限稀釋法（limitingdilutionanalysis,LDA）

LDA：對(duì)特異性CTL細(xì)胞進(jìn)行定量,免疫反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和記憶毒性T淋巴細(xì)胞(memorialCTL,mCTL)亞群的細(xì)胞周期需高強(qiáng)度抗原刺激,這會(huì)加快效應(yīng)CTL(eCTL)凋亡,且不能定量測(cè)定eCTL細(xì)胞數(shù)量或測(cè)定值偏低較繁瑣,培養(yǎng)時(shí)間可長達(dá)2～3周，而且很容易造成T細(xì)胞數(shù)量損失。第45頁,共50頁，2024年2月25日，星期天技術(shù)優(yōu)勢(shì)------與四聚體法（Tetramer）MHC-Ⅰ類分子抗原肽四聚體法——定量檢測(cè)抗原特異性CTL的“金標(biāo)準(zhǔn)”優(yōu)勢(shì)：迅速、直接、靈敏且特異性強(qiáng),即使當(dāng)體內(nèi)mCTL水平低于1%,用MHC-Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測(cè)到準(zhǔn)確的值,比LDA敏感度要高5～10倍該技術(shù)的困難：除了合成及穩(wěn)定MHCⅠ類分子的技術(shù)困難外,最主要缺點(diǎn)是表位