蛋白質(zhì)的分離純化

關(guān)于蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化透析和超過(guò)濾超速離心層析（色譜）

(chromatography)電泳

(electrophoresis)第2頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天1透析和超過(guò)濾

P302第3頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天2超速離心

P302第4頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

基本原理：層析由流動(dòng)相和固定相組成樣品作為流動(dòng)相流過(guò)固定相各組分在兩相中分布程度不同各成分遷移率不同分離3層析（色譜）（Chromatography）

P148第5頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天兩相：固定相（靜相）和流動(dòng)相（動(dòng)相）有效分配系數(shù)：第6頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天層析按流動(dòng)相：氣相、液相色譜等；按操作形式不同：紙層析、薄層層析、柱層析等；按分離機(jī)制：凝膠層析、離子交換層析、親和層析、吸附層析等。第7頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.1紙層析

（Filter-paperchromatography）相對(duì)遷移率

P151第8頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.2薄層層析

（Thin-layerchromatography）

P152第9頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.3柱層析第10頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天①凝膠過(guò)濾層析

(分子排阻層析、分子篩層析）

（Gel-filtrationchromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離純化蛋白質(zhì)的一種方法。

P303第11頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天介質(zhì)：凝膠顆粒（多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）交聯(lián)度或孔度（網(wǎng)孔大?。z的分級(jí)分離范圍交聯(lián)葡聚糖——SephadexG-50（1500-30000）瓊脂糖——Sepharose或Bio-GelA聚丙烯酰胺——Bio-GelP第12頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天原理：第13頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天②離子交換層析

（Ion-exchangechromatography）根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同進(jìn)行分離純化。介質(zhì)：離子交換樹(shù)脂溶液中的離子與樹(shù)脂上的帶電基團(tuán)進(jìn)行交換反應(yīng)；各種離子交換能力不同，與樹(shù)脂結(jié)合的牢固程度就不同；在洗脫過(guò)程中，各種離子遷移率不同，達(dá)到分離的目的。

P152和310第14頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第17頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第18頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天茚三酮反應(yīng)：生成紫色物質(zhì)脯氨酸和羥脯氨酸生成黃色物質(zhì)

氨基酸的定性定量第19頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天

根據(jù)蛋白質(zhì)與特異的配體相互作用來(lái)分離的。蛋白質(zhì)＋配體蛋白質(zhì)配體復(fù)合物③親和層析

(Affinitychromatography)

P313第21頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第24頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天④高效液相層析（High-Performanceliquidchromatography,HPLC）

P154和314也分為凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析和親和層析等特點(diǎn)：固定相支持劑顆粒細(xì)采取高壓，洗脫速度增大第26頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第27頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4電泳(Electrophoresis)在外電場(chǎng)存在下，利用蛋白質(zhì)分子攜帶的凈電荷不同以分離混合物ArneTiselius獲1948年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

P307第28頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.1凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠（蛋白質(zhì)和多核苷酸）瓊脂糖凝膠（核酸）第29頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天電泳儀水平電泳槽垂直電泳槽第30頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)：濃縮膠和分離膠電泳遷移率決定于所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。+凝膠加樣

P309第31頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天巰基乙醇：打開(kāi)二硫鍵。SDS：變性劑，破裂蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。

SDS以其氫鍵與蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈結(jié)合成復(fù)合體。①帶有很多負(fù)電荷——遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)分子原有電荷②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象：近似雪茄煙形的長(zhǎng)橢圓棒，

短軸長(zhǎng)度相同，長(zhǎng)軸長(zhǎng)度隨蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量成正比例變化。遷移率主要取決于蛋白質(zhì)相對(duì)分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）第32頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第33頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天遷移率第34頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.2等電聚焦電泳高分辨率的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。在具有pH梯度的介質(zhì)中進(jìn)行的。在外電場(chǎng)的作用下各種蛋白質(zhì)將移向并聚焦（停留）在等于其等電點(diǎn)的pH梯度處，并形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。特別適用于同功酶的鑒定。只要它們的pI有0.02pH單位的差別就能分開(kāi)。

P310第35頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第36頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天等電聚焦電泳電泳時(shí)，每種蛋白遷移至與它的pI相一致的pH處加入蛋白樣品電場(chǎng)作用下在凝膠中建立穩(wěn)定的一個(gè)pH梯度第37頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天第38頁(yè),共42頁(yè)，2024年2月25日，星期天等電聚焦電泳+SDS-PAGE第一向進(jìn)行等電聚焦，蛋白質(zhì)沿pH梯度分離至各自的等電點(diǎn)；再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離.4.3雙向電泳pI降低分子量減小第39頁(yè)