elisa結(jié)果影響因素

ELISA測(cè)定結(jié)果影響因素2024/4/11完整版pptELISA測(cè)定結(jié)果影響因素2024/3/311完整版ppt主要內(nèi)容一、ELISA簡(jiǎn)介二、ELISA試驗(yàn)結(jié)果影響因素

2完整版ppt主要內(nèi)容一、ELISA簡(jiǎn)介2完整版pptELISA簡(jiǎn)介ELISA(

EnzymeLinked

Immunosorbnent

Assay

)是酶聯(lián)接免疫吸附測(cè)定的簡(jiǎn)稱。是一種免疫學(xué)測(cè)定方法，主要通過(guò)抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)液體標(biāo)本中目的蛋白性質(zhì)、功能及含量。3完整版pptELISA簡(jiǎn)介ELISA(

EnzymeLinked

ImmELISA實(shí)驗(yàn)原理抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性并能相互特異性結(jié)合。抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入合適的底物，在酶的作用下顯色，顏色深淺與特異性抗體成比例關(guān)系，可進(jìn)行定性和定量分析?？乖贵w反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性4完整版pptELISA實(shí)驗(yàn)原理抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，ELISA檢測(cè)方法抗原測(cè)定方法抗體測(cè)定方法雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法競(jìng)爭(zhēng)法間接法5完整版pptELISA檢測(cè)方法抗原測(cè)定方法抗體測(cè)定方法雙抗體夾心法雙抗主要操作流程+已知抗體包被于載體表面加待檢物無(wú)抗原與抗體結(jié)合洗滌洗滌洗滌洗滌-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY已知抗體包被于載體表面加待檢物抗原與抗體結(jié)合加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合加酶作用的底物產(chǎn)生顏色加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色雙抗體夾心法測(cè)抗原6完整版ppt主要操作流程+已知抗體加待檢物洗滌洗滌洗滌洗滌-YYYEYEELISA結(jié)果判定1.定性測(cè)定

(1)肉眼觀察：比較檢測(cè)孔與對(duì)照孔的顏色。

(2)陽(yáng)性判定值法(cut-offvalue，CO值)：一般為陰性對(duì)照的平均A值加一個(gè)常數(shù)，標(biāo)本A值≥CO值即為陽(yáng)性。(3)抑制率法：在競(jìng)爭(zhēng)抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。

抑制率(％)＝(陰性對(duì)照A-待測(cè)A)／陰性對(duì)照AX100％,一般以抑制率≥50％為陽(yáng)性2.半定量測(cè)定

結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在陽(yáng)性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度”。3.定量測(cè)定

用己知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定，與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或活性單位表示。

7完整版pptELISA結(jié)果判定1.定性測(cè)定

7完整版pptELISA結(jié)果判定結(jié)果判定方法的選擇：間接法和夾心法ELSIA（陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA（陽(yáng)性孔呈色淺于陰性孔）1.定性結(jié)果可以用肉眼判定2.陽(yáng)性判定值3.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值

1.陽(yáng)性判定值法2.抑制率法3.不可用肉眼判斷8完整版pptELISA結(jié)果判定結(jié)果判定方法的選擇：間接法和夾心法ELSI結(jié)果影響因素ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求，在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些錯(cuò)誤結(jié)果。引起錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：1、標(biāo)本因素2、試劑因素3、操作因素4、環(huán)境因素。9完整版ppt結(jié)果影響因素ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)

類風(fēng)濕因子補(bǔ)體嗜異性抗體自身抗體

醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗體交叉反應(yīng)物外源性物質(zhì)標(biāo)本溶血標(biāo)本污染貯存過(guò)久凝集不全采血管中添加物標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種。10完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)外源性物質(zhì)標(biāo)結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)：（1）類風(fēng)濕因子

與ELISA系統(tǒng)中的捕捉抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

解決辦法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性（63℃，10

min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效）；③檢測(cè)抗原時(shí)，可以用2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本

稀釋液中，使RF降解。（2）補(bǔ)體

ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使C1q

可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本；②用53℃，10

min或56℃，30

min加熱血清使C1q滅活。（3）嗜異性抗體

人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物（如鼠等）Ig

(s)結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)

物Ig

(s)，但加入量不足或亞類不同時(shí)無(wú)效。

11完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素內(nèi)源性物質(zhì)：11完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素

（4）嗜靶抗原的自身抗體

抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。

解決的辦法：測(cè)定前用理化方法將其解離。（5）醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig

(

s

)抗體

鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術(shù)，均有可能使病人體

內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig

(

s

)抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig

(

s

)。（6）交叉反應(yīng)物質(zhì)

類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)

，假如交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。12完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素（4）嗜靶抗原的自身抗體

12完整結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素外源性物質(zhì)：（1）標(biāo)本溶血

紅細(xì)胞溶解釋放的血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶活性，在以辣根過(guò)氧化物酶為標(biāo)記的

ELISA測(cè)定中，會(huì)導(dǎo)致非特異性顯色，故標(biāo)本采集時(shí)應(yīng)避免溶血。（2）標(biāo)本受細(xì)菌污染

菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶，同溶血標(biāo)本一樣，可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測(cè)定結(jié)果。（3）標(biāo)本保存不當(dāng)

標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（一天以上），會(huì)使抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。

冰箱中久存的標(biāo)本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至

假陽(yáng)性；為克服上述干擾，ELISA測(cè)定的血清

標(biāo)本宜為新鮮采集；如不能立即測(cè)定，5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可存放于4℃，1周后測(cè)定的血清標(biāo)本應(yīng)低溫凍存；凍存后融解的標(biāo)本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混合后再測(cè)定，但混勻時(shí)應(yīng)輕柔，不可強(qiáng)烈振蕩。

13完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素外源性物質(zhì)：13完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素（4）標(biāo)本凝集不全

在沒(méi)有促凝劑和抗凝劑的情況下，正常血液采集后1.5~2h開(kāi)始凝固，18~24h完全凝固。臨床檢驗(yàn)工作中，有時(shí)為了爭(zhēng)取

時(shí)間快速檢測(cè)，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成

肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；這類情況于次日復(fù)查時(shí)因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復(fù)查結(jié)果變?yōu)殛幮?/p>

。為避免上述干擾作用，血液標(biāo)本采集后最好使其充分凝固再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血

管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽＃?）標(biāo)本管中添加物質(zhì)的影響

抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過(guò)氧化物酶活性）及分離膠等均對(duì)ELISA測(cè)定有一定干擾作用。14完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素（4）標(biāo)本凝集不全

14完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素[1].許斌等.ELISA檢測(cè)HBsAg影響因素的探討.臨床檢驗(yàn)雜志.2000.VoI.18.No.4表1內(nèi)外源物質(zhì)的干擾15完整版ppt結(jié)果影響因素——標(biāo)本因素[1].許斌等.ELISA檢測(cè)HBs結(jié)果影響因素——試劑因素試劑的選擇

試劑的選擇是保證血液檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵要素。不同廠家的試劑在使用效果上存在差異。要選購(gòu)知名度相對(duì)高、信譽(yù)可靠的試劑。

重視試劑質(zhì)量同時(shí)有效地進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控以及參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。特別是室間質(zhì)評(píng)可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)本身不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異，幫助校正使結(jié)果具有可比性。

試劑盒中陰性對(duì)照的質(zhì)量尤為重要，當(dāng)陰性對(duì)照吸光度（OD值）較高，夾心法易產(chǎn)生假陰性，而競(jìng)爭(zhēng)抑制法易產(chǎn)生假陽(yáng)性。16完整版ppt結(jié)果影響因素——試劑因素試劑的選擇

16完整版ppt結(jié)果影響因素——試劑因素試劑的準(zhǔn)備

1.觀察外包裝，有無(wú)漏液，注意效期等。2.仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。3.操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘，保證酶等液體的初始反應(yīng)溫度及活性劑的溶解。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會(huì)偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會(huì)偏小17完整版ppt結(jié)果影響因素——試劑因素試劑的準(zhǔn)備

液體溫度>吸頭溫度結(jié)果影響因素——操作因素加樣溫育時(shí)間和溫度洗板顯色比色18完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素加樣18完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素加樣加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)如有氣泡，抗原抗體不能有效地結(jié)合會(huì)導(dǎo)致弱陽(yáng)性甚至假陰性。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸頭，以免發(fā)生交叉污染。加酶結(jié)合物、加底物，應(yīng)使加液量準(zhǔn)確均一，加液過(guò)程迅速完成。滴加時(shí)，除了要注意滴加的角度垂直外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象。有些測(cè)定需用稀釋的血清，應(yīng)保證稀釋液與血清混合均勻。

19完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素加樣19完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素

曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶(zoneofequivalence)。在此范圍內(nèi)，抗原抗體充分結(jié)合，形成的沉淀物最多，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比(optimalratio)。鉤狀效應(yīng)：即HOOK效應(yīng),是指由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象，其中抗體過(guò)量叫做前帶效應(yīng)；抗原過(guò)量叫做后帶效應(yīng)。

20完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素鉤狀效應(yīng)：即HOOK效應(yīng),結(jié)果影響因素——操作因素正常情況下的雙抗體夾心法ELISA反應(yīng)一步法抗原過(guò)量時(shí)出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)特點(diǎn)：不易發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的影響：強(qiáng)陽(yáng)性→假陰性解決方法：標(biāo)本稀釋21完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素正常情況下的雙抗體夾心法ELISA反

結(jié)果影響因素——操作因素[2]王珂等.ELISA法測(cè)梅毒螺旋體抗體鉤狀效應(yīng)2例分析.中國(guó)誤診學(xué)雜志.2008Vol8No.33.表2不同血清稀釋度下的S/OD值（OD值為0.105）項(xiàng)目原倍1:21:41:81:161:321:641:1281:256標(biāo)本10.923.778.1112.2515.2417.8816.3410.887.58標(biāo)本20.632.594.835.8210.037.495.783.952.6022完整版ppt

結(jié)果影響因素——操作因素[2]王珂等.ELISA法測(cè)梅毒螺溫育（成敗關(guān)鍵）

每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式，其中溫度和溫育時(shí)間是重要因素。結(jié)果影響因素——操作因素[3].劉運(yùn)保.操作因素對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué).2005.Vol.16.No.4表3不同孵育條件對(duì)結(jié)果的影響23完整版ppt溫育（成敗關(guān)鍵）結(jié)果影響因素——操作因素[3].劉運(yùn)保.操作

[4]許萍等.不同溫育環(huán)境ELISA檢測(cè)抗—HCV的比較.臨床檢驗(yàn)雜志.2002.Vol.20.Mo.3A.1、2、3全部在雅培鼓風(fēng)式恒溫系統(tǒng)溫育B.1、2、3全部在水浴恒溫箱溫育C.1、2干式3水浴D.1、2水浴3干式E.1水浴2、3干式F.1干式2、3水浴G.1水浴2干式3水浴H.1干式2水浴3干式1.反應(yīng)板中加待檢樣品37℃60min2.加酶標(biāo)記物37℃60min3.加底物溶液37℃30min表4不同溫育條件下的檢測(cè)結(jié)果24完整版ppt[4]許萍等.不同溫育環(huán)境ELISA檢測(cè)抗—HCV的比較.結(jié)果影響因素——操作因素邊緣效應(yīng)

使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)生“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫置于37℃溫箱(非水浴)，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。

另外，酶標(biāo)板也是一個(gè)比較重要的因素，選擇質(zhì)量好一點(diǎn)的板能一定程度減少板內(nèi)誤差。25完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素邊緣效應(yīng)25完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素5[1].許斌等.ELISA檢測(cè)HBsAg影響因素的探討.臨床檢驗(yàn)雜志.2000.VoI.18.No.426完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素5[1].許斌等.ELISA檢測(cè)HB結(jié)果影響因素——操作因素洗板在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步，應(yīng)引起操作者重視。ELISA就是靠洗滌來(lái)達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過(guò)洗滌以消除殘留在板孔中沒(méi)能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過(guò)程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。27完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素洗板27完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素顯色有研究報(bào)道按A、B液的順序分別滴加和將A、B液混合后滴加，檢測(cè)結(jié)果有顯著差異,中值陽(yáng)性和高值陽(yáng)性分別平均下降了33.6%和30.0%[2]。

OPD（鄰苯二胺）底物顯色一般在室溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深，再延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn)行。TMB（四甲基聯(lián)苯胺）受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。

[2].劉運(yùn)保.操作因素對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué).2005.Vol.16.No.428完整版ppt結(jié)果影響因素——操作因素顯色[2].劉運(yùn)保.操作因素對(duì)ELI結(jié)果影響因素——操作因素比色作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器，酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否，決定結(jié)果的可靠度。