當歸配方顆粒PCR鑒別-公示稿

ICS**.***.**

C**

團體標準

T/CACM****－20**

當歸配方顆粒PCR鑒別

PCRidentificationofDangguiPeifangkeli

（文件類型：公示稿）

（完成時間：2020年11月）

20**-**-**發(fā)布20**-**-**實施

中華中醫(yī)藥學會發(fā)布

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前言

（必備要素）

本標準按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》

的規(guī)定起草。

本標準由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心提出。

本標準由中華中醫(yī)藥學會歸口。

本標準起草單位：中國中醫(yī)科學院中藥資源中心、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、安徽省

食品藥品檢驗研究院、浙江省中醫(yī)院、成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院、安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有

限公司、華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司

本標準主要起草人：袁媛、張輝、蔣超、張亞中、蒲婧哲、胡沖、鄭敏霞、鄭琰、高波、

吳建國

II

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當歸配方顆粒PCR鑒別

1.范圍

本標準規(guī)定了使用PCR鑒別當歸配方顆粒的通用方法和要求。

本標準適用于當歸配方顆粒的鑒別。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件對本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用本標準。

《中華人民共和國藥典》

GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》

GB/T27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》

T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》

3.術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

3.1

當歸配方顆粒dangguipeifangkeli

為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根經(jīng)炮制并按標準湯劑的主要

質量指標加工制成的配方顆粒。

4.儀器設備

應符合規(guī)范性附錄A的要求。

5.試劑

應符合規(guī)范性附錄A的要求。

6.鑒別引物序列

Danggui-224F：5'-CTCGTGGAGCTGTACTGGTA-3'

1

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Danggui-224R：5'-GGTAGTCCCGCCTGACCT-3'。

7.檢驗程序

為防止交叉污染，收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應在不同操作

間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行，進入各區(qū)域應嚴格按照單一方向進行，即樣品制備區(qū)

→核酸制備區(qū)→擴增區(qū)→檢測區(qū)。

7.1取樣

送檢樣品總量應不低于10g，每批分為3等份，1/3供實驗室分析用，另1/3供復核用，其

余1/3留樣保存。收樣時應檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。

對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄，照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照《中華

人民共和國藥典》四部通則0211進行取樣。

7.2DNA提取

送檢樣品DNA提取步驟如下：

a)取樣品1g，粉碎成粉末。

b)取上述粉末0.02g，置2mL離心管中，加入細胞核裂解液300μL、乙二胺四乙酸

二鈉溶液50μL、蛋白酶K溶液20μL、RNA酶A溶液5μL，充分渦旋震蕩混勻3min，

56℃下水浴60min。

c)離心（12000×g）5min后，吸取上清液250μL至一新的2mL離心管中，加入裂

解緩沖液250μL，混勻，轉移至純化柱，將純化柱放入離心機，離心（12000×g）5min；

棄去濾過液。

d)往純化柱中加入洗脫液700μL，離心（12000×g）1min。

e)重復步驟d）2次。

f)棄去濾過液，再離心（12000×g）2min，取出純化柱，室溫放置2min，晾干吸附

材料中的剩余洗脫液。

g)將純化柱換入一個新的2mL離心管，向吸附膜的中央懸空滴加無菌雙蒸水100μL，

靜置3min，離心（12000×g）2min，取濾過液的上清液，作為供試品溶液，可置-20℃

下保存?zhèn)溆谩?/p>

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除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取試樣DNA。

7.3PCR擴增

首次使用本方法時，應校對PCR儀溫控準確性，并使用陽性對照和陰性對照以核對使

用的TaqDNA聚合酶或PCR預混液的適用性。

7.3.1對照試驗

送檢樣品應平行檢測2次，并設置陽性對照（使用當歸對照藥材，按7.2提取DNA，

所獲的液體作為PCR擴增的陽性對照）、陰性對照（可選擇白芷對照藥材，按7.2提取DNA，

所獲的液體作為PCR擴增的陰性對照）和空白對照。

7.3.2PCR反應體系

在200μL離心管中依次加入2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預混液12.5μL、

引物溶液（含正向和反向引物）各0.4μL、模板DNA（10ng~50ng）3μL，用無菌雙蒸水

補足反應體積至25μL。將反應液振蕩混勻，瞬時離心。

7.3.3PCR反應參數(shù)

將離心管置于PCR儀中，PCR反應參數(shù)為：95°C預變性5min，循環(huán)反應40次(95°C

30s,60°C30s,72°C30s),72°C延伸5min。PCR反應結束后，取出離心管，對反應產(chǎn)物

按7.5進行檢測。

或置4°C下保存。

7.4限制性內(nèi)切酶酶切

在200μL離心管中依次加入PCR反應產(chǎn)物溶液25μL、10×限制性內(nèi)切酶緩沖液3μL，

SmlI限制性內(nèi)切酶0.5μL，用無菌雙蒸水補足反應體積至30μL。將反應液振蕩混勻，瞬時

離心。將離心管置PCR儀，55°C保溫60min，取出離心，對反應產(chǎn)物進行檢測或置4°C

下保存。

7.5擴增/酶切產(chǎn)物檢測

配制2%瓊脂糖凝膠，膠中加入適量核酸染料GelRed。取送檢樣品、陽性對照、陰性

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對照及空白對照的酶切反應各1μL產(chǎn)物，分別加入6×上樣緩沖液各5μL，混勻，分別上

樣于同一瓊脂糖凝膠上，DL1000DNA分子量標準溶液上樣量為2μL（0.5μg/μL）。按《中

華人民共和國藥典》四部通則1001“瓊脂糖凝膠電泳法（核酸檢測用）”試驗。電泳結束后，

取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

8.結果判定

在陰性對照、陽性對照和空白對照結果符合規(guī)定的情況下，供試品凝膠電泳圖譜中，在

與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上，在100~200bp間有單一DNA條帶者為陽性，否則為

陰性結果。

9.結果報告

9.1一般要求

檢測結果應表示為陽性或陰性，陽性和陰性分別用“+”和“-”符號表示。

9.2檢測報告

樣品經(jīng)檢測后，實驗室應根據(jù)實驗的具體操作程序和結果做好詳細的實驗記錄，出具檢

測報告。檢測報告包含的基本內(nèi)容應參照T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》的要求。

10.質量保證

兩份平行樣檢測結果應一致。當一份送檢樣品的結果為陽性，另一份為陰性時，要重新

測試?？梢赃m當增加核酸擴增反應體系中DNA模板量，使兩份試樣得到同樣的結果。平行

樣本檢測結果不一致時應檢測模板DNA的質量，確保提取的DNA片段大于擴增片段。如果

經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測，檢測結果不一致，可在測試報告中表述該實驗室

樣品的測試結果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測低限。進行PCR反應前，應

確認所使用的聚合酶符合本標準的要求。

11.廢棄物處理

檢測過程中的廢棄物處理應符合GB/T27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》

的要求。

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附錄A

（規(guī)范性）

為執(zhí)行本包括本標準，以下儀器、試劑必不可少：

A.1儀器設備

離心機(離心機最高重力離心力應≥12000×g)、金屬?。☉煞胖?mL離心管，也可使

用水浴鍋替代）、制冰機、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、PCR儀（使用前應進行溫度校準、電

泳儀及其附件（應包括水平電泳槽、制膠器、鯊魚齒梳等）、凝膠成像儀（或紫外透射儀等

凝膠觀察設備）、核酸蛋白儀、電子天平（感量0.01g）、連續(xù)可調微量移液槍（至少應該包

括2.5μL、10μL、200μL、1000μL等4種不同規(guī)格，并包括配套一次性吸頭）、低溫冰箱

（溫度可維持在4°C及-20°C）

A.2試劑與試藥

除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑；實驗用水符合GB/T

6682的要求；所配制的試劑均應滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、配制時間、

保存條件、失效日期和配制者姓名；PCR試劑應小量分裝保存以減少污染；材料及試劑的保

存都應有防污染措施。

主要試劑與試藥包括：2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預混液、DNA提取試

劑盒（可采用商品化DNA提取試劑盒，包括細胞核裂解液、乙二胺四乙酸二鈉溶液、裂解

緩沖液、洗脫液、DNA純化柱等）、DNA提取試劑盒（應在-20°C下保存，使用時置冰上操

作）、引物溶液（用無菌雙蒸水將上述引物溶解至10μmol/L）、DL1000DNA分子量標準溶

液（DL1000DNA分子量標準溶液經(jīng)凝膠電泳后應出現(xiàn)100bp、200bp、300bp、400bp、500

bp和1000bp大小的指示條帶）、50×TAE電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、當歸對照藥材粉末、

20mg/mL蛋白酶K溶液、10mg/mL核糖核酸酶A（RNA酶A）溶液、SmlI限制性內(nèi)切酶、

10×限制性內(nèi)切酶緩沖液（應根據(jù)不同限制性內(nèi)切酶選擇對應的限制性內(nèi)切酶緩沖液）、核

酸凝膠染色劑GelRed（10mg/mL或10000×）、2%瓊脂糖凝膠

50×TAE電泳緩沖液配制方法：在800mL去離子水中溶解242gTris，37.2g乙二胺四乙

酸二鈉（Na2EDTA·2H2O），加入57.1mL的醋酸，充分混勻，加去離子水定容至1L，室溫

保存，使用時用去離子水50倍稀釋?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。

6×上樣緩沖液配制方法：在80mL去離子水中溶解溴酚藍0.25g，二甲苯氰FF0.25g，蔗

糖40g，加水定容至100mL，分裝?；蚴褂猛纫?guī)格商業(yè)產(chǎn)品。

2%瓊脂糖凝膠配制方法：參照《中華人民共和國藥典》四部1001進行配制。取瓊脂糖

2.0g適量，加入電泳緩沖液100mL，加熱使溶脹完全，加人適量核酸染色劑，混勻，倒入

插有鯊魚齒梳的模具中，待凝膠結成無氣泡的均勻薄層，即得。

A.3適用范圍

本標準不適用于正偽混合樣品的鑒定。

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附錄B

（資料性）

當歸配方顆粒PCR反應體系的建立

B.1當歸PCR-RFLP鑒別引物設計

通過測序及從GenBank數(shù)據(jù)庫查找正品當歸及當歸常見混偽品（獨活Angelica

pubescens、白芷Angelicadahurica、前胡Peucedanumpraeruptorum、歐當歸Levisticum

officinale、及當歸屬其他物種）ITS序列。用BioEdit軟件進行序列比較，找到當歸特異性

SNP位點，該位點位于SmlI識別位點（CTYRAG）上，當歸可被酶切成短片段，當歸混偽

品不具有該識別序列，無法酶切，并設計相應鑒別引物Danggui-224F：5'-

CTCGTGGAGCTGTACTGGTA-3'和Danggui-224R：5'-GGTAGTCCCGCCTGACCT-3',PCR

擴增并使用SmlI內(nèi)切酶進行酶切后（即聚合酶鏈式反應-限制性內(nèi)切酶酶切長度多態(tài)性圖譜，

PCR-RFLP），當歸可被酶切成為162bp和62bp的短片段，當歸混偽品無法擴增不具有該

識別序列，無法酶切，依然保留224bp條帶或因無法擴增而無條帶。引物設計如圖1所示。

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圖1當歸特異性酶切鑒定引物設計

B.2聚合酶對PCR鑒別結果的影響

選擇不同公司的Taq酶及其Mix進行測試，包括2×T5SuperPCRMix（北京擎科新業(yè)

生物技術有限公司）、2×M5SuperFastTaqPCRMasterMix（聚合美生物有限公司）、

MightyAmpDNAPolymeraseVer.2（Takara生物科技有限公司）、2×TransStart?FastPfuFly

PCRSuperMix（全式金生物技術有限公司）進行測試。2×M5SuperFastTaqPCRMasterMix

和MightyAmpDNAPolymeraseVer.2在當歸藥材、當歸配方顆粒浸膏、當歸配方顆粒中均能

擴增出224bp的單一條帶，2×TransStart?FastPfuFlyPCRSuperMix無法從配方顆粒DNA

中擴增出條帶，2×T5SuperPCRMix擴增條帶較弱，難以進行下游酶切鑒別操作，選擇2×M5

SuperFastTaqPCRMasterMix進行后續(xù)研究（圖2）。

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圖2不同聚合酶種類對當歸PCR擴增結果的影響

M：Trans2KDNAMarker；As：當歸；AsE：當歸配方顆粒浸膏；AsG：當歸配方顆粒；Lo：

歐當歸；Ad：白芷；Pp：前胡；Ap：獨活；Asp：野當歸；Ls：藁本；N：空白對照

B.3方法的適用性考察

采用標準中所述體系對不同來源的當歸配方顆粒進行鑒定，當歸配方顆粒均可酶切獲得

約160bp特異性鑒別條帶，混偽品配方顆粒在相應位置上均無擴增條帶(圖3，圖4)。

圖3不同企業(yè)、批次當歸配方顆粒鑒定結果

M：Trans2KDNAMarker；1-3：當歸配方顆粒浸膏；4-24：當歸配方顆粒。

圖4不同企業(yè)、批次當歸配方顆?；靷纹疯b定結果

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M：Trans2KDNAMarker；1：當歸藥材；2：當歸配方顆粒；3-6：獨活配方顆粒；7-9：前

胡配方顆粒；10-12：白芷配方顆粒；13-15：藁本配方顆粒；N：空白對照。

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參考文獻

[1]聚合酶鏈式反應法通則起草組.《中國藥典》聚合酶鏈式反應法的建立[J].中國中藥

雜志,2020,45(19):4537-4544.

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目次

前言...........................................................................................................錯誤!未定義書簽。

目錄...........................................................................................................錯誤!未定義書簽。

1.范圍..............................................................................................................................................1

2.規(guī)范性引用文件..........................................................................................................................1

3.術語和定義..................................................................................................................................1

4.儀器設備......................................................................................................................................1

5.試劑..........................................................................................................................................1

6.鑒別引物序列..............................................................................................................................1

7.檢驗程序......................................................................................................................................2

8.結果判定......................................................................................................................................4

9.結果報告......................................................................................................................................4

10.質量保證....................................................................................................................................4

11.廢棄物處理................................................................................................................................4

附錄A...............................................................................................................................................5

附錄B...............................................................................................................................................6

參考文獻.........................................................................................................................................10

I

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當歸配方顆粒PCR鑒別

1.范圍

本標準規(guī)定了使用PCR鑒別當歸配方顆粒的通用方法和要求。

本標準適用于當歸配方顆粒的鑒別。

2.規(guī)范性引用文件

下列文件對本標準的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用

于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用本標準。

《中華人民共和國藥典》

GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》

GB/T27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》

T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》

3.術語和定義

下列術語和定義適用于本標準。

3.1

當歸配方顆粒dangguipeifangkeli

為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根經(jīng)炮制并按標準湯劑的主要

質量指標加工制成的配方顆粒。

4.儀器設備

應符合規(guī)范性附錄A的要求。

5.試劑

應符合規(guī)范性附錄A的要求。

6.鑒別引物序列

Danggui-224F：5'-CTCGTGGAGCTGTACTGGTA-3'

1

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Danggui-224R：5'-GGTAGTCCCGCCTGACCT-3'。

7.檢驗程序

為防止交叉污染，收樣、取樣、粉碎、DNA提取、核酸擴增與產(chǎn)物檢測應在不同操作

間或在同一操作間不同隔離區(qū)域進行，進入各區(qū)域應嚴格按照單一方向進行，即樣品制備區(qū)

→核酸制備區(qū)→擴增區(qū)→檢測區(qū)。

7.1取樣

送檢樣品總量應不低于10g，每批分為3等份，1/3供實驗室分析用，另1/3供復核用，其

余1/3留樣保存。收樣時應檢查包裝的完整性，并在樣品袋上貼上標簽，填寫采集數(shù)據(jù)表。

對商品包裝和送樣說明進行拍照記錄，照片隨樣品一起備檔。送檢樣品抽樣方法參照《中華

人民共和國藥典》四部通則0211進行取樣。

7.2DNA提取

送檢樣品DNA提取步驟如下：

a)取樣品1g，粉碎成粉末。

b)取上述粉末0.02g，置2mL離心管中，加入細胞核裂解液300μL、乙二胺四乙酸

二鈉溶液50μL、蛋白酶K溶液20μL、RNA酶A溶液5μL，充分渦旋震蕩混勻3min，

56℃下水浴60min。

c)離心（12000×g）5min后，吸取上清液250μL至一新的2mL離心管中，加入裂

解緩沖液250μL，混勻，轉移至純化柱，將純化柱放入離心機，離心（12000×g）5min；

棄去濾過液。

d)往純化柱中加入洗脫液700μL，離心（12000×g）1min。

e)重復步驟d）2次。

f)棄去濾過液，再離心（12000×g）2min，取出純化柱，室溫放置2min，晾干吸附

材料中的剩余洗脫液。

g)將純化柱換入一個新的2mL離心管，向吸附膜的中央懸空滴加無菌雙蒸水100μL，

靜置3min，離心（12000×g）2min，取濾過液的上清液，作為供試品溶液，可置-20℃

下保存?zhèn)溆谩?/p>

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除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取試樣DNA。

7.3PCR擴增

首次使用本方法時，應校對PCR儀溫控準確性，并使用陽性對照和陰性對照以核對使

用的TaqDNA聚合酶或PCR預混液的適用性。

7.3.1對照試驗

送檢樣品應平行檢測2次，并設置陽性對照（使用當歸對照藥材，按7.2提取DNA，

所獲的液體作為PCR擴增的陽性對照）、陰性對照（可選擇白芷對照藥材，按7.2提取DNA，

所獲的液體作為PCR擴增的陰性對照）和空白對照。

7.3.2PCR反應體系

在200μL離心管中依次加入2×M5SuperFastTaqPCRMasterMixPCR預混液12.5μL、

引物溶液（含正向和反向引物）各0.4μL、模板DNA（10ng~50ng）3μL，用無菌雙蒸水

補足反應體積至25μL。將反應液振蕩混勻，瞬時離心。

7.3.3PCR反應參數(shù)

將離心管置于PCR儀中，PCR反應參數(shù)為：95°C預變性5min，循環(huán)反應40次(95°C

30s,60°C30s,72°C30s),72°C延伸5min。PCR反應結束后，取出離心管，對反應產(chǎn)物

按7.5進行檢測。

或置4°C下保存。

7.4限制性內(nèi)切酶酶切

在200μL離心管中依次加入PCR反應產(chǎn)物溶液25μL、10×限制性內(nèi)切酶緩沖液3μL，

SmlI限制性內(nèi)切酶0.5μL，用無菌雙蒸水補足反應體積至30μL。將反應液振蕩混勻，瞬時

離心。將離心管置PCR儀，55°C保溫60min，取出離心，對反應產(chǎn)物進行檢測或置4°C

下保存。

7.5擴增/酶切產(chǎn)物檢測

配制2%瓊脂糖凝膠，膠中加入適量核酸染料GelRed。取送檢樣品、陽性對照、陰性

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對照及空白對照的酶切反應各1μL產(chǎn)物，分別加入6×上樣緩沖液各5μL，混勻，分別上

樣于同一瓊脂糖凝膠上，DL1000DNA分子量標準溶液上樣量為2μL（0.5μg/μL）。按《中

華人民共和國藥典》四部通則1001“瓊脂糖凝膠電泳法（核酸檢測用）”試驗。電泳結束后，

取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

8.結果判定

在陰性對照、陽性對照和空白對照結果符合規(guī)定的情況下，供試品凝膠電泳圖譜中，在

與對照藥材凝膠電泳圖譜相應的位置上，在100~200bp間有單一DNA條帶者為陽性，否則為

陰性結果。

9.結果報告

9.1一般要求

檢測結果應表示為陽性或陰性，陽性和陰性分別用“+”和“-”符號表示。

9.2檢測報告

樣品經(jīng)檢測后，實驗室應根據(jù)實驗的具體操作程序和結果做好詳細的實驗記錄，出具檢

測報告。檢測報告包含的基本內(nèi)容應參照T/CACM010-2016《中藥分子鑒定通則》的要求。

10.質量保證

兩份平行樣檢測結果應一致。當一份送檢樣品的結果為陽性，另一份為陰性時，要重新

測試。可以適當增加核酸擴增反應體系中DNA模板量，使兩份試樣得到同樣的結果。平行

樣本檢測結果不一致時應檢測模板DNA的質量，確保提取的DNA片段大于擴增片段。如果

經(jīng)過兩次以上從核酸提取開始的重復檢測，檢測結果不一致，可在測試報告中表述該實驗室

樣品的測試結果為陰性，并注明定量檢測和定性檢測方法的檢測低限。進行PCR反應前，應

確認所使用的聚合酶符合本標準的要求。

11.廢棄物處理

檢測過程中的廢棄物處理應符合GB/T27403《實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測》

的要求。

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附錄A

（規(guī)范性）

為執(zhí)行本包括本標準，以下儀器、試劑必不可少：

A.1儀器設備

離心機(離心機最高重力離心力應≥12000×g)、金屬浴（應可放置2mL離心管，也可使

用水浴鍋替代）、制冰機、渦旋振蕩器、高壓滅菌鍋、PCR儀（使用前應進行溫度校準、電

泳儀及其附件（應包括水平電泳槽、制膠器、鯊魚齒梳等）、凝膠成像儀（或紫外透射儀等

凝膠觀察設備）、核酸蛋白儀、電子天平（感量0.01g）、連續(xù)可調微量移液槍（至少應該包

括2.5μL、10μL、200μL、1000μL等4種不同規(guī)格，并包括配套一次性吸頭）、低溫冰箱

（溫度可維持在4°C及-20°C）

A.2試劑與試藥

除另有規(guī)定外，實驗試劑為不含DNA和DNase的分析純或生化試劑；實驗用水符合GB/T

6682的要求；所配制的試劑均應滅菌后保存，并在容器上注明試劑名稱、濃度、