組織病理學(xué)制片技術(shù)課件

Notice1.上課請關(guān)〔或調(diào)成振動，接到室外〕。2.選修課自愿選擇，試聽一次，下次課班長提交選修課學(xué)生名單(包括email)。3.學(xué)分問題⑴平時表現(xiàn)如：紀(jì)律、問答、作業(yè)。⑵結(jié)課測驗?⑶對本課程的意見和建議；生命科學(xué)研究中心邢立強2目的和要求

AimsandRequirements病理學(xué)常用的觀察手段

Thecommonsurveymeansinpathology1、大體標(biāo)本觀察：主要用肉眼、量尺及各種衡器等輔助工具，對所檢標(biāo)本的大小、形狀、色澤、重量、外表及切面、病灶特點進(jìn)行觀察及測量。2、組織切片的觀察：取正?；虿∽兘M織進(jìn)行切片、染色(HE染色最常用)在顯微鏡下進(jìn)行觀察。病理學(xué)標(biāo)本的種類

Typesofpathologicsamples3、尸體解剖(Autopsy)：通過尸檢可查出病因和病變，及時發(fā)現(xiàn)和確診某些傳染病、新發(fā)現(xiàn)的疾病，積累經(jīng)驗，提高診療水平。4、動物實驗(Animalexperiment)：根據(jù)研究需要，在動物身上復(fù)制人類某些疾病的模型、進(jìn)行觀察研究，了解疾病的病因、發(fā)病機(jī)制及藥物療效等。5、組織/細(xì)胞培養(yǎng)(TissueandCellculture)：將某種組織或單細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，來研究各種病因作用下組織、細(xì)胞的病理變化及治療效果。取材(Samplecollection)→固定(Fixation)→脫水(Dehydration)→透明(Transparentizing)→浸蠟(Paraffinsoaking)→包埋(Embedding)第一節(jié)組織處理

Tissueprocessing

1.人為因素

2.標(biāo)本大小

3.取材時間

4.包埋方向

5.邊緣標(biāo)記一、取材(Samplescollection)6.小標(biāo)本的處理方法7.特殊情況取材8.取材數(shù)量9.去除多余成分10.重復(fù)取材11.核對取材12.剩余組織存放二、固定(Fixation)〔二〕常用的固定方法1.浸泡固定法2.灌注固定法3.細(xì)胞涂片的固定方法4.微波固定法5.蒸氣固定法〔三〕常用的固定液1.單純固定液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸(picricacid)

(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(aceticacid)

2.混合固定液(1)Bouin液：用于結(jié)締組織及脂肪染色；(2)Zenker液：常用于三色染色；(3)4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉-氫氧化鈉液；〔四〕固定后的處理1.一般固定液(甲醛等)固定組織后，用流水沖洗以去除組織內(nèi)的固定液終止固定。2.含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，組織固定后不需要或不能用水沖洗。3.含有鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸的固定液，組織固定后應(yīng)充分水洗，一般為12~24h。4.用含汞的固定液固定組織后，要進(jìn)行脫汞處理，可在組織脫水前或切片染色前進(jìn)行，一般多在染色前脫汞。其方法為切片脫蠟入水后，入0.5%碘乙醇5~10min，水洗后再入3%~5%硫代硫酸鈉或95%乙醇1~2min，再充分水洗，蒸餾水洗后進(jìn)行染色?！参濉彻潭〞r的本卷須知1.標(biāo)本應(yīng)新鮮并及時取材，快速放入固定液中。特殊標(biāo)本應(yīng)單獨固定和存放。2.固定液的用量一般固定液用量為組織塊體積的10~20倍，貴重的固定液不少于3~5倍。防止組織緊貼容器底部，影響固定效果。對于特殊染色的組織(如神經(jīng)染色及酶組織化學(xué)染色等)固定時應(yīng)考慮組織塊的大小、固定液種類、固定時間和溫度等。酶組織化學(xué)染色組織的固定應(yīng)置于冰箱4℃固定。3.防止組織變形柔軟或較薄的組織先平鋪在吸水紙上，再投入固定劑中；含氣或脂肪多的組織易浮于液面，可在組織外表覆蓋棉花以到達(dá)充分固定。4.固定液的穿透性一般固定液在24h內(nèi)不能穿透厚度大于2~3mm的實體組織或5mm的多孔疏松組織，故取材組織塊的厚度原那么上不應(yīng)超過3~4mm。5.固定時間固定的時間與固定液的種類、組織類型、塊大小、溫度等有關(guān)。一般1.5cm×1.5cm×0.2~0.3cm大小的組織塊,固定時間為12~24h。6.固定溫度大多數(shù)可在室溫(25℃)固定，在低溫(如4℃)固定時，固定時間要相應(yīng)延長。三、脫水(Dehydration)組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混溶。因此在浸蠟和包埋前，必須進(jìn)行脫水。常見的脫水劑有乙醇、正丁醇、丙酮等。為防止水份喪失過快，造成組織變形，一般采用梯度脫水法。也就是使脫水劑的濃度逐漸升高，脫水過程盡量緩和，減少組織變形。四、透明(Transparentizing)五、浸蠟(Paraffinwaxsoaking)用熔化的切片石蠟逐漸替換組織中二甲苯的過程。六、組織的包埋和包埋方法(Embedding)〔一〕常規(guī)石蠟包埋〔二〕脫落細(xì)胞標(biāo)本的包埋〔三〕微小標(biāo)本的包埋第二節(jié)組織切片法

(Tissuesectioning)

石蠟切片機(jī)震動切片機(jī)恒冷箱切片機(jī)切片刀切片刀是切片機(jī)的重要部件，常見的有兩種：一種為可重復(fù)使用的鋼刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、20～24cm等，根據(jù)切片刀的形態(tài)，有平凹型、深平凹型、平楔型、雙凹型。

另一種為一次性鋼刀片，是一種薄型切片刀片，用于普通石蠟切片。使用時固定在特制的刀架上。各種切片刀的剖面圖a平凹形

b深平凹形

c平楔形

d雙凹形石蠟切片機(jī)用一次性鋼刀片二、組織切片(Tissuesectioning)石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用、最普遍的一種方法。(一)切片前的準(zhǔn)備1.備齊常用器具,如玻片、毛筆和鉛筆或刻字筆。2.檢查切片機(jī)的工作狀態(tài),將固件都擰緊，檢查切片刀是否鋒利,切片刀質(zhì)量是保證切片的關(guān)鍵。如果使用一次性刀片,應(yīng)根據(jù)切片情況及時調(diào)整刀刃位置。3.清潔玻片的方法〔1〕新載玻片的處理：先用清潔液浸泡12~24h,流水充分沖洗后,用蒸餾水洗3~5遍,95%酒精浸泡2h,用綢布擦干或用烘箱烤干備用。清潔液是用重鉻酸鉀和濃硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下幾種配方：①重鉻酸鉀(g):濃硫酸(ml):蒸餾水(ml)=1:1:10;②重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:3:25;③重鉻酸鉀:濃硫酸:蒸餾水=2:5:15?！?〕蓋玻片的處理：蓋玻片可按以上方法處理，但因蓋玻片很薄，以上處理程序應(yīng)縮短。清潔液浸泡2h，流水沖洗。也可用以下方法清洗:蓋玻片立排于臥式染缸(排2行，中間隔以載玻片)。松緊度以玻片可輕松轉(zhuǎn)動為好，以下步驟應(yīng)保持液體進(jìn)入每個玻片間隙，玻片之間不能有氣泡。用1%鹽酸酒精浸泡2h，然后流水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗數(shù)次。入95%酒精浸泡2~3h，無水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60℃烘箱烤干備用?！捕城衅谱鬟^程1.蠟塊在冰箱中預(yù)冷，然后固定在切片機(jī)上。將切片刀裝在刀架上。調(diào)整蠟塊與刀的位置，使蠟塊切面與刀刃接近。2.切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，使用時左手執(zhí)毛筆，右手旋轉(zhuǎn)切片機(jī)轉(zhuǎn)輪。先修出標(biāo)本，直到組織全部暴露于切面為止，標(biāo)本過小時修塊應(yīng)多加注意，大標(biāo)本要切全。切出蠟帶后，用毛筆輕輕挑起一端，用鑷子夾起另一端，正面向上放入展片水槽中(水溫一般低于蠟熔點10~12℃)，待切片展平后，即可進(jìn)行撈片。3.切片時刀是由下向上運動，為得到完整的切片，防止組織出現(xiàn)刀紋裂縫，應(yīng)將組織硬脆難切的局部放在上端(如皮膚組織的表皮局部，胃腸等組織的漿膜面等)。4.撈片時注意組織片的擺放位置，盡量整齊美觀。要留出貼標(biāo)簽的空間，5.撈片時注意在切片和玻片之間不要留有氣泡。撈好的切片應(yīng)在60℃左右烤箱內(nèi)烤至少30min。以防染色時脫片?！踩呈炃衅谱鲿r的本卷須知(Attentions)1.組織的取材和固定；2.組織脫水、透明和浸蠟；3.切片組織塊固定不牢時；4.切片刀和切片機(jī)；5.特殊要求切片的制作。第三節(jié)冰凍切片法

(Frozensectioning)冰凍切片可用于新鮮組織、甲醛固定的組織和低溫冰箱冷藏的組織塊等。已固定的組織塊經(jīng)流水沖洗后再進(jìn)行切片。一、冰凍切片法〔一〕恒冷箱切片機(jī)提前開機(jī)預(yù)冷，一般工作溫度設(shè)定在-22℃左右。待刀臺、樣品臺和箱內(nèi)到達(dá)設(shè)置溫度后即可切片。順序如下：①將組織用OCT粘在樣品托后放置在速凍臺上；②組織凍結(jié)后，將樣品托固定到樣品臺上；③調(diào)整組織切面與刀刃位置，初步修出組織切面后，放下防卷板，關(guān)閉觀察窗，開始切片。④切出的切片粘貼到載玻片上，直接凍存或吹干固定?！捕嘲雽?dǎo)體制冷切片機(jī)二、冰凍組織的取材及保存方法2.干冰-丙酮法：將組織塊放入盛有OCT包埋劑的標(biāo)本盒內(nèi)，使組織塊完全浸沒。將丙酮倒入盛有10g干冰的保溫杯調(diào)成糊狀。將裝有組織塊的標(biāo)本盒放入保溫杯，待包埋劑成白色凍塊時，取出如上法保存。此法組織速凍快，組織結(jié)構(gòu)保存好。3.異戊烷-液氮法：此法的優(yōu)點可防止冰晶破壞組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對含水較多的組織適宜用此法進(jìn)行速凍。先用甲基纖維素包埋組織塊。將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯或冰壺內(nèi)，攪拌異戊烷待杯底出現(xiàn)一層白色糊狀物時，放入包埋好的組織塊，數(shù)秒鐘即可取出，按上述方法保存。〔三〕本卷須知1.液氮速凍時，標(biāo)本盒不能直接浸入液氮，以免組織膨脹破碎。2.速凍的包埋劑應(yīng)適量。3.新鮮組織不能放入-10℃冰箱內(nèi)緩慢冷卻，否那么組織內(nèi)水分可逐漸析出形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞。4.冷凍后的組織塊應(yīng)密封保存，防止失水。5.在組織塊復(fù)溫時，應(yīng)在37℃加溫速融，自然復(fù)溫將造成組織結(jié)構(gòu)破壞。脫落細(xì)胞標(biāo)本包括：胸水、腹水、尿液、腦脊液穿刺液和一些涂片、刷片及印片的細(xì)胞，在臨床上具有非常重要的診斷價值。(二)穿刺液沉淀法常用于淋巴結(jié)、軟組織、肝、腎和肺等，穿剌液少，可直接涂片，細(xì)胞盡量涂均勻。穿刺液多，細(xì)胞豐富，可置離心管內(nèi)，以500rpm低速離心5~l0min，棄上清，將沉淀制成細(xì)胞懸液(2×105細(xì)胞/ml)。涂片鏡檢,以細(xì)胞較密不重疊為好?？菰锖蠊潭?。胸水、腹水、尿液和腦脊液等如細(xì)胞較少時，也可用此方法制片。此法細(xì)胞保存好，操作簡單。注意涂片時，盡量涂均勻。(三)單核細(xì)胞別離法主要用于外周血和胸腹水中淋巴細(xì)胞的別離。如為血性胸腹水，經(jīng)上述方法別離淋巴細(xì)胞然后在37℃培養(yǎng)30min，離心沉淀取上清，制成濃度為2×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，吸50μl涂片，略干后固定l0min。2024/4/1533.推片：取一張邊緣光滑的載片。將其一端置于血滴前方，向后移動到接觸血滴，使血液均勻分散在推片與載片的接觸處。然后使推片與載片呈30°~40°角，向另一端平穩(wěn)地推出。涂片推好后，通過搖擺使之快速枯燥。4.染色：用特種玻璃鉛筆在血膜兩側(cè)畫兩條線，防止染液外溢。再將瑞氏染液(伊紅-亞甲基藍(lán))滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染半分鐘。加等量蒸餾水(或緩沖液)與染液混合再染5分鐘。最后用蒸餾水把染液沖掉，用吸水紙吸干，自然枯燥后，即可觀察?！捕潮揪眄氈罴?xì)胞標(biāo)本制備中玻片的清洗：新玻片常有游離堿,因此應(yīng)用清洗液或10%鹽酸浸泡24h,然后再徹底清洗。用過的玻片可放入適量肥皂水或合成洗滌劑的清水中煮沸20min,再用熱水將肥皂和血膜洗去，用自來水反復(fù)沖洗,必要時再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或烤干備用。一張良好的血片，要求厚薄適宜，頭體尾清楚，分布均勻，邊緣整齊，兩側(cè)留有空隙。血片制好后最好立即固定染色，以免細(xì)胞溶解和發(fā)生退行性變。三、活細(xì)胞標(biāo)本的制備多用于科研，用于常規(guī)病理診斷的較少。標(biāo)本主要來源于建株的培養(yǎng)細(xì)胞，短期培養(yǎng)細(xì)胞和外周血等。細(xì)胞可直接培養(yǎng)在蓋玻片上，固定后即可進(jìn)行染色觀察或進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色或掃描電鏡標(biāo)本制備。也可培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板內(nèi)，制成細(xì)胞懸液，收集一定的細(xì)胞還可進(jìn)行涂片?？梢越?jīng)離心后，進(jìn)行透射電鏡標(biāo)本制備。謝謝大家！2024/4/158脫落細(xì)胞學(xué)檢查病理學(xué)形態(tài)觀察的一種更為精確的定量標(biāo)準(zhǔn)和方法。主要應(yīng)用于核形態(tài)參數(shù)的測定(如核