實(shí)驗(yàn)七：植物染色體壓片的技術(shù)

實(shí)驗(yàn)七

植物有絲分裂染色體壓片技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康蘑倭私庵参锛?xì)胞周期中染色體的動態(tài)變化②學(xué)習(xí)植物染色體壓片方法的基本技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理有絲分裂是體細(xì)胞分裂的主要方式，一般發(fā)生在植物根尖或莖尖的分生組織中。在有絲分裂時(shí)，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)有很大的變化，但以細(xì)胞核內(nèi)染色體的變化最為明顯，而且是有規(guī)律地進(jìn)行。各種生物染色體在數(shù)目上和形態(tài)上是相對恒定的，并隨科屬種的不同而具有一定的特征。洋蔥和大蒜體細(xì)胞中有8對共16條染色體，在有絲分裂過程中，每個(gè)染色體能復(fù)制一份，然后分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，所以兩個(gè)子細(xì)胞與母細(xì)胞所含的染色體在數(shù)目、形態(tài)和性質(zhì)上都是相同的。在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，人們常常需要了解某一物種的染色體數(shù)目，而最有效的方法就是觀察細(xì)胞有絲分裂的中期，這樣能得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

（一）實(shí)驗(yàn)材料

大蒜（Aillumsativum）根尖

洋蔥（Aillumcepa）根尖蠶豆（Viciafaba）根尖。（二）實(shí)驗(yàn)器具

顯微鏡、培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、溫度計(jì)、鑷子、解剖針、刀片、載玻片、蓋玻片、燒杯、量筒、滴瓶、大培養(yǎng)皿、紗布、吸水紙、鉛筆、吸管等等。（三）藥品試劑

卡諾氏固定液（甲醇或95%乙醇3份，冰醋酸1份）、改良苯酚品紅染色液、0.002M8-羥基喹啉水溶液、0.05—0.2%秋水仙素溶液、對二氯苯飽和水溶液、1NHCl、95%乙醇、正丁醇、加拿大樹膠。三、實(shí)驗(yàn)材料、器具與試劑四、實(shí)驗(yàn)方法（一）材料準(zhǔn)備

選取大蒜或洋蔥放在培養(yǎng)盤或燒杯中，使幼根長出后，在20～25℃繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)根尖長1～3cm時(shí)，即可以進(jìn)行預(yù)處理。（二）預(yù)處理

為利于有絲分裂中染色體的觀察和計(jì)數(shù)，固定之前進(jìn)行預(yù)處理，這樣可改變細(xì)胞質(zhì)的粘度，抑制或破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散等。一般在分裂高峰前處理1.5小時(shí)以上，方法如下：1．秋水仙素水溶液常用濃度為0.05～0.2%，室溫下處理2～4小時(shí)。對抑制紡錘體活動的效果明顯，易于獲得較多的中期分裂相，并且染色體收縮較直，有利于對染色體結(jié)構(gòu)的研究。2．對二氯苯飽和水溶液室溫下處理3～5小時(shí)，對阻止紡錘體活動和縮短染色體效果也較好，對染色體小而多的植物中，計(jì)數(shù)染色體制片效果最好。3．低溫處理將材料如小麥，浸入蒸餾水內(nèi)，放置到1～4℃冰箱中（玉米及水稻6～8℃）處理20～24小時(shí)，也起到良好的效果。時(shí)間一般為上午7～9時(shí)，固定保存方法同上。植物名稱

染色體數(shù)(2n）

處理因素

處理時(shí)間

溫度

效果*

小麥

42

0.2%秋水仙素水溶液

9:00-11:00

25℃

+++

小麥

42

對二氯苯飽和水溶液

10:00-14:00

室溫

+++

小黑麥

56

對二氯苯飽和水溶液

10:00-14:00

室溫

+++大蒜

豌豆16

14

對二氯苯飽和水溶液

8:30-11:30

室溫

+++

煙草

48

對二氯苯飽和水溶液

8:30-11:30

室溫

+++

蠶豆

12

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

20:00-23:00

室溫

+++

洋蔥

16

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

7:30-11:30

15℃

+++

大麥

14

0.05～0.1%秋水仙素水溶液

8:00-11:00

25℃不同材料采用不同預(yù)處理方法獲得的效果

*+++優(yōu)++良。

（三）固定

通常采用的是卡諾氏固定液。目的是用化學(xué)的方法把細(xì)胞迅速殺死，使蛋白質(zhì)變性，并盡量保持原來的分裂狀態(tài)，同時(shí)更易于著色。固定時(shí)，將根尖投入固定液中室溫處理4～24小時(shí)。材料若不及時(shí)用，可經(jīng)過90%酒精和70%酒精浸洗一次，再換入新的70%酒精中，置于冰箱內(nèi)0～4℃保存?zhèn)溆?。（四）解離

目的是使分生組織細(xì)胞之間的果膠質(zhì)層解掉，并使細(xì)胞壁軟化，便于壓片。解離的時(shí)間視根尖的粗細(xì)老嫩不同而有差異。方法是：將固定后（或保存后）的根尖分裝到試管內(nèi)，用清水洗幾次，吸干水，加入1NHCl溶液，在60℃下水解8～20min（大蒜用8min，洋蔥用8min，蠶豆側(cè)根用10min，玉米用20min），解離成功的根尖，分生組織發(fā)白，伸長區(qū)已呈半透明，似爛狀。解離后的根尖用水輕洗2～3次，以利于著色。（五）染色、壓片

制片時(shí)，取一根尖放在潔凈的載玻片上，用刀片切取1mm左右的生長區(qū)，其余部分棄掉，滴加改良苯酚品紅染色液染色10分鐘左右，加蓋玻片。用鑷子在材料的地方輕壓幾下，使生長區(qū)的細(xì)胞分散開來，再在蓋玻片上覆蓋一層吸水紙，用解剖針或鉛筆上的橡皮頭敲擊根尖部位，重復(fù)幾次，力一次比一次大，以蓋玻片不破裂為準(zhǔn)。（六）觀察

將制好的標(biāo)