醫(yī)學細胞生物學-細胞工程-課件

第十四章細胞工程第十四章細胞工程1細胞工程（cellengineering）:也稱細胞技術。指在細胞水平上，采用細胞生物學、發(fā)育生物學、遺傳學及分子生物學等學科的理論與方法，按照人們的意愿來改變細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得具有產(chǎn)業(yè)化價值的細胞相關產(chǎn)品的一門綜合技術體系.廣義細胞工程微生物細胞工程植物細胞工程動物細胞工程細胞工程（cellengineering）:也稱細胞技術。2精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結(jié)一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件4第一節(jié)主要相關技術基因操作細胞的遺傳修飾細胞的表型分析工程化細胞的應用第一節(jié)主要相關技術基因操作細胞的遺傳修飾細胞的表型分析51）微載體（microcarrier）基質(zhì)材料：交聯(lián)葡聚糖1g交聯(lián)葡聚糖提供6000cm2附著面積微載體是大規(guī)模培養(yǎng)方法中最有使用價值的支持物。一、

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(一)基本策略1.增加培養(yǎng)容積2.增加細胞的附著面積1）微載體（microcarrier）一、動物細胞大規(guī)模培62）中空纖維（hollowfiber）管壁半透性，細胞附于管外壁，管內(nèi)可供培養(yǎng)液通過。有利于分泌型表達蛋白的純化，但不易放大培養(yǎng)。3）微膠囊（microcapsule）半透性膜囊，細胞長于內(nèi)壁。微囊顆粒需要自行制備，無商業(yè)購買途徑。細胞密度大、產(chǎn)物在單位體積中濃度高、分離純化簡單。2）中空纖維（hollowfiber）3）微膠囊（micr73、抑制細胞的凋亡在生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)（如疫苗、抗體等）的大規(guī)模細胞培養(yǎng)中宜用無血清培養(yǎng)：避免血清中的蛋白質(zhì)對目的蛋白純化的影響。延長G1期或促使細胞停于G0期，使細胞較長時間維持在高密度狀態(tài)，利于產(chǎn)生更多目的產(chǎn)物。

降低細胞死亡率，避免死亡細胞的蛋白酶釋放至培養(yǎng)基導致目的蛋白降解。4、無血清培養(yǎng)：延長G1期，或促使細胞停于G0期，細胞活力正常，可有效抑制凋亡。3、抑制細胞的凋亡在生產(chǎn)特定蛋白質(zhì)（如疫苗、抗體等）的大規(guī)模8（二）基本培養(yǎng)系統(tǒng)傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：不銹鋼發(fā)酵罐（高度：直徑=1：1~3：1）和攪拌器，產(chǎn)生氣泡易引起機械損傷。旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：模擬失重狀態(tài)，有效降低機械損傷，應用面廣。1.懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)（二）基本培養(yǎng)系統(tǒng)傳統(tǒng)懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)：不銹鋼發(fā)酵罐（高度：直徑92.氣流驅(qū)動培養(yǎng)系統(tǒng)主要優(yōu)勢在于簡化設計，因為不需要攪拌器中的發(fā)動機和攪拌裝置。3.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)：微載體與攪拌懸浮培養(yǎng)相結(jié)合的培養(yǎng)系統(tǒng)。4.灌注培養(yǎng)系統(tǒng)：能自動地將“舊”的培養(yǎng)液排除，同時自動地將新的培養(yǎng)液以相同速率補入到細胞生長的容器中。2.氣流驅(qū)動培養(yǎng)系統(tǒng)主要優(yōu)勢在于簡化設計，因為不需要攪拌器10細胞的基本生長特征：（三）影響大規(guī)模細胞生長的因素：潛伏期對數(shù)生長期平臺期細胞的基本生長特征：（三）影響大規(guī)模細胞生長的因素：潛伏期對11優(yōu)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)量化評估指標：1）考慮細胞密度、生存能力、有絲分裂指數(shù)、一般形態(tài)及破碎數(shù)量的信息；2）采用檢測生化指標來判斷。葡萄糖和乳酸鹽的濃度可以反映培養(yǎng)液的質(zhì)量情況；乳酸脫氫酶可以判斷細胞損傷或破碎情況。優(yōu)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)量化評估指標：12利用顯微注射裝置，將一個細胞的核移植入另一個去核細胞中，已得到重組細胞。是克隆的關鍵技術。二、

細胞核移植（nucleartransfer）利用顯微注射裝置，將一個細胞的核移植入另一個去核細胞中，已得13醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件14（一）技術路線1.細胞質(zhì)的選擇：受精卵、處于MII期的卵母細胞，可以使植入細胞核的基因組行為發(fā)生重編程（regrogramming），從而去分化恢復全能性狀態(tài)。2.供核細胞的選擇：胚胎細胞、未分化的原始生殖細胞、胚胎干細胞、胎兒體細胞、成體體細胞。分化程度，克隆效率。（一）技術路線1.細胞質(zhì)的選擇：2.供核細胞的選擇：153.去核：（1）紫外線照射去核通過破壞DNA去核。損傷較大，基本棄用。（2）盲吸法去核依據(jù)MII期卵母細胞中第一極體與細胞核的對位關系，用去核針吸去第一極體及其附近胞質(zhì)，成功率約80%。3.去核：16醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件17（3）蔗糖高滲處理去核法先經(jīng)高滲蔗糖（0.3~0.9mol/L）處理，使核微凸，以去核針去除。（4）透明帶打孔去核法先以顯微針在透明帶打孔，以細胞松弛素處理后去核，提高卵母細胞存活率。（5）超速離心法（3）蔗糖高滲處理去核法184.重構(gòu)胚的構(gòu)建：直接將供核細胞移植到MII期卵母細胞/受精卵透明帶下，經(jīng)細胞融合實現(xiàn)重組—已應用于多種家畜。取供核細胞核直接注入已去核的受體細胞質(zhì)—多用于克隆小鼠。4.重構(gòu)胚的構(gòu)建：195.重構(gòu)胚的激活（1）化學激活（2）電激活處理后能夠卵裂則表明激活成功。6.重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植培養(yǎng)發(fā)育至囊胚或桑葚胚期后，方移植入子宮。5.重構(gòu)胚的激活6.重構(gòu)胚的培養(yǎng)與移植20（二）不同供核細胞的核移植1.胚胎細胞核移植：童第周（1902-1979）中國的“克隆先驅(qū)”（二）不同供核細胞的核移植1.胚胎細胞核移植：童第周（1921Megan&MoragfromEnglish目前核移植已成功：兩棲類、魚類、昆蟲、哺乳動物目前核移植未成功：爬行類、鳥類Megan&MoragfromEnglish目222.體細胞核移植：1962，非洲爪蟾Dolly，1997，RoslinInstitute2.體細胞核移植：1962，非洲爪蟾Dolly，1997，23體細胞核移植的成功，證明高度分化的成體細胞核仍具發(fā)育全能性，能在成熟卵母細胞中實現(xiàn)重編程，發(fā)育為完整個體。MII期的卵母細胞中含大量MPF，可誘導供體核發(fā)生一系列早熟變化，尤其易使S期細胞核出現(xiàn)染色體異常，對G1期染色體損害較小。選取G0或G1期細胞為核供體，選MPF水平低時的卵母細胞為受體。體細胞核移植的成功，證明高度分化的成體細胞核仍具發(fā)育全能性，24三、

基因轉(zhuǎn)移目的基因需通過特定載體（如質(zhì)粒、病毒載體等）攜帶進入細胞。三、基因轉(zhuǎn)移目的基因需通過特定載體（如質(zhì)粒、病毒載體等）攜25（1）電穿孔法：以脈沖電場使細胞膜產(chǎn)生細小空洞，使外源DNA進入細胞質(zhì)。（2）顯微注射法：將DNA直接注入細胞，多用于制備轉(zhuǎn)基因動物。優(yōu)點：不含病毒基因組片段缺點：基因隨機整合于染色體，易導致受體細胞基因滅活或轉(zhuǎn)化基因不表達。1.物理轉(zhuǎn)化法（1）電穿孔法：以脈沖電場使細胞膜產(chǎn)生細小空洞，使外源DNA262.化學轉(zhuǎn)化法（1）脂質(zhì)體包埋法脂質(zhì)體包裹DNA，通過與受體細胞膜融合使DNA片段進入細胞。（2）磷酸鈣共沉淀法DNA與磷酸鈣形成共沉淀顆粒，吸附于細胞表面，通過胞飲作用進入細胞。（3）DEAE-葡聚糖吸附法2.化學轉(zhuǎn)化法（1）脂質(zhì)體包埋法27通過病毒感染的方式導入外源基因。病毒載體為缺陷型病毒，感染后將基因組轉(zhuǎn)入細胞，無法產(chǎn)生包裝的病毒顆粒。常用：腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。3.生物學方法通過病毒感染的方式導入外源基因。3.生物學方法28醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件29第二節(jié)動物細胞工程的應用一.醫(yī)用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)1.單克隆抗體一種B淋巴細胞能接受一種抗原決定簇的刺激，分化繁殖成為可分泌相應抗體的克隆系。大量B淋巴細胞可分泌出識別許多抗原決定簇的抗體。單克隆抗體：來源于單個B淋巴細胞的抗體，只能識別一種特定抗原決定簇。第二節(jié)動物細胞工程的應用一.醫(yī)用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)1.30單克隆抗體制備技術（B淋巴細胞雜交瘤技術）：將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合形成雜交瘤細胞，用于制備單克隆抗體。所獲得的雜交瘤細胞既具有腫瘤細胞無限生長的特性，又具有B淋巴細胞分泌抗體的能力。單克隆抗體的優(yōu)點：專一性、均質(zhì)性、靈敏性以及無限量制備的可能性。單克隆抗體制備技術（B淋巴細胞雜交瘤技術）：將骨髓瘤細胞與31單克隆抗體的制備過程應用價值：作為體外診斷試劑。作為體內(nèi)診斷試劑，用作腫瘤定位等。作為導向藥物的載體：單克隆抗體上連接抗癌藥物等,特異地治療癌癥等疾病。-----生物導彈單克隆抗體的制備過程應用價值：作為體外診斷試劑。-----生32由于微生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾系統(tǒng)，因此許多復雜人體蛋白必須用真核動物細胞表達。如：溶血栓藥物--組織型纖溶酶原激活劑（tPA）血友病藥物—凝血因子VIII促紅細胞生成素—治療腫瘤化療或腎臟疾病導致的紅細胞減少癥2.復雜人體蛋白質(zhì)由于微生物缺乏蛋白質(zhì)翻譯后的加工修飾系統(tǒng)，因此許多復雜人體33二.基因工程動物的產(chǎn)生基因工程動物轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）基因剔除動物（geneknockoutanimal）二.基因工程動物的產(chǎn)生基因工程動物轉(zhuǎn)基因動物基因剔除動物341、疾病動物模型目前已有多種遺傳疾病的模型小鼠，是研究人類疾病的有利工具。2、動物生物反應器（bioreactor）主要用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)，如：乳腺生物反應器3、人類移植用器官通過遺傳改造減少排斥。1、疾病動物模型2、動物生物反應器（bioreactor）335醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件36醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件37醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件38醫(yī)學細胞生物學--細胞工程--ppt課件39三.基于細胞的組織工程組織工程皮膚組織工程膀胱將體外培養(yǎng)的功能細胞植入患者體內(nèi)，以代償病變細胞所喪失的功能。還可先將體外細胞進行遺傳修飾，再用于治療四.細胞治療三.基于細胞的組織