熒光定量核酸檢測技術(shù)

關(guān)于熒光定量核酸檢測技術(shù)主要表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物分析手段落后：

瓊脂糖凝膠電泳法只能判斷產(chǎn)物片段大小，并不能鑒別產(chǎn)物特異性。造成傳統(tǒng)PCR檢測缺點非特異性難以判斷、假陽性多和重復(fù)性差等。實驗室管理制度落后；人員培訓(xùn)水平落后；國內(nèi)PCR市場存在的問題第2頁,共36頁，2024年2月25日，星期天反相膜雜交技術(shù)

復(fù)星微孔板雜交技術(shù)

復(fù)星、華美、復(fù)華、浩源、錦宏熒光PCR技術(shù)

復(fù)星、達安、匹基國內(nèi)發(fā)展的核酸檢測新技術(shù)第3頁,共36頁，2024年2月25日，星期天反相膜雜交技術(shù)原理首先將特異性探針交聯(lián)在固相載體膜上，這時載體膜以及膜上的探針相當(dāng)于固定相，當(dāng)膜條的一端與帶有雜交反應(yīng)物的液面接觸時，帶有生物素標(biāo)記的基因片段、標(biāo)記酶、酶底物依次通過這個固定點時，其表現(xiàn)的效應(yīng)行為類似于過濾或者是親和層析，這時探針有機會與流動相中的靶序列充分作用特異性結(jié)合（雜交），再經(jīng)過酶顯色最終顯示出藍紫色斑點。第4頁,共36頁，2024年2月25日，星期天反相膜雜交原理示意圖第5頁,共36頁，2024年2月25日，星期天主要優(yōu)點：1.操作簡便；2.無特殊設(shè)備要求；

3.適合于分型；4.結(jié)果可原始保存。主要缺點：只能進行半定量操作第6頁,共36頁，2024年2月25日，星期天微孔板雜交技術(shù)原理具體來講，用生物素（Biotin）標(biāo)記的PCR擴增產(chǎn)物，與固定在酶標(biāo)板上的鏈霉親合素（Streptavidin，SA）結(jié)合，再與抗原標(biāo)記的特異性HBV探針進行正向法雜交。產(chǎn)物通過探針連接的抗體酶識別基團和標(biāo)記堿性磷酸酶的抗體特異結(jié)合后，酶催化底物，在酶標(biāo)板中顯出顏色，通過酶標(biāo)儀讀取光吸收值。第7頁,共36頁，2024年2月25日，星期天微孔板雜交技術(shù)原理示意圖第8頁,共36頁，2024年2月25日，星期天主要優(yōu)點：

1.雜交部分操作類似于ELISA，實驗人員較熟悉；

2.可向全自動過度；

3.可定量操作。主要缺點：

1.分型困難；

2.試劑成本較高；

3.操作較復(fù)雜。第9頁,共36頁，2024年2月25日，星期天熒光PCR技術(shù)原理熒光PCR試劑比常規(guī)PCR試劑多一個寡聚核苷酸探針，這個探針帶有一個熒光發(fā)光分子和一個熒光淬滅分子，完整的探針在激發(fā)光激發(fā)下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光被淬滅分子全部吸收，樣品無熒光。而PCR過程中。Taq酶分子在鏈延長過程中可以通過自身的5’3’核酸外切酶降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使得熒光發(fā)光分子從探針上切下來而與熒光淬滅分子分開，從而在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生特定波長的熒光，這種熒光隨著PCR擴增過程而動態(tài)增強。第10頁,共36頁，2024年2月25日，星期天熒光PCR技術(shù)原理示意圖第11頁,共36頁，2024年2月25日，星期天主要優(yōu)點：

1.能對靶基因進行定量檢測；

2.在封閉狀態(tài)下進行產(chǎn)物檢測，減少了污染機會。主要缺點：

1.儀器設(shè)備昂貴，不利于推廣；

2.分型困難。第12頁,共36頁，2024年2月25日，星期天核酸檢測實驗室的設(shè)置為了防止由標(biāo)本（微生物或非微生物）和靶核酸模板以及經(jīng)PCR擴增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核酸檢測實驗室中應(yīng)設(shè)置三個專用的實驗室。前PCR區(qū)1（試劑配制實驗室）

用途：該實驗室是無臨床標(biāo)本和無核酸污染區(qū)，用于配制各類試劑及設(shè)置PCR擴增反應(yīng)管無（靶核酸模板）。

基本設(shè)備：1.實驗應(yīng)有紫外燈；2.PCR防污染罩；

3.冰箱（4℃，-20℃）；4.臺式小型高速離心機、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；5.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；6.專用文具用品；7.實驗桌椅（實驗臺臺面防酸、防堿和耐熱）；8.自來水設(shè)備第13頁,共36頁，2024年2月25日，星期天前PCR區(qū)2（標(biāo)本制備實驗室）用途：該實驗室用于分離和抽提病原微生物中的核酸，防止因標(biāo)本處理而引起的實驗室感染和檢測的交叉污染?；驹O(shè)備：1.實驗室應(yīng)有紫外燈；2.超凈臺或PCR防污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4.高壓滅菌器(處理傳染性標(biāo)本和物品)；5.高速和低速離心機、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；6.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；7.專用文具用品；8.救護藥箱，包括外傷用藥，眼睛沖洗液等；9.實驗桌椅（實驗臺臺面防酸、防堿和耐熱）；10.電話機（備有關(guān)臨床醫(yī)生的電話號碼，以便因突發(fā)事件及時聯(lián)系）；11.自來水設(shè)備。第14頁,共36頁，2024年2月25日，星期天后PCR區(qū)（擴增和分析實驗室）用途:該實驗室用進行PCR擴增和PCR擴增產(chǎn)物的各類分析操作。

基本設(shè)備：1.實驗室應(yīng)設(shè)有紫外燈；2.各類PCR擴增儀；3.電泳儀、電泳槽、紫外分析儀；4.照相設(shè)備或凝膠分析系統(tǒng)；5.臺式小型高速離心機、孵育箱（水浴或恒溫）；6.冰箱（4℃、-20℃）；7.微波爐；8. 配套移液器（若干）；9.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴。10. 電腦和專用文具用品、救護藥箱；11.實驗桌椅（實驗臺臺面防酸、防堿和耐熱）；12. 自來水設(shè)備;13.其他儀器：根據(jù)檢測方法不同而定。第15頁,共36頁，2024年2月25日，星期天定量技術(shù)比較第16頁,共36頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共36頁，2024年2月25日，星期天試劑盒的檢測靈敏度第18頁,共36頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR試劑盒檢測HBV-DNA結(jié)果

與臨床的關(guān)系第19頁,共36頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)統(tǒng)計，X2=1.15，P<0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽性組中病毒載量的差異顯著，HBVDNA和HBeAg密切相關(guān)。該定量結(jié)果能夠反映在這兩種血清學(xué)模式中病毒DNA的復(fù)制情況，對于臨床輔助診斷有重要作用。表.在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽性組中病毒載量頻數(shù)分布

第20頁,共36頁，2024年2月25日，星期天慢性肝炎患者干擾能治療過程中病毒核酸

的動態(tài)變化

上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院傳染科（200025）

羅振輝厲惠莉高健張東華摘要：本文采用探針雜交定量檢測HBV-DNA，動態(tài)檢測了15例慢性乙肝患者干擾能治療前、后和治療過程中的HBV-DNA的變化，除見干擾能抑制病毒復(fù)制的作用外，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。干擾能療效的個體差異甚大，似和機體感染的嚴重程度及自身的清除能力有關(guān)，HBV-DNA的動態(tài)檢測，結(jié)合eAg和ALT的變化，可有助于決定適當(dāng)?shù)膭┝亢秃侠淼寞煶?。?1頁,共36頁，2024年2月25日，星期天

部分討論：15例病人中eAg均為陽性，但HBV-DNA值的差異甚大，從1.768Meq/ml到4800Meq/ml，該值更確切的反映了機體的感染狀態(tài)，其高低可能與感染的嚴重程度及病毒復(fù)制的活躍情況呈正相關(guān)；與機體免疫清除的時間和強度呈負相關(guān)。高值示感染嚴重或清除無力；反之表示感染較輕或清除強力。實驗表明HBV-DNA低值者療效較佳；無論HBV-DNA值是高是低，治療后HBV-DNA均見一定程度下降，其下降的幅度與病例的選擇；eAg的陰轉(zhuǎn)率6個月時為8/15，和國內(nèi)外諸多報告大致相似，此變化和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6個月時已有9例小于0.7Meq/ml，且見HBV-DNA的變化大多早于eAg的陰轉(zhuǎn)，一般提早2個月，個別提前4個月，可見HBV-DNA值的檢測遠較觀察eAg更敏感、更確切的反映了干擾能抗病毒的作用。第22頁,共36頁，2024年2月25日，星期天ALT的變化通常也是評估干擾能治療的重要指標(biāo)，本組病例6個月時ALT下降至正常者為11/15（73.3%），無明顯變化或升高者為4/15，此變化和HBeAg的陰轉(zhuǎn)大致吻合，但和HBV-DNA低下并非完全一致。2號病例持續(xù)用藥至8個月時ALT明顯升高，繼續(xù)減量用藥后，HBV-DNA低下，有力的說明了ALT升高是機體清除病毒的正常表現(xiàn)，故以ALT復(fù)常為評估指標(biāo)應(yīng)有辨證的觀點。結(jié)論：HBV-DNA值的變化充分反映了干擾能抑制病毒復(fù)制的作用明顯，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。對于每一病例應(yīng)具體分析，力爭以HBV-DNA值作為觀察療效的指標(biāo)，決定適當(dāng)?shù)膭┝?，反?fù)或更長的療程，也許是未來抗病毒治療的方向。第23頁,共36頁，2024年2月25日，星期天對HBV抗病毒治療的定量檢測建議針對拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測建議針對干擾素治療乙型肝炎的定量檢測建議可以研究聯(lián)合用藥，并用定量檢測來評估療效第24頁,共36頁，2024年2月25日，星期天針對拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測建議

根據(jù)《拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見》（由“拉米夫定臨床應(yīng)用專家指導(dǎo)小組”制定），我們提出了以下對乙型肝炎病人的定量檢測建議：病人的選擇：HBVDNA定量檢測；觀察項目及隨訪：血清病毒學(xué)標(biāo)志：HBeAg，抗HBe，HBVDNA，治療目標(biāo)和療效判斷：病毒學(xué)標(biāo)志改善：HBV-DNA陰轉(zhuǎn)（斑點雜交或定量法降低>2log10）;停藥標(biāo)準(zhǔn)：達顯效病人，繼續(xù)用藥3-6個月，仍為顯效者，可停藥；停藥后，繼續(xù)隨訪觀察6-12個月，每3-6個月復(fù)查HBVDNA。第25頁,共36頁，2024年2月25日，星期天丙型肝炎病毒的核酸檢測丙肝：輸血后肝炎主要原因急性期2－26周（平均7.4周） 潛伏期1－2個月酶免檢出率：1月17.4％

2－6月60－80％

1年80％病毒特點：滴度低；免疫反應(yīng)弱；變異快第26頁,共36頁，2024年2月25日，星期天HCV病毒載量監(jiān)測實驗在常規(guī)病人護理中扮演的角色開始治療改變治療方案選擇治療方案確證療效第27頁,共36頁，2024年2月25日，星期天通過監(jiān)測HCV病毒滴度反映療效WeeksMedianHCVRNA(copies/ml)第28頁,共36頁，2024年2月25日，星期天IFN-

單次給藥后HCV-1病毒滴度變

化的定量監(jiān)測N=32genomes/ml*1million第29頁,共36頁，2024年2月25日，星期天淋病雙球菌（NG）的核酸檢測標(biāo)本取材：男性：作尿道擠壓和前列腺按摩以取得尿道口分泌物女性：宮頸口分泌物診斷方法：

1、涂片染色：在中性粒細胞中尋找革蘭氏陰性的雙球菌簡便易行，但靈敏度不高，女性病人檢出率僅50%左右

2、分離培養(yǎng)：WHO推薦

培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時間長

3、ELISA檢測抗原存在交叉反應(yīng)第30頁,共36頁，2024年2月25日，星期天由于PCR具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，適用于淋病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。利用PCR可以幫助解決的主要問題有：（1）對分離培養(yǎng)的菌株進行鑒定和進一步分析。（2）提高檢測臨床標(biāo)本的陽性率和準(zhǔn)確性。（3）用于抗生素治療的療效觀察。（4）對淋球菌菌株進行分子流行病學(xué)分析。第31頁,共36頁，2024年2月25日，星期天沙眼衣原體（CT）的核酸檢測標(biāo)本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原體引起的占50%以上，健康人群約有10%感染率。診斷方法：（1）細胞培養(yǎng)繁瑣、費時，且培養(yǎng)條件不適、標(biāo)本運送不當(dāng)、標(biāo)本不足等因素均可影響檢測敏感度。（2）免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法簡便快速，但靈敏度和特異性均低于培養(yǎng)法。第32頁,共36頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用PCR檢測方法靈敏度、特異性可達94~100%，可做為臨床上各種