增強(qiáng)抗生素對(duì)獸醫(yī)臨床常見病原菌敏感性的藥物篩選及聯(lián)合用藥評(píng)價(jià)試驗(yàn)操作規(guī)范

增強(qiáng)抗生素對(duì)獸醫(yī)臨床常見病原菌敏感性的藥物篩選及聯(lián)合用藥評(píng)價(jià)試驗(yàn)操作規(guī)范本文件規(guī)定了篩選增強(qiáng)抗生素對(duì)獸醫(yī)臨床常見病原菌敏感性的藥物操作方法，操作流程及記錄要求，并對(duì)篩選出的敏感藥物與抗生素的聯(lián)合作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。本文件適用于中藥單體、中藥提取物、天然藥物活性成分、抗生素等作為增強(qiáng)抗生素對(duì)常見病原菌敏感性的藥物篩選。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑WS/T639—2018抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件?？刮⑸锼幬锩舾行栽囼?yàn)Antimicrobialsusceptibilitytesting感性，以指導(dǎo)臨床合理選用藥物的微生物學(xué)3.2最低抑菌濃度Minimalinhibitoryconcentration；MIC在瓊脂或肉湯稀釋法藥物敏感性檢測試驗(yàn)中能抑制肉眼可見的微生物生長的最低3.3分級(jí)抑菌濃度Thefractionalinhibitoryconcentration；FIC分級(jí)抑菌濃度指數(shù)FIC值在各類聯(lián)合用藥敏感菌試驗(yàn)的結(jié)果中可以作為評(píng)價(jià)和療3.4折點(diǎn)Breakpoint3.5敏感Susceptible當(dāng)抗菌藥物對(duì)分離株的MIC值處于敏感范圍時(shí)，使用推薦劑量進(jìn)行治療，該藥在感染部位通常達(dá)到的濃度可抑制被測菌的生長，4結(jié)果解釋分類實(shí)驗(yàn)室測試和報(bào)告抗菌藥物的MIC值的結(jié)果，按折點(diǎn)分為:敏感（S）、劑量依賴型敏感（SDD）、中介（I）、耐藥（R）或非敏感（NS）；實(shí)驗(yàn)室測試和報(bào)告抗菌藥物聯(lián)合抗生素增效敏感的FIC值的結(jié)果，按數(shù)值FIC≤0.5、0.5＜FIC≤1、1＜FIC≤2、2＜FIC時(shí)，其與抗生素的聯(lián)合作用分別為協(xié)同作用、相加作用、無關(guān)作用或拮抗作用；從而判定篩選的藥物為具有協(xié)同作用藥物、具有相加作用藥物、具有無關(guān)作用、具有拮抗作用藥物。5篩選試驗(yàn)方法5.1設(shè)備和材料下列設(shè)備和試劑適用于本文件。5.1.1雙人單面垂直凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)5.1.2生化培養(yǎng)箱(LRH-250F)：36℃~38℃5.1.3多功能酶標(biāo)儀(M1000Pro)5.1.4恒溫振蕩培養(yǎng)器(HZQ-X300C)5.1.5自動(dòng)立式高壓滅菌器(GI80DS)5.1.6十萬分之一電子天平(BT125D)5.1.70.22μm過濾器5.1.8可調(diào)移液器：10μL~100μL，100μL~1000μL。5.1.996孔細(xì)菌培養(yǎng)板5.2菌種和培養(yǎng)基5.2.1.1大腸桿菌EscherichiacoliATCC25922。5.2.1.2金黃色葡萄球菌StaphylococcusAureusATCC29213。5.2.1.2沙門氏菌SalmonellaATCC140285.2.2培養(yǎng)基保存、傳代、增菌用LB固體和液體培養(yǎng)基，藥敏篩選用MH固體或液體培養(yǎng)基[1]。5.2.2.1保存及傳代用細(xì)菌培養(yǎng)基；按照附錄A.1配置。5.2.2.2增菌用液體培養(yǎng)基；按照附錄A.2配置。5.2.2.3增菌用固體培養(yǎng)基；按照附錄A.3配置。5.2.2.4檢定用培養(yǎng)基；按照附錄A.3配置。5.3試劑制備和保存本方法所用化學(xué)試劑為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水，試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682的規(guī)定。5.3.1試樣制備協(xié)同增效劑候選藥物儲(chǔ)備液制備：將粉末狀抗菌藥物溶于無菌水或適當(dāng)?shù)娜軇┲泻筮^濾除菌，使其貯存濃度為5120μg/mL。貯存液最低制備濃度為1280μg/mL，最大試驗(yàn)濃度為32μg/L。5.3.2試樣保存協(xié)同增效劑候選藥物儲(chǔ)備液于-80℃保存。5.3.3測定方法5.3.3.1方法提要利用協(xié)同增效劑候選藥物對(duì)敏感菌的MIC值來判別是否對(duì)病原菌具有抑制作用，再利用棋盤微量肉湯稀釋法得到的FIC值判別協(xié)同增效劑候選藥物與抗生素的聯(lián)合作用，并據(jù)此判定協(xié)同增效劑候選藥物是否能夠作為抗生素的協(xié)同增效劑。5.3.3.1.1細(xì)菌的培養(yǎng)、分離和鑒定病原菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定按GB4789.4-2016、GB/T4789.6-2016、GB4789.10-2016和GB/T4789.28等進(jìn)行。經(jīng)鑒定后的臨床菌株移種到MH平板上，36℃~38℃培養(yǎng)18~24h。若不能即時(shí)進(jìn)行敏感性測定，應(yīng)置0℃~4℃冰箱保存。耐藥性測定前傳代。5.3.3.1.2增效劑候選藥物工作液制備取一管增效劑候選藥物，提前半小時(shí)于4℃中自然升溫融化，在超凈工作臺(tái)中稀釋制備1024μg/ml藥物工作液。同時(shí)測定溶劑的抑菌情況即為溶劑對(duì)照。5.3.3.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株的細(xì)菌菌懸液制備用接種環(huán)挑取3個(gè)～5個(gè)左右MH瓊脂培養(yǎng)皿上的單菌落至滅菌的PBS溶液或生理鹽水（0.9%NaCl）中，用濁度儀調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?=1×108CFU/mL)然后用無菌PBS溶液或生理鹽水在干凈的培養(yǎng)皿中按1：100稀釋菌懸液，即得到約含1×106CFU/ml的菌液，為防止菌液時(shí)間過長發(fā)生濃度變化應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，在15min接種完畢。5.3.3.1.4MIC檢測用96孔微量稀釋板的制備采用微量稀釋法檢測最小抑菌濃度（MIC）值。在接種懸浮液制備好30min內(nèi)，在每孔含有100μL稀釋好的藥物的微量稀釋板中，向每孔中加入100μL細(xì)菌懸浮液（終濃度為5×105CFU/ml）。確保設(shè)有陽性對(duì)照(細(xì)菌懸浮液)、陰性對(duì)照(MH肉湯）、溶劑對(duì)照，中藥活性單體檢測可加抗生素對(duì)照；耐藥菌株檢測時(shí)每次檢測須同時(shí)做質(zhì)控菌株對(duì)照。將接種過的96孔板置于36℃~38℃培養(yǎng)箱中孵育18h～24h，讀數(shù)。對(duì)于一些生長緩慢的菌株，在24h～30h時(shí)讀取。5.3.3.1.5增效劑候選物及抗生素的最小抑制濃度判讀在確定生長終點(diǎn)時(shí)，以無肉眼可見的細(xì)菌生長孔濃度為該藥的MIC值。只有在生長對(duì)照孔的細(xì)菌有足夠生長(≥2mm紐扣狀沉淀或絕對(duì)的濁度且質(zhì)控菌MIC在范圍內(nèi)，陰性對(duì)照澄清透亮，測定視為有效。每個(gè)孔中細(xì)菌生長的程度均應(yīng)與陽性對(duì)照孔進(jìn)行對(duì)比，能夠明細(xì)抑制細(xì)菌生長的最小藥物濃度認(rèn)定為該增效劑候選物對(duì)該細(xì)菌的最小抑菌濃度。5.3.3.1.6增效劑候選物與抗生素聯(lián)合作用檢測選取有效增效劑進(jìn)行與抗生素聯(lián)合作用的測試。每塊96孔板最多可測試2個(gè)化合物，重復(fù)三次。具體操作如下：采用棋盤法進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。以各菌株單藥MIC值確定稀釋濃度，最高終濃度為MIC值的2倍，使用滅菌MH肉湯倍比稀釋，一般取6個(gè)～8個(gè)稀釋度左右，兩種藥物在一次性96孔U型板上橫縱聯(lián)合。將制備好的菌液依次加入藥物孔中，設(shè)置陽性對(duì)照孔為菌液對(duì)照組，陰性對(duì)照為空白肉湯，單藥需設(shè)置兩組平行試驗(yàn)。密封后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24h后觀察記錄結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)2次。質(zhì)控菌株與供試菌株同法操作。菌液最終接種濃度5x105CFU/mL。5.3.3.1.7檢測結(jié)果的判定和報(bào)告通過計(jì)算兩種藥物的部分抑菌指數(shù)（FIC）判斷相互作用。FIC=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)應(yīng)用甲藥時(shí)MIC+聯(lián)合應(yīng)用乙藥時(shí)MIC/單獨(dú)應(yīng)用乙藥時(shí)MIC；當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，判定甲、乙兩藥具有協(xié)同作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物可以作為抗生素的協(xié)同增效劑；當(dāng)0.5＜FIC≤1時(shí)，判定甲、乙兩藥具有相加作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物可以作為抗生素的增效劑；當(dāng)1＜FIC≤2時(shí)，判定甲、乙兩藥具有無關(guān)作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物不適合作用抗生素的增效劑候選藥物；當(dāng)2＜FIC時(shí)，判定甲、乙兩藥具有拮抗作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物不適合作用抗生素的增效劑候選藥物。5.3.3.1.8臨床細(xì)菌菌懸液的制備用接種環(huán)挑取5個(gè)～10個(gè)左右37℃過夜培養(yǎng)的MH瓊脂培養(yǎng)皿上的單菌落至生理鹽水（0.9%NaCl）中，用濁度儀調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?=1×108CFU/mL)然后將生理鹽水稀釋的菌液用無菌MH肉湯在干凈的培養(yǎng)皿中按1：100稀釋菌懸液，即得到約含1×106CFU/mL的菌液，待用。5.3.3.1.9檢測用96孔微量稀釋板的制備參考方法5.3.3.1.3采用微量稀釋法初篩出具有協(xié)同和增效作用的增效劑候選藥物和抗生素分別對(duì)臨床病原菌的MIC值。5.3.3.1.10增效劑候選物及抗生素的最小抑制濃度判讀在確定生長終點(diǎn)時(shí)，以無肉眼可見的細(xì)菌生長孔濃度為該藥的MIC值。只有在生長對(duì)照孔的細(xì)菌有足夠生長(≥2mm紐扣狀沉淀或絕對(duì)的濁度且質(zhì)控菌MIC在范圍內(nèi)，陰性對(duì)照澄清透亮，測定視為有效。每個(gè)孔中細(xì)菌生長的程度均應(yīng)與陽性對(duì)照孔進(jìn)行對(duì)比，能夠明細(xì)抑制細(xì)菌生長的最小藥物濃度認(rèn)定為該增效劑候選物對(duì)該細(xì)菌的最小抑菌濃度。如相關(guān)設(shè)備可以識(shí)別孔內(nèi)微生物的生長情況，也可使用其讀取微量稀釋試驗(yàn)結(jié)果和記錄結(jié)果。5.3.3.1.11增效劑候選物與抗生素聯(lián)合作用檢測根據(jù)初篩出具有協(xié)同和增效作用的增效劑候選藥物和抗生素對(duì)臨床病原菌的MIC值進(jìn)行聯(lián)合作用的檢測。每塊96孔板最多可測試2個(gè)化合物，重復(fù)三次。具體操作如下：橫縱兩條邊線先再梯度稀釋單獨(dú)的增效劑候選物和抗生素制板驗(yàn)證單用時(shí)MIC值，后每種藥物最高從2倍MIC濃度開始，使用滅菌MH肉湯倍比稀釋，一般取6個(gè)～8個(gè)稀釋度左右，各取50μL分別排列在平板的行與列上，然后在加入100μL菌液，是最終接種量在5x105CFU/mL,過夜培養(yǎng)，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。5.3.3.1.12檢測結(jié)果的判定和報(bào)告通過計(jì)算部分抑菌指數(shù)（FIC）判斷相互作用。FIC=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)應(yīng)用甲藥時(shí)MIC+聯(lián)合應(yīng)用乙藥時(shí)MIC/單獨(dú)應(yīng)用乙藥時(shí)MIC；當(dāng)FIC≤0.5時(shí)，判定甲、乙兩藥具有協(xié)同作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物可以作為抗生素的協(xié)同增效劑；當(dāng)0.5＜FIC≤1時(shí)，判定甲、乙兩藥具有相加作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物可以作為抗生素的增效劑；當(dāng)1＜FIC≤2時(shí)，判定甲、乙兩藥具有無關(guān)左右，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物不適合作用抗生素的增效劑候選藥物；當(dāng)2＜FIC時(shí)，判定甲、乙兩藥具有拮抗作用，當(dāng)甲、乙兩藥分別為增效劑候選藥物和抗生素時(shí)，增效劑候選藥物不適合作用抗生素的增效劑候選藥物。5.4結(jié)果及判斷同時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株菌均具有協(xié)同增效作用的增效劑候選藥物和抗生素組合可以判定為該增效劑候選藥物可以作為該抗生素對(duì)病原菌的協(xié)同增效劑，且兩者聯(lián)合具有協(xié)同增效作用。6各種屬細(xì)菌藥敏試驗(yàn)敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件臨床常見快速生長非苛養(yǎng)菌、常見苛養(yǎng)菌、不常見菌、潛在生物恐怖病原菌、諾卡菌屬和其他需氧放線菌、厭氧菌的藥敏試驗(yàn)方法和試驗(yàn)條件參考標(biāo)準(zhǔn)WS/T639—2018《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求》。常見菌各種屬細(xì)菌藥敏折點(diǎn)參照參考文獻(xiàn)[1]。7記錄要求7.1所有記錄應(yīng)統(tǒng)一規(guī)范，記錄不得涂改和偽造。7.2原始記錄應(yīng)詳細(xì)、清楚、真實(shí)、準(zhǔn)確，并具有可追溯性，保存期不少于3年。參考文獻(xiàn)駱延波，等.EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[M],北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016,(03)17-18.A.1保存及傳代用細(xì)菌培養(yǎng)基胰蛋白胨酵母浸粉氯化鈉瓊脂蒸餾水A1.2制法（規(guī)范性）培養(yǎng)