蛋白質(zhì)雜交技術(shù)

關(guān)于蛋白質(zhì)雜交技術(shù)檢測DNA可用Southern印跡法檢測RNA可用Northern印跡法檢測蛋白質(zhì)同樣有蛋白質(zhì)印跡法（Western印跡法）蛋白質(zhì)印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用抗體與附著于固相支持物上的靶蛋白發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天待測樣品經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）被轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物以非共價鍵的形式吸附蛋白質(zhì)以固相支持物上的蛋白質(zhì)為抗原，與對應(yīng)的抗體發(fā)生特異性的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體發(fā)生反應(yīng)經(jīng)過底物顯色或放射自顯影，以檢測電泳分離的靶蛋白。一、原理第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Western印跡有SDS的高分辨力固相免疫測定的高特異性和敏感性，可測出1ng～5ng中等大小的蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總是在變性的條件下進(jìn)行，因此，不存在溶解、聚集以及靶蛋白與外來蛋白的共沉淀等問題。還具有簡便、標(biāo)本可長期保存、結(jié)果便于比較等優(yōu)點。

第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（一）蛋白提取試劑1．細(xì)胞裂解液

20mmol/LTris(pH7.5)150mmol/LNaCl1%TritonX-100焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，EDTA，正釩酸鈉(Na3VO4)亮抑肽素等多種蛋白酶抑制劑二、試劑第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2×蛋白上樣緩沖液100mmol/LTris·Cl(pH6.8)200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）

4%SDS(十二烷基硫酸鈉)0.2%溴酚藍(lán)20%甘油第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（二）SDS試劑1．30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺30g、雙丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，過濾后貯于褐色瓶中低溫保存，可用一個月。2．Tris緩沖液（1）1.5mol/LTris(pH8.8)/積層膠緩沖液：Tris堿18.17g，用HCl調(diào)pH8.8，加水至100ml。（2）1.0mol/LTris(pH6.8)分離膠緩沖液：Tris堿12.11g，用HCl調(diào)pH6.8，加水至100ml。

第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3．10%SDS

可用去離子水配成貯存液保存于室溫。4．10%過硫酸胺

過硫酸胺提供丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量的貯存液并保存于4℃冰箱中。由于過硫酸胺會緩慢分解，故應(yīng)隔周重新配制。第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天5．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）通過催化過硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。6．Tris-甘氨酸電泳緩沖液配成10×貯存液備用，在900ml去離子水中溶解30gTris堿和144g甘氨酸，然后加入10gSDS，用HCl調(diào)pH至8.3，用去離子水補至1000ml。使用前用去離子水稀釋成1×應(yīng)用液。第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（三）轉(zhuǎn)膜緩沖液

39mmol/L甘氨酸

48mmol/LTris堿

0.037%SDS20%甲醇第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（四）染色液與脫色液1．考馬斯亮藍(lán)R250染液

100mg考馬斯亮藍(lán)R250溶于40ml乙醇，加10ml冰醋酸，補水至100ml。2．考馬斯亮藍(lán)脫色液

40ml乙醇，加10ml冰醋酸，補水至100ml。3．麗春紅S貯存液2g麗春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加水至100ml。使用時，將1份上述貯存液加9份去離子水即為麗春紅S應(yīng)用液，使用后應(yīng)廢棄。第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（五）封閉液5％脫脂奶粉0.01%防沫劑A0.02%疊氮鈉溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（一）樣品前處理細(xì)菌一般直接用蛋白上樣緩沖液裂解；真核細(xì)胞或哺乳動物組織通常加細(xì)胞裂解液，機械或超聲波室溫勻漿0.5min～1min。4℃10,000g～13,000g離心5min，取上清按照每4μl蛋白樣品加入1μl5×蛋白上樣緩沖液的比例混合。100℃水浴加熱3min～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫，上樣到SDS膠加樣孔三、實驗方法第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天原理是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽離子表面活性劑SDS按重量比結(jié)合成復(fù)合物使蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)分子的遷移速率完全取決于分子量的大小，從而達(dá)到了分離不同分子量大小蛋白質(zhì)的目的

（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天膠有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后丙烯酰胺凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，形成的小孔必須能夠允許SDS蛋白復(fù)合物通過這些小孔的孔徑隨雙丙烯酰胺、丙烯酰胺比率的增加而變小，比率接近1:20時孔徑達(dá)到最小值。一般按雙丙稀酰胺、丙烯酰胺為1:29配制第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天表1SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

丙烯酰胺濃度（％）線性分離范圍（kD）1512～431016～687.536～94557～212第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1．SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制

（1）安裝玻璃板（2）確定凝膠溶液體積，按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。依次混合各成分（見下表）

一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天表2積層膠、分離膠所需溶液成分的配比溶液成分（ml）5%積層膠不同濃度的分離膠6%8%10%12%15%水3.45.34.64.03.32.330%丙稀酰胺0.832.02.73.34.05.01.5mol/LTris(pH8.8)－2.52.52.52.52.51.0mol/LTris(pH6.8)0.63－－－－－10%SDS0.050.10.10.10.10.110%過硫酸胺0.050.10.10.10.10.1TEMED0.0050.0080.0060.0040.0040.004總體積（ml）51010101010第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（3）迅速在兩板的間隙灌注丙烯酰胺溶液，留出積層膠所需空間（梳子的齒長再加1cm）。然后小心的在丙烯酰胺溶液上加一層去離子水。凝膠垂直放置于室溫下。（4）分離膠聚合完全后（約30min），傾斜倒出覆蓋的去離子水。（5）配制5%積層膠。

第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天（6）在已聚合的分離膠上直接灌注積層膠，立即在積層膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡。（7）積層膠聚合完全后（約30min），小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2．上樣和電泳取一定量樣品與上樣緩沖液混合后，加入上樣孔。將電泳槽與電源連接（正極應(yīng)接下槽），凝膠上所加的電壓為8伏/cm。當(dāng)上樣緩沖液中的染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15伏/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部（約4h），然后關(guān)閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板，取下凝膠。

第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3．考馬斯亮藍(lán)對SDS凝膠進(jìn)行染色

考馬斯亮藍(lán)染色的主要目的包括：①顯示靶蛋白在凝膠中的粗略位置，從而切去不含靶蛋白的凝膠，這樣可以節(jié)省硝酸纖維素膜；②轉(zhuǎn)膜后，凝膠染色可判斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜是否完全。第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Western印跡的固相支持體有多種：重氮苯硫醚（diazophenylthio,DPT）紙重氮芐氧甲基（diazobenzyloxymethyl,DBM）紙溴化氰活化紙氰尿酰氯紙活化尼龍膜目前最常用的是硝酸纖維素濾膜（三）蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上：凝膠及與之相貼的硝酸纖維素濾膜夾于事先用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡過的Whatman3MM濾紙之間然后把結(jié)合體夾在石墨電極板之間，硝酸纖維素濾膜朝陽極一側(cè)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移可用于室溫進(jìn)行，1.5h～2h便可完成。第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天對硝酸纖維素膜上的蛋白進(jìn)行染色判斷轉(zhuǎn)膜是否完全可供硝酸纖維素濾膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色的方法有很多種，但只有麗春紅S染色法可與免疫學(xué)檢測方法兼容，這是因為該染料只會短暫顯色而且在進(jìn)行Western印跡時被洗去。第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1．封閉濾膜的蛋白結(jié)合位點：在加入一抗之前，必須封閉可能結(jié)合的位點以降低這類非特異性結(jié)合的背景。封閉液常用脫脂奶粉將硝酸纖維素濾膜放入自封袋中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉液盡可能排除里面的氣泡，然后封閉袋口，平放在平緩的搖床平臺上室溫溫育1h～2hPBS漂洗濾膜3次，每次10min。（四）抗原抗體反應(yīng)第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2．第一抗體和靶蛋白的結(jié)合將抗體以適當(dāng)?shù)谋壤♂屖覝胤磻?yīng)1h～2hPBS漂洗濾膜3次，每次10min3．加入第二抗體加入適當(dāng)稀釋的二抗室溫反應(yīng)1h