酶活性測定的主要影響因素及控制

關(guān)于酶活性測定的主要影響因素及控制酶（enzyme）酶的應(yīng)用臨床診斷酶學(xué)產(chǎn)生至今已有100年的歷史。用于診斷的酶類已超過100多種，常用的數(shù)十種。酶測定約占目前臨床化學(xué)總工作量的1/4到1/2。酶的概念是一種由活細(xì)胞產(chǎn)生，具有高度專一性、高度催化活性的特殊蛋白質(zhì)，又稱為生物催化劑。酶的測定方法分為絕對定量法和相對定量法兩大類，以后者為主。酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力稱為酶活性（activity）。酶活性濃度的測定受許多因素的影響。第2頁,共58頁，2024年2月25日，星期天酶活性濃度測定的主要影響因素1.標(biāo)本及標(biāo)本采集和處理因素2.試劑及方法學(xué)因素3.儀器因素的影響4.測定條件與參數(shù)設(shè)置第3頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.標(biāo)本及標(biāo)本采集和處理因素

的影響及控制第4頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.標(biāo)本及采集和處理的影響因素1.1溶血1.2抗凝劑1.3溫度1.4空氣與光線1.5標(biāo)本副反應(yīng)1.6酶蛋白濃度1.7其他第5頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.1溶血最重要的影響是RBC內(nèi)酶的大量釋出。大部分酶在細(xì)胞內(nèi)外濃度差異明顯，且其活性遠(yuǎn)高于血清；如RBC內(nèi)的LD、AST和ALT活性分別較血清中高100、15和7倍左右。RBC釋放的Hb在300～500nm可見光波段能使吸光度值明顯升高，干擾分光光度計的測定。第6頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.1Hb的吸光度曲線第7頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.1溶血影響的控制減少溶血體外溶血可通過實(shí)施樣品制備技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化加以克服；分清體內(nèi)溶血與體外溶血。減少溶血的干擾可通過設(shè)置樣品對照，或使用雙波長比色、連續(xù)監(jiān)測法以及改進(jìn)商品試劑等措施，克服對分光光度分析的影響。應(yīng)用血清(溶血)指數(shù)直接判斷溶血程度。第8頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.1注意:RBC中酶的干擾不僅表現(xiàn)在溶血影響上，采血后如不及時將血清和血凝塊分離，血細(xì)胞中酶同樣可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入血清，所以，靜脈采血后，必須在1～2h內(nèi)及時離心，將血清與血細(xì)胞、血凝塊分離，以免引起誤差。第9頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.2抗凝劑臨床上除非測定與凝血或纖溶有關(guān)的酶，一般都應(yīng)以血清作為首選測定標(biāo)本。大多數(shù)抗凝劑都在一定程度上影響酶活性，EDTA、草酸鹽和檸檬酸鹽等抗凝劑，它們?yōu)榻饘匐x子螯合劑；在去除Ca2+同時也去除其中Mg2+、Mn2+等離子，Ca2+是AMY的激活劑，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷酸酶（5′-NA）的激活劑。第10頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.2肝素是一種粘多糖，是對酶活性影響最小的抗凝劑，對ALT、AST、CK、LD和ACP無影響，適于急診時迅速分離血漿進(jìn)行測定。第11頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.3溫度由于血清清蛋白對酶蛋白有穩(wěn)定作用，如無細(xì)菌污染，某些酶（如AST、

-GT和ALP等）可在室溫保存1～3天活性不受影響。有些酶極不穩(wěn)定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1h，活性可下降50%。第12頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.3貯存不同室溫體液酶的穩(wěn)定性

（活性變化小于10%）

*酶不耐融化；§與同工酶類型有關(guān)；※標(biāo)本未酸化；#標(biāo)本加枸櫞酸或醋酸至pH5第13頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.3溫度影響的控制及時檢測低溫貯存大部分酶在低溫中比較穩(wěn)定，因此當(dāng)天不能測定時，應(yīng)在血清分離后置冰箱中冷藏。第14頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.4空氣與光線血清置于空氣中時，血中CO2喪失極快，pH可在15min內(nèi)由7.4增至8.0，從而使對堿性環(huán)境敏感的ACP活性迅速下降。某些酶易受光線破壞，CK可因吸收藍(lán)光而引起酶發(fā)生不可逆地失活，其失活程度與暴光時間的長短成正比。第15頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)副反應(yīng)是指酶促反應(yīng)體系中，除待測酶反應(yīng)外，其他非待測酶和物質(zhì)引起的干擾待測酶測定的反應(yīng)。NAD（P）H是目前使用最多的指示反應(yīng)物質(zhì)。體內(nèi)存在數(shù)以百計的氧化還原酶，它們的輔酶很多是一致的。若存在內(nèi)源性代謝物，必然會相互干擾。第16頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)(酶偶聯(lián)法測ALT)由于反應(yīng)體系中含有大量NADH和LD，可與血液標(biāo)本中所含丙酮酸反應(yīng)，引起340nm波長處吸光度下降，從而引起ALT活性測定誤差。ALT活性測定的反應(yīng)式如下：第17頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.5副反應(yīng)的控制可通過加入副反應(yīng)抑制劑，或?qū)悠愤M(jìn)行預(yù)處理等方法給予排除。雙試劑底物啟動模式因不增加成本、不耗費(fèi)時間是最經(jīng)濟(jì)的方法。第18頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.6酶蛋白濃度酶蛋白在低濃度時易失活，可能是亞基易解離、易吸附于容器上和易發(fā)生表面變性之故。酶蛋白在高濃度時較穩(wěn)定，但活性過高超過檢測儀器的線性范圍時，需將樣品進(jìn)行稀釋或減少樣品用量后再行測定。樣品稀釋后所測得的活性常偏高，可能與抑制劑被稀釋有關(guān)。第19頁,共58頁，2024年2月25日，星期天1.7其他樣本器皿的質(zhì)地和潔凈度，采血部位，以及血清中過量的膽紅素、脂質(zhì)，樣品制備過程中的振搖等，均可引起酶活性改變。季節(jié)冬季氣溫低，血液凝固慢，血清分離時間延長，可引起血細(xì)胞內(nèi)酶釋至血清，加上血清與空氣長時間接觸，可使某些抑制劑遭到破壞，故冬季測定LD的活性較夏季高。第20頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.試劑及方法學(xué)因素

的影響及控制第21頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.試劑及方法學(xué)的影響因素酶的測定大多使用商品試劑盒不同廠家酶試劑盒的測定原理、試劑配方（包括緩沖液、底物、添加劑等）、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)含量等常有區(qū)別。常見的影響因素2.1

定時法與連續(xù)監(jiān)測法2.2檢測底物或檢測產(chǎn)物2.3底物啟動模式與樣品啟動模式2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)2.5試劑的干擾作用第22頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.影響因素的控制選購試劑盒時要仔細(xì)閱讀試劑盒說明書；了解試劑盒所用方法的原理、試劑配方等；選擇IFCC或中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)學(xué)會推薦的常規(guī)方法，或選擇公認(rèn)的測定方法。使用時定期對試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測；準(zhǔn)確性、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，線性范圍寬；正向型試劑空白吸光度低、反向型試劑空白吸光度高、試劑空白速率低、瓶間差小等。第23頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.酶活性測定的原理酶活性與速度的關(guān)系*酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線第24頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.1定時法與連續(xù)監(jiān)測法的選用在條件許可的情況下，應(yīng)盡可能全部采用連續(xù)監(jiān)測法，少用或不用定時法。連續(xù)監(jiān)測法可以選擇線性期的反應(yīng)速度來計算酶活性，測定結(jié)果可靠，是首選的方法。但該方法儀器要求相對較高。在基層單位，某些酶采用定時法測定也可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。ALP酶活性的測定，如加做樣品空白，兩法的結(jié)果準(zhǔn)確性相當(dāng)。第25頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.1連續(xù)監(jiān)測法與定時法

的酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線第26頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.2檢測底物或檢測產(chǎn)物的選擇取決于哪個更方便，測定的結(jié)果更準(zhǔn)確。通常原則是選擇測定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。反應(yīng)時底物濃度高，反應(yīng)時間短；這也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐漸被色素源底物所取代的原因之一。除部分測定NADH減少可以看成測底物的消耗量外，已很少采用測定底物消耗量的項(xiàng)目。第27頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.2檢測底物或檢測產(chǎn)物的選擇底物與產(chǎn)物舉例ALT測定（賴氏法-定時法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸α-丙酮酸+2，4-二硝基苯肼2，4-二硝基苯腙

(紅棕色，λ=505nm)ALT測定（連續(xù)監(jiān)測法）L-丙氨酸+α-酮戊二酸α-丙酮酸

+L-谷氨酸第28頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.3底物啟動模式與樣品啟動模式底物啟動模式（IFCC推薦采用）。指樣品先與缺乏某種底物的試劑1預(yù)孵育一定時間后，再加入內(nèi)這種底物的試劑2，開始啟動樣品中的待測酶的酶促反應(yīng)。好處是在待測酶酶促反應(yīng)開始之前，可以除去某些干擾物，包括內(nèi)源性干擾物和外源性干擾物。這種模式需要雙試劑劑型。樣品啟動模式。指反應(yīng)所需的試劑先混合在一起，然后加入樣品，依靠樣品中的待測酶來啟動酶促反應(yīng)；只是在延滯期去除部分干擾物。這種模式可采用單一試劑劑型。第29頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.3底物啟動模式與樣品啟動模式雙試劑與單試劑酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線第30頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.3需要注意某些雙試劑劑型是基于試劑穩(wěn)定性考慮，并沒有將底物單獨(dú)作為第二試劑，也起不到消除內(nèi)源性干擾的作用。第31頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)一般根據(jù)測定底物或產(chǎn)物的難易程度來決定。除原則上選擇對底物親和力大，酶轉(zhuǎn)換率高的方向外，還應(yīng)考慮內(nèi)源性干擾、底物價格和穩(wěn)定性等諸多因素。例如，CK的測定普遍采用逆向反應(yīng)，因其逆向反應(yīng)是正向反應(yīng)的6倍，而且受影響因素少。第32頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.4正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)LDH測定的選擇目前尚有爭議。國內(nèi)多采用正向反應(yīng)（L→P），與IFCC在2001年發(fā)表的操作手冊一致。正向反應(yīng)有利于LD1的活性表達(dá)，同時試劑成本低廉，穩(wěn)定性好。國外常用方法曾是逆向反應(yīng)（P→L），反應(yīng)速度是正向的3倍，成本也較低。第33頁,共58頁，2024年2月25日，星期天2.5檢測試劑的干擾作用試劑酶的污染。組織勻漿中往往含有NADH-細(xì)胞色素C還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。底物的非酶反應(yīng)。很多硝基酚的酯類衍生物在水溶液中不穩(wěn)定，放置一段時間可自行水解釋放出硝基酚。如堿性磷酸酶（ALP）測定解決的方法是通過試劑空白管檢出并加以校正。選購IFCC或中華檢驗(yàn)學(xué)會推薦的方法和質(zhì)量好的試劑。第34頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.儀器因素的影響及控制第35頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3儀器的影響因素加樣系統(tǒng)加樣的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和攜帶污染；反應(yīng)系統(tǒng)反應(yīng)杯的形狀、表面和攜帶污染；反應(yīng)杯和反應(yīng)槽溫度的準(zhǔn)確性、波動范圍；攪拌和清洗機(jī)構(gòu)的效果和攜帶污染；檢測系統(tǒng)光度計的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性范圍和雜散光等均會造成結(jié)果的偏差。第36頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3儀器影響因素的控制在日常工作中，除常規(guī)做好儀器和設(shè)備的正確使用和維護(hù)外，重點(diǎn)應(yīng)注意儀器的校準(zhǔn)問題。第37頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.1酶活性濃度的計算公式摩爾吸光系數(shù)

和系數(shù)K均為常數(shù)，

和

K受儀器諸多因素的影響，如波長的準(zhǔn)確性、半波寬的大小、比色池光徑及磨損與清潔度、溫控的準(zhǔn)確性、加樣系統(tǒng)狀況等。

和

K可用校準(zhǔn)物定期校正。第38頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.2校準(zhǔn)物可用作酶活性測定用的校準(zhǔn)物分兩類。一類是產(chǎn)物的基準(zhǔn)物質(zhì)，如對硝基酚、對硝基苯胺等，用于校準(zhǔn)儀器的值（摩爾吸光系數(shù)）。另一類稱酶校準(zhǔn)物（Enzymecalibrator），多是用人血清或動物血清作介質(zhì)，與測定標(biāo)本比較接近，用于校準(zhǔn)儀器的K值（酶活性濃度定量系數(shù)）。第39頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.2校準(zhǔn)物國際上已經(jīng)有經(jīng)IFCC認(rèn)可的CRM酶參考物。各試劑供應(yīng)商所提供的酶校正物的定值應(yīng)可溯源至CRM酶參考物。常規(guī)工作一般選用用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的工作校準(zhǔn)品。目前，臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較多的是德國寶靈曼公司的校準(zhǔn)品(c.f.a.s)。第40頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.3ε的校準(zhǔn)（340nm波長）NAD(P)H是酶活性測定中常用的指示輔酶。在340nm

的NAD(P)H的

，可用葡萄糖己糖激酶法實(shí)測、計算其實(shí)測的

。NAD(P)H的ε為6220。如果6000>ε>6600為不合格，則需找維修部檢查。注：干涉濾光片者需校準(zhǔn)，光柵式可直接使用文獻(xiàn)或試劑盒說明書的數(shù)值。第41頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.3ε的校準(zhǔn)（405nm波長）最常用的色素原為對硝基苯酚等。對硝基苯酚在405nm的，可用ALP測定試劑的緩沖液作為測定試劑，對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)液作為血清標(biāo)本，實(shí)際測定計算ε值。對硝基苯酚的ε為18700。如果ε值偏差過大，則需找維修部檢查。第42頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（公式計算法）將上述實(shí)測ε值代入K值計算公式得到校準(zhǔn)K值外。第43頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（酶校準(zhǔn)物）使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物對K值進(jìn)行校準(zhǔn)，它是國際上目前酶測定標(biāo)準(zhǔn)化新途徑。使用酶校準(zhǔn)物的優(yōu)點(diǎn)，除具有實(shí)測ε值換算出的校準(zhǔn)K值所具有的一切優(yōu)點(diǎn)外，還可促進(jìn)方法間的一致性和增加常規(guī)酶方法的可靠性，可使不同實(shí)驗(yàn)室之間的測定結(jié)果相對統(tǒng)一。第44頁,共58頁，2024年2月25日，星期天3.4K的校準(zhǔn)（頻率）最好（低）每半年進(jìn)行一次酶活性的校準(zhǔn)。儀器在使用過程中，濾光片、加樣系統(tǒng)的精度都可能發(fā)生變化，光學(xué)系統(tǒng)的燈泡、光電轉(zhuǎn)換元件的老化、靈敏度變化等，都會導(dǎo)致測定結(jié)果的偏差。但日常工作中，遇到下列情況時，必須進(jìn)行校準(zhǔn)：試劑盒改變廠家，或者更換了批號；儀器性能改變，如進(jìn)行一次大的預(yù)防性維護(hù)或者更換了重要部件；質(zhì)控反映出異常的趨勢或偏移，或者超出實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的接受限，采取一般性糾正措施后，不能識別和糾正問題時。第45頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.測定條件與參數(shù)設(shè)置第46頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.1最適條件包括①合適的底物和最適底物濃度；②理想的緩沖液種類和最適離子強(qiáng)度；③反應(yīng)液的最適pH；④最適反應(yīng)溫度；⑤合適的輔因子、激活劑濃度；⑥若是酶偶聯(lián)反應(yīng)，還需要確定指示酶和輔助酶的用量；⑦合理的測定時間，包括延滯期盡量短暫，有足夠的線性期；⑧合適的樣品與反應(yīng)試劑的比例；⑨足夠的檢測范圍；⑩盡量去除各種抑制劑等。第47頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.2反應(yīng)溫度目前常規(guī)實(shí)驗(yàn)室越來越多的使用37℃，這更多地是從實(shí)際工作方便來考慮。1986年以前，IFCC推薦酶活性測定的溫度是30℃，純鎵的熔點(diǎn)為29.77℃，鎵作為此溫度的基準(zhǔn)物質(zhì)，保證了測定儀器在30℃的高度準(zhǔn)確性。2001年，IFCC正式發(fā)表了“37℃下檢測酶催化活性濃度的IFCC一級參考方法操作手冊和參考制品認(rèn)可系統(tǒng)”，包括CK、LD、ALT、AST、GGT五個酶在內(nèi)。第48頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.2反應(yīng)溫度酶活性與酶促反應(yīng)溫度的關(guān)系第49頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.3延滯期、線性期的確定延滯期的確定延滯期可以因酶在樣品中所存在的介質(zhì)不同而略有差別，原因可能是存在內(nèi)源性干擾物，也可能存在一些抑制劑。確定原則是多觀察濃度不等、病理情況不同的標(biāo)本，選擇延滯期最長者作為確定值。線性期的確定離不開酶濃度的可測上限，因?yàn)槊笣舛仍礁?，在同樣時間內(nèi)消耗底物越多，產(chǎn)生產(chǎn)物越多，底物的不足和產(chǎn)物的抑制將導(dǎo)致非線性期的提前到來。第50頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.3延滯期、線性期的確定線性期與非線性度的大小有關(guān)，沒有絕對意義上的線性期，線性期是以指定的非線性度作為判斷基礎(chǔ)的。線性期如何確定呢？主要看讀數(shù)次數(shù)和讀數(shù)間隔來決定，為了計算非線性度，按最小二乘法的計算要求，讀數(shù)次數(shù)應(yīng)不少于4次，讀數(shù)間隔按一般儀器要求30秒就足夠了，線性期在2分鐘以上即可。中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)學(xué)會規(guī)定酶活性測定要求線性期不短于2.5分鐘。若規(guī)定線性期不短于2.5分鐘可以測得酶活性的最高濃度就是該法的測定上限。第51頁,共58頁，2024年2月25日，星期天4.3延滯期、線性期的確定單試劑與雙試劑酶促反應(yīng)時間進(jìn)程曲線第52頁,共58頁，2024