《診斷酶學》課件

第五章診斷酶學第一節(jié)概述一、酶的組成、結(jié)構(gòu)和功能1、酶的本質(zhì)和特性本質(zhì)：蛋白質(zhì)〔絕大局部〕或核酸〔極少數(shù)〕

核酶:核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反響.1982美國T.Cech和Altman于1989年共獲諾貝爾化學獎。酶的特性：極高的催化效率、高度的特異性、催化的可調(diào)節(jié)性。2、酶的結(jié)構(gòu)與功能單純酶：由約100～10000個氨基酸肽鍵相連而成酶結(jié)合酶蛋白質(zhì)——酶蛋白輔酶非蛋白局部——輔因子輔基2、酶的結(jié)構(gòu)與功能酶是蛋白質(zhì)，具有一、二、三、四級結(jié)構(gòu)

單體酶：只由一條多肽鏈構(gòu)成的酶

寡聚酶：由多個相同或不同亞基以非共價鍵連接的酶

多酶體系：在細胞內(nèi)存在著許多由幾種不同功能的酶彼此聚合而成的多酶復合物酶的活性中心酶的必需基團在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠，但在空間結(jié)構(gòu)上彼此靠近，組成具有能與底物結(jié)合并起催化反響的特定空間結(jié)構(gòu)區(qū)域，稱為酶的活性中心。對結(jié)合酶來說，輔酶或輔基參與酶活性中心的組成。二、酶的催化作用機制1、活化能2、酶降低活化能的作用機制酶通過與底物形成一種或多種中間復合物來降低反響的活化能三、酶的命名、分類與編號一、血清酶的來源根據(jù)酶的來源及其在血漿中發(fā)揮催化功能的情況，將其分為：一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細胞酶一般代謝酶組織專一酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細胞酶血清酶第二節(jié)血清酶

1、血漿特異酶主要指作為血漿蛋白的固有成分，在血漿中發(fā)揮特定的催化作用的酶，如凝血酶原。2、非血漿特異酶

這類酶在血漿中濃度很低，并且在血漿中很少發(fā)揮催化作用?？煞譃椋?/p>

①外分泌酶指來源于消化腺或其他外分泌腺的酶，如胰淀粉酶等。它們在血液中含量與相應的分泌腺的功能及疾病有關(guān)。

②細胞酶指存在于各組織細胞中進行代謝的酶類。隨著細胞的新陳代謝，有少量酶釋入血液。其中大局部無器官專一性，只有小局部來源于特定的組織，有器官專一性。這類酶細胞內(nèi)外濃度差異懸殊，病理情況下極易升高，其下降的臨床意義很少。這些酶最常用于臨床診斷，如轉(zhuǎn)氨酶、LD、CK等。

名稱

血漿特異酶

非血漿特異酶

外分泌酶細胞酶一般代謝酶組織專一酶來源肝消化腺或其它外分泌腺

各組織器官

（無器官專一性）

肝

（有器官專一性）

種類凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纖溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等

胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等

OCT等

二、血清酶的去路1、血清酶的半壽期酶失活至原來活性一半時所需時間稱為酶的半壽期。一般以半壽期來代表酶從血中去除的快慢。血清酶甚至同工酶之間半壽期差異很大。這些有助于了解同一疾病不同酶升高持續(xù)時間的差異，半壽期長的酶，在血清中持續(xù)時間長。2、血清酶的失活和排泄研究說明酶主要是在血管內(nèi)失活或分解的，酶的去除與血漿蛋白的去除途徑并不完全相同。血清酶受蛋白酶水解而產(chǎn)生的低分子多肽或氨基酸可經(jīng)小腸粘膜排至腸腔，再徹底分解成氨基酸后重吸收，其中大局部氨基酸可被組織利用，不能利用的氨基酸可經(jīng)尿排出體外。

三、血清酶變化的病理機制

正常情況下血清酶活性相對恒定。但在一些病理情況下，如細胞膜通透性增加或細胞壞死，細胞內(nèi)酶合成增加，酶排泄障礙，惡性腫瘤異位分泌，酶合成障礙，中毒及遺傳缺陷等，常導致血清中酶活性的改變。三、血清酶變化的病理機制〔一〕合成異常合成減少合成增多肝損害導致合成酶的能力受損（ChE、LCAT）酶基因變異引起酶合成減少（銅氧化酶）增生性疾?。ü趋兰膊?，ALP)惡性腫瘤（前列腺癌，ACP)酶的誘導作用（乙醇，γ-GT）(二)酶釋放增加

酶從病變(或損傷)細胞中釋放增加是疾病時大多數(shù)血清酶增高的主要機制。研究說明，炎癥、缺血／缺氧、能源供給缺乏、壞死和創(chuàng)傷等是細胞釋放大分子酶蛋白的重要原因。細胞酶的釋放量還受下述一些因素影響：1．細胞內(nèi)外酶濃度的差異2．酶的相對分子量3．酶的組織分布4．酶在細胞內(nèi)的定位和存在形式(三)酶排出異常

約有24％的血清AMY由腎臟排出，腎功能減退時，血清AMY活性升高可能因酶排泄障礙而在血液中滯留所致。膽道梗阻時，血清ALP升高的原因是梗阻區(qū)ALP合成加強，ALP排泄受阻而逆流人血。但對于大多數(shù)酶而言，并不存在酶經(jīng)腎臟或膽道排出異常而導致血清酶升高的這種去除機制。四、血清酶的生理差異1．性別:多數(shù)血清酶的男女性別差異不大，但少數(shù)酶如CK、ALP及γ-GT等有性別差異，男性高于女性。2．年齡:血清中有些酶的活性常隨年齡而變化。最明顯的一個例子是ALP3．進食:血清中大多數(shù)酶不受進食的影響，故測定酶活性不一定需要空腹采血。高脂、高糖飲食后血清ALP活性升高。4．運動:劇烈的肌肉運動可使血清中多種酶，如CK等活性升高。5．妊娠:妊娠胎盤組織可分泌一些酶進入母體血液，如耐熱ALP、LD等，引起血清中這些酶升高。6．其他:血清中有些酶與同工酶有種族差異.第三節(jié)酶促反響動力學一、酶促反響K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物復合物酶產(chǎn)物反響級數(shù)及特征一級反響：反響速率與反響物的濃度的一次方成正比。二級反響：反響速率與兩種物質(zhì)濃度的乘積成正比。零級反響：反響速率與反響物濃度無關(guān)而受它種因素影響而改變的反響?；旌霞壏错懀阂患壏磻旌霞壏磻慵壏磻猇[S]

Vmax［S］VO=Km+［S］米-曼氏方程最大反響速率底物濃度米氏常數(shù)反響速度〔一〕Km假設(shè)v=0.5Vmax，那么Km=[S]，可見Km值等于酶促反響的初速率為最大速率Vmax一半時的底物濃度。Km值一般在10-6～10-2mol／L之間。Km只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。Vmax［S］VO=Km+［S］Km意義：

Km是酶的特征性常數(shù)之一，在臨床酶學分析中具有重要意義。1．1／Km可近似地表示酶對底物的親和力的大小，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大，反之亦然。2．如果一個酶有幾種底物，那么對每一種底物各有一個特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是該酶的最適底物或天然底物。

Vmax［S］VO=Km+［S］3．如酶的Km，可計算某一底物濃度時反響速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物飽和的分數(shù)。同樣，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其Km的多少倍。4．利用工具酶來測定體液中某一成分的濃度或某一酶的催化活性濃度時，可根據(jù)米-曼氏方程或其衍變方程式來計算工具酶的用量。5．測定Km值可鑒別不同來源但催化相同反響的酶是同一種酶或是同工酶。

Vmax［S］VO=Km+［S］6．如一個酶催化正逆兩個方向，測定正逆兩個方向底物的Km及底物濃度，可大體推測該酶在體內(nèi)催化反響的方向及其催化效率。7．在代謝酶系中，當一組酶催化連續(xù)的代謝反響時，如各酶的Km及其相應底物的濃度，有助于尋找代謝的限速步驟。一般Km值最大的酶所催化的反響為該酶系的限速步驟。Vmax［S］VO=Km+［S］(二)Vmax

Vmax表示在一定酶量下的最大反響速率，即酶完全被底物飽和時的反響速度，與酶濃度呈正比。在酶的濃度不變時，對于特定底物而言，Vmax也是一個常數(shù)。

(三)Km和Vmax的測定將米－曼氏方程進行倒數(shù)處理，而轉(zhuǎn)換成直線方程為：1／Ｖmax01［Ｓ］１－Km1Ｖo斜率＝雙倒數(shù)作圖法三、酶促反響的影響因素1、酶濃度2、底物的種類和濃度3、緩沖液的種類、離子強度和pH4、溫度5、激活劑與抑制劑6、其它1、酶濃度在［S］＞＞［E］時，酶促反響隨酶濃度的增加而增加，即反響速率與酶的濃度成正比。病理情況下，酶濃度過高時，底物過早而且過多的被消耗，影響酶活性的測定，故需用生理鹽水或其它緩沖液進行適當?shù)南♂?，但要注意稀釋對測定結(jié)果的影響，如低酶濃度時，酶易解離為單體，常比多聚體更易失活。2、底物的種類和濃度一級反響零級反響一般選擇Km最小的最適底物，酶測定時底物濃度最好為Km的10～20倍。(三)緩沖液的種類、離子強度和pH酶與底物結(jié)合的能力，酶的催化活性，會受不同pH的影響，只有在最正確緩沖系統(tǒng)內(nèi)才能充分表達。各種酶都具有使酶促反響速率最大時的pH，即最適pH。一般來說，動物酶多在6.5～8.0之間。但ACP反響的最適pH為4.0～7.0而ALP那么為9.0～10.0。最適pH并非酶的特征性常數(shù)，易受緩沖液的種類、離子強度及底物濃度不同等因素影響。臨床酶學測定時發(fā)現(xiàn)，用不同種類的緩沖液配制相同pH介質(zhì)所測酶活性并不相同。緩沖液的離子強度也可影響酶的活性。必須強調(diào)的是，各種體液樣品本身也是緩沖液，和底物混合后不一定維持原來pH，也會影響酶活性測定結(jié)果，所以應嚴格掌握測定樣品與底物的用量比例，一般樣品在總體積中的比例應不超過10％。此外，緩沖液中的物質(zhì)不應與分析系統(tǒng)中的任何物質(zhì)反響，否那么應特別加以說明。(四)溫度

酶促反響也有一個最適溫度，在其兩側(cè)反響速率都比較低。在到達最適溫度以前，溫度每增加10℃，反響速率增加1～2倍。但溫度對酶活性的影響具有雙重性，一方面溫度升高可加快酶促反響；而另一方面溫度可能使酶失活。T（℃）V最適溫度人體大多數(shù)酶的最適溫度為37℃左右，超過42℃酶活性就逐漸降低，至60℃時酶因蛋白變性而失去活性。反之，酶在20℃以下時幾乎無催化反響。酶的最適溫度與底物濃度、pH、離子強度、保溫時間等許多因素有關(guān)。(五)激活劑與抑制劑臨床酶學測定中廣泛應用金屬離子等激活劑來提高測定的靈敏度。例如所有轉(zhuǎn)磷酸的酶，如激酶類和ALP的反響都需要Mg2+的參加，如在反響體系中參加EDTA等螯合劑或以其為抗凝劑常抑制一些酶的活性。測定CK活性時，參加的激活劑有Mg2+和巰基，其中Mg2+是CK的輔基，含巰基的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)使CK被激活。抑制劑所產(chǎn)生的抑制作用分為不可逆性與可逆性兩類。前者抑制劑與酶共價結(jié)合，使酶活性喪失。后者抑制劑通過非共價鍵與酶可逆性結(jié)合。在設(shè)計和選擇酶測定的方法時，應設(shè)法防止抑制劑對酶促反響的影響。1.競爭性抑制

V

=Vmax[S]

Km(1+)+[S]Ki[I][E]=[Ef]+[ES]+[EI]作用特點

：Vmax不變，Km變大，Km隨[I]的增加而增大，抑制分數(shù)與[I]成正比，與[S]成反比。通過增加底物濃度來消除或降低抑制劑的作用。2.混合性抑制

V=Vmax[S]

(Km+[S])(1+)Ki[I][E]=[Ef]+[ES]+[EI]+[ESI]作用特點

：Vmax變小，Km不變，Vmax隨[I]的增加而減小，抑制分數(shù)與[I]成正比，與[S]無關(guān)。不能通過增加底物濃度來消除或降低抑制劑的作用。3、非競爭性抑制4.反競爭性抑制[E]=[Ef]+[ES]+[ESI]V=

Vmax[S]Km+[S](1+)Ki[I]作用特點

：Vmax

和Km都變小，并且Vmax和Km隨[I]的增加而減小，抑制分數(shù)與[I]和[S]成正比，酶活性濃度概念酶活性濃度測定連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度工具酶血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化酶活性濃度的單位一、酶活性濃度的概念1.酶的特性：微量性、高效性等。直接測量非常困難（mmol/L或mg/dl）通過測定被加速化學反應的反應速率，來間接反映酶的濃度2.酶促反響SSEE+ESEPE+PV＝dsdt或V＝dpdtES

3.酶活性濃度即酶所催化的化學反響的反響速率，用酶促反響中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來計算。注意：只有當酶所催化的反響速度僅與[E]成正比，而不受其它因素影響時，即在酶促反響的零級期，才能根據(jù)酶所催化的化學反響速率來確切表示酶活性濃度的大小。但僅在上述前提下，只能在反響的零級期，即只有在酶促反響的最適條件下，才能真實地代表酶含量。因此可根據(jù)酶促反響進程曲線，采用合理的方法進行酶活性濃度的檢測。零級一級[P][S]V＝dpdt反響級數(shù)時間4.酶促反響進程延滯期線性期非線性期

LagphaseZeroorderLinearphaseFirstorder酶促反響時間進程曲線單試劑測定體系酶促反響進程曲線二、酶活性濃度測定方法〔一〕按檢測方法分類1、量氣法其原理是通過測量一封閉反響系統(tǒng)中氣體變化后的氣體體積或壓力，從而計算出氣體的變化量適用于測定在反響中產(chǎn)生或消耗氣體的酶2、分光光度法酶促反響的底物與產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不同，光吸收譜也有差異，不僅能在可見光范圍測定有色溶液的濃度，還能在紫外光波長范圍測定特異的帶有雙鍵或環(huán)狀結(jié)構(gòu)的無色物質(zhì)3、熒光法和放射性核素法通過熒光光度計測定酶促反響生成熒光物質(zhì)的速率，此速率與酶濃度成正比4、其它方法〔二〕按反響時間分類1、定時法〔取樣法、終點法、兩點法〕優(yōu)點：簡單，測定時酶促反應已被終止，故比色計或分光光度計無需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇不考慮對酶活性的影響。缺點：無法知道在整個酶促反應進程中是否都是零級反應。注意：應先做預實驗找出酶促反應速率恒定的時期，確定線性時間；保證酶和底物在所選定的溫度下作用時間要精確。定時法，早期測定酶活性濃度的方法，大多是使酶作用一段時間，然后參加強酸、強堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反響，測定這段時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計算酶促反響的平均速度。連續(xù)監(jiān)測法，即指連續(xù)測定酶促反響過程中某一產(chǎn)物或底物濃度隨時間變化的多點數(shù)據(jù)，求出酶促反響初速度，間接計算出酶活性濃度的方法。其是臨床測定酶活性濃度最常用方法。2、連續(xù)監(jiān)測法〔動力學法、速率法〕優(yōu)點：容易找到直線區(qū)域，選擇線性反響期來計算酶活性，不需終止反響。缺點：線性反響期因酶種類和反響條件而異，必須用實驗方法進行確定，必須選取酶促反響的最適反響條件，需要有可以連續(xù)監(jiān)測的設(shè)備。3、平衡法目前臨床應用較少，通過測定酶促反響開始至反響到達平衡時產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求出酶活性濃度的方法。三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度〔一〕種類1.直接法不終止酶促反響條件下，直接通過測定反響體系中底物或產(chǎn)物理化性質(zhì)的變化〔如：A、熒光、旋光性，pH、電導率、粘度等〕，從而計算出酶活性濃度。評價方法簡單，但只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)方面有顯著性差異時，才能使用直接法，只有很少一局部酶能用直接法測定。

〔1〕目前以分光光度法最為廣泛，利用340nm處吸光度的變化測定各種脫氫酶。NAD(P)++H+NAD(P)H

僅在260nm處有吸收峰

在260、340nm處有吸收峰340nm處A的變化可以反映反響體系中NAD(P)H量的增減，進而反映酶活性濃度。〔2〕利用一類人工合成的所謂色原性底物，其本身為無色或微黃色，酶作用后生成有色化合物。人工合成的色素原底物待測酶產(chǎn)物的毫摩爾吸光系數(shù)對硝基苯酚磷酸二鈉鹽（PNPP-Na2）ALP對硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5L-γ-谷氨酰-3-羧基對硝基苯胺GGT2-硝基-5-氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯-硝基酚-α-半乳糖-麥芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP）（405nm，pH6.0）6.12-氯-硝基酚-α-巖藻糖苷α-巖藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.2底物和測定對象：〔1〕在原反響體系中參加一些試劑，其只和酶反響物迅速作用，產(chǎn)生可被檢出的物質(zhì)，但該試劑不和酶反響，也不影響酶的活性。SPE+試劑可被檢出的物質(zhì)〔2〕酶偶聯(lián)法目前應用最多，即在原反響體系中參加另一些酶試劑，所進行的酶促反響和被測酶反響偶聯(lián)起來?！捕趁概悸?lián)反響反響模式ABPExEi被測酶被測酶始發(fā)反響始發(fā)反響指示反響指示酶指示反響指示酶ABCPExEaEi輔助酶輔助反響酶偶聯(lián)體系輔助酶輔助反響1.酶偶聯(lián)反響時相酶偶聯(lián)反響一開始不能反映酶活性，在反響中存在幾個時相。以臨床常規(guī)酶學分析中常見的ALT的檢測為例，在該酶偶聯(lián)體系中的指示酶為脫氫酶，反響原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此時反響的方向由NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD，隨反響進行，A應隨之而下降，通過檢測反響產(chǎn)物A在340nm處A的變化速率，可以檢測指示酶反響。ALT雙試劑法測定中，首先使血清與缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保溫5m，將樣品中所含的內(nèi)源性α-酮酸消耗完。然后再參加α-酮戊二酸啟動ALT催化的反響。反響一開始參加的試劑1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此時相中，存在于樣品中的干擾物質(zhì)〔內(nèi)源性α-酮酸〕消耗完。參加試劑2〔即α-酮戊二酸〕啟動反響，在初始階段，產(chǎn)物α-丙酮酸開始出現(xiàn)，并逐漸增多，但處于較低水平，指示酶反響速度也較低，不能代表待測酶的Vx。隨著產(chǎn)物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反響V相同，到達穩(wěn)態(tài)期。此階段340nm處A出現(xiàn)明顯的線性變化。最后由于底物的消耗，反響V逐漸減慢，偏離線性。

1．酶偶聯(lián)法指示酶的反響系統(tǒng)：以NAD〔P〕+或NAD〔P〕H為輔酶的脫氫酶類作為指示酶，監(jiān)測其反響物NAD〔P〕H于340nm處紫外吸收或在紫外激發(fā)光365nm波長照射下，其在460nm發(fā)射強烈熒光的變化速率的測定系統(tǒng)；是偶聯(lián)過氧化氫〔H2O2〕以過氧化物酶〔POD〕為指示酶的測定系統(tǒng)。Trinder反響：2.酶偶聯(lián)反響本卷須知(1)延滯期應越短越好，測定時間要避開此期。(2)不是所有的酶都適合用酶偶聯(lián)法進行測定，酶偶聯(lián)反響V應超過或等于Vx，Ei反響必須是一級反響，即指示酶反響速率和測定酶的產(chǎn)物B濃度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小時才能做到。(3)從經(jīng)濟方面考慮應選用一些來源容易且價格廉價的酶〔指示酶〕制劑。(4)適當?shù)闹甘久傅挠昧浚磸蛯嶒灧ù_定，即做到酶偶聯(lián)速率不隨酶量的增加而升高，并在所選的最適條件下，指示酶偶聯(lián)反響速率和酶活性濃度成正比。〔三〕干擾因素(1)其他酶和物質(zhì)的干擾(2)酶的污染(3)非酶反響(4)分析容器的污染(5)沉淀形成

解決方法之一可通過試劑空白管檢出并加以校正，另一個有效途徑就是不用單一試劑而改用雙試劑測定酶活性。P151

五、血清酶活性濃度測定條件的優(yōu)化方法儀器設(shè)備試劑自動生物化學分析儀參數(shù)設(shè)置標本的采集、運輸與保存標本的采集、運輸與保存溶血：細胞內(nèi)酶而言，細胞內(nèi)外濃度差異大；所以應及時進行別離，靜脈采血后應在1～2h內(nèi)別離血清?？鼓齽豪貌菟猁}、枸櫞酸鹽、EDTA抗凝的血漿一般不用作酶活性測定；肝素對ALT、AST、CK、LD、ACP檢測均無影響，可用于急診；臨床多用血清為首選測定標本。溫度：大局部酶在低溫中比較穩(wěn)定，一般在血清別離當天測定，否那么應放冰箱冷藏；通常在0～4°C下使用、處理及保存，除了一些冷變性的酶；液氮可作為酶學測定時血清標本及質(zhì)控長期保存的方法。P155

六、酶活性濃度單位〔一〕酶活性單位慣用單位用首先報告該種酶測定方法的臨床酶學家的名字來命名其單位，即使同一種酶因方法不同而有數(shù)種活性單位，參考值差異很大。國際單位1963年，1IU＝1μmol/min〔25°C及其他最適條件下〕1976年，1U＝1μmol/min〔特定條件下〕1979年，1Katal＝1mol/s〔規(guī)定條件下〕，1U＝16.67nKatal例：碘色法測定血清淀粉酶〔AMS〕【單位定義】1慣用單位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉?！静僮鳌繙y定管：稀釋10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min后顯色。校準管(“比照〞校準管)：用蒸餾水替代血清，其它步驟相同。反響完成后，660nm處以蒸餾水調(diào)零，分別測出△Au、△Ac?！居嬎恪?/p>

測定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加顯色液顯色。同時，設(shè)立除先不加血清、其它步驟相同的空白管〔在反響最后加血清〕，510nm處以空白管調(diào)零測出△Au。校準管：以校準曲線中第2管為例。取0.05mg/ml的酚校準液0.4ml，加顯色液等至總體積與測定管相等，用蒸餾水替代酚校準液、其它步驟相同的空白管調(diào)零，510nm處測出△Ac?！居嬎恪?/p>

可見，第2管相當于酶活性單位為：20金氏單位/100ml血清，常簡寫為20金氏單位?！締挝欢x】1金氏單位：100ml血清ALP在37℃與底物作用15min，產(chǎn)生1mg酚?！静僮鳌坷?金氏法測定血清ALP?！捕趁富钚詽舛葐挝灰悦繂挝惑w積所含的酶活性單位數(shù)表示；各國學者習慣用U/L表示體液中酶催化活性濃度，

1U/L=16.67nKatal/L正常上限〔upperlimitsofnormal，ULN〕倍數(shù)把酶測定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)；易于比較解釋來自不同方法的結(jié)果，利于各實驗室間質(zhì)評調(diào)查；可將ULN進一步適當分級，制定出輕度、中度及重度增加的范圍，使檢測結(jié)果更加一目了然；

〔三〕酶活性濃度計算連續(xù)監(jiān)測法檢測酶活性濃度時，使用摩爾消光系數(shù)〔ε〕。其定義為：特定條件下，一定波長的光，光徑為1.0cm時，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時的吸光度。連續(xù)監(jiān)測法測定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化〔ΔA/min〕U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度變化106

—把mol換算成μmolv—樣品量（ml）L

—比色杯光徑（cm）V—反應體系體積（ml）ε—摩爾消光系數(shù)（cm2

·mol-1）自動生物化學分析儀測定同一酶，條件固定時，從理論上講V，v和L均為固定值，ε為常數(shù)，那么可將公式簡寫為：U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=K為酶活性濃度定量系數(shù)主要用于臨床酶活性測定的計算與校正K值設(shè)置應考慮酶的參考值上限及測定時間兩方面，這些均與儀器測定的噪音有關(guān)。第五節(jié)

酶的免疫化學測定一、報告方式酶活性濃度單位：U/L質(zhì)量濃度單位：ng/ml，μg/L二、優(yōu)點靈敏度高特異性高能用于檢測一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白特別適用于同工酶的檢測樣品中其他方法不易測出的少量或痕量酶不受體液中其它物質(zhì)的影響酶原或去輔基酶蛋白

三、缺點要制備足夠量多的提純酶作為抗原和具有免疫化學性質(zhì)的抗血清步驟多，操作繁瑣測定本錢高

第六節(jié)

同工酶及其亞型測定一、概念同工酶〔isoenzyme〕

同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學性質(zhì)以及器官分布和細胞內(nèi)定位不同的一類酶。亞型〔isoform〕

即指基因在編碼過程中由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶，往往在基因編碼產(chǎn)物從細胞內(nèi)釋入血漿時因肽酶作用降解而形成。

二、分析方法臨床同工酶的分析可分為兩步首先精確地別離出某酶的各同工酶組分測定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性二、分析方法〔一〕電泳法原理方法同工酶氨基酸組成不同〔一級結(jié)構(gòu)不同〕，pI不同，電泳遷移率也就不同，電泳可將其分開。

顯色染料偶氮染料四唑鹽離子型化合物，易溶于水，難溶于一般的有機試劑，利用其進行的偶合反響，生成不同顏色的偶氮色素進行同工酶譜檢測受氫體作用，四唑鹽可被復原成紫紅色的formazan，常用的有：NBT、INT、MTT等。其中NBT使用最多。掃描定量光密度計熒光計〔二〕色譜法柱色譜法離子交換色譜親和色譜商品化微型色譜柱〔三〕免疫分析法免疫抑制法免疫沉淀法其它免疫學方法

利用同工酶的一種亞基與相應抗體結(jié)合后，酶活性受到抑制，測定加與不加抗體前后樣品中酶活性的變化

利用分離提純的同工酶作抗原制備的抗體與含該型同工酶的待測樣品混合，在一定條件下抗原抗體復合物形成沉淀，離心后測定上清液中其它型別的酶活性，將加入抗體前測得的總活性減去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫電泳、RIA、EIA和CLIA〔四〕動力學分析法底物特異性分析法抑制劑分析法

pH分析法熱失活分析法三、同工酶檢測意義提高酶診斷的特異性提高診斷的靈敏度對某些疾病的預后有評價價值有些同工酶有明顯的組織分布和細胞內(nèi)定位差異有些同工酶的變化可在總酶變化之前發(fā)生線粒體酶的測定第七節(jié)工具酶及其臨床應用工具酶：酶學分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶。指示酶和輔助酶作為反響系統(tǒng)中的試劑。〔一〕工具酶〔二〕常用工具酶常用工具酶多為氧化復原酶類工具酶純度不必要求過高工具酶中雜質(zhì)的含量有一定的限制〔三〕工具酶參與的指示反響臨床生化檢驗中，很多工程的測定往往使用有工具酶參與的類似的反響原理－－共通〔通用〕反響途徑。1.偶聯(lián)H2O2的工具酶及其指示反響葡萄糖尿酸膽固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶膽固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）為受體的指示酶以NAD(P)H為輔酶參與的指示酶觸酶POD(最常用〕2H2O2+4-AAP+酚醌亞胺(紅色)+4H2OPOD例：葡萄糖氧化酶法測定血清葡萄糖Glu＋O2＋H2OGA＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚H2O＋O2＋紅色醌類化合物GODPOD葡萄糖氧化酶〔glucoseoxidase，GOD〕利用O2和H2O將Glu氧化成GA，并釋放H2O2，過氧化物酶〔peroxidase，POD〕在色原性氧受體存在時將H2O2分解為H2O和O2，并將色原性氧受體4-AAP和酚去氫縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反響。紅色醌類化合物的量與Glu含量成正比。2.NAD(P)+或NAD(P)H偶聯(lián)的脫氫酶及其指示反響許多氧化復原反響，尤其是作為工具酶如LD、GLD、G6PD等參與時，常將底物的H去除后傳遞給NAD(P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm處特征性的光吸收，借此用分光光度法檢測。如：葡萄糖、尿素、β-羥丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。例：尿素＋H2O2NH3＋CO2NH3＋α-酮戊二酸＋NADH＋H+谷氨酸＋NAD+＋H2O尿素酶GLD

P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+

第八節(jié)臨床常用血清酶分析臨床各系統(tǒng)疾病的酶學診斷一、肝臟疾病診斷肝實質(zhì)細胞受損的酶：ASTALTLD(LD5)反映肝細胞合成功能的酶：ChELCAT凝血酶原診斷肝纖維化的酶：MAO診斷膽道梗阻的酶：ALPGGT

5`-NT二、骨骼及骨骼肌疾病診斷骨骼疾?。篈LP診斷骨骼肌疾病：CK(CK-MM)ASTLD(LD5)三、胰腺疾病AMYLPS四、前列腺疾病

ACPPSA五、心肌酶譜

CK-MB：AMI診斷的金指標

ASTm：判斷預后

LD：LD1>LD2一、轉(zhuǎn)氨酶〔Aminotransferases〕及其同工酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanineaminotransferases，ALT)/谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartateaminotransferases，AST/谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT1.催化反響L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸α-草酰乙酸＋L-谷氨酸ALTAST兩種酶均需要磷酸吡哆醛〔VitB6〕為輔基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白為脫輔基酶蛋白，無催化活性。

ALT

&

AST

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Alanineaminotransferase(ALT)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Aspartateaminotransferase(AST)ALT80%AST20%ASTALT&

ASTALT、AST體內(nèi)分布情況及半衰期變化分布半衰期（小時）臟器肝細胞ALT肝臟、骨骼肌、腎臟、心肌等主要在胞質(zhì)47AST心肌、肝臟、骨骼肌、腎臟等80%在線粒體20%在胞漿172.組織分布

ALT大量存在于肝組織，其次為腎、心、骨骼肌等。其有兩種活性同工酶，α(ALTs)、β(ALTm)，分別存在細胞質(zhì)及線粒體中。肝細胞中ALT大多存在細胞質(zhì)，少量在線粒體，肝細胞壞死時血清中以ALTs為主。

AST存在多種器官，按含量多少為心、肝、骨骼肌和腎。其有兩種同工酶ASTs、ASTm，分別存在細胞質(zhì)及線粒體中。細胞輕度損傷ASTs顯著升高，而嚴重損傷時ASTm大量出現(xiàn)于血清中。血中AST升高多來自心臟或肝臟損傷。ALT&

AST參考值范圍Referenceinterval:ALT:5-40U/LAST:8-40U/LALT/AST≤13.標本溶血標本不能用于檢測

宜用血清，4℃

冰箱中可貯存1星期，活性無明顯改變。4.臨床意義

ALT是反映肝損傷的一個靈敏指標急性肝炎早期升高，ALT>AST；急性肝炎恢復指標Deritis比值可用于肝炎診斷、鑒別診斷及判斷轉(zhuǎn)歸酶膽別離是肝細胞壞死先兆

AST主要用于肝臟疾病的診斷AMI發(fā)病6-8h即升高，48-60h達頂峰，4-5d恢復正常。由于AST在AMI時升高遲于CK，恢復早于LD，故目前診斷AMI價值不大。急性肝炎，AST升高程度不及ALT；慢性肝炎，特別肝硬化、慢性活動性肝炎時，AST升高程度超過ALT。ALT&

AST臨床意義Clinicalsignificance疾病ALT與ASTALT/AST急性病毒性肝炎Acuteviralhepatitis↑↑＞1慢性病毒性肝炎ChronicviralhepatitisN或↑＞1酒精性肝病、脂肪肝Alcoholicliverdiseases,FattyliverN或↑＜1肝硬化LivercirrhosisN、↓或↑＜1N：正常；↑：輕度升高；↑↑：明顯升高；↓：降低二、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及其同工酶γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶〔γ-glutamyltranspeptid,γ-GT/GGT〕1.催化反響又稱：γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶〔γ-GTP/GGTP)一種含巰基的線粒體酶，可催化γ-谷氨?；鶑腉SH或其它含γ-谷氨?；衔镏修D(zhuǎn)移至另一肽或氨基酸分子上。

GSH＋氨基酸

γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸GGT

2.組織分布

腎臟中含量最多，其次為胰、肺、肝等。血清中的GGT主要來自肝膽。

3.標本

GGT較穩(wěn)定，室溫下可放置2d，

4℃可存放1w，-20℃可儲存1y；RBC中幾乎無GGT，因此溶血標本可以檢測。參考值范圍：<50U/L

4.臨床意義

有助肝膽疾病的鑒別診斷與ALP聯(lián)合進行肝臟疾病檢測膽道疾病，GGT陽性率高，而且升高明顯，可高達5-30ULN，肝實質(zhì)疾病是GGT一般只是中度升高，可達2-5ULN。假設(shè)ALP升高而GGT正常，那么完全排除ALP的肝來源，假設(shè)ALP和GGT都增加，那么應先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排除，那么GGT增高為肝病所致。(1)肝膽疾病檢出陽性率最高的酶

(2)用于判斷惡性腫瘤有無肝轉(zhuǎn)移

(3)乙醇、巴比妥類藥物等可誘導GGT的升高。P168

三、肌酸激酶及其同工酶和亞型肌酸激酶〔creatinekinase，CK〕1.催化反響CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之間的磷酸轉(zhuǎn)移的可逆性反響，所產(chǎn)生的磷酸肌酸含高能磷酸鍵，是肌肉收縮時能量的直接來源。磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATPCK2.組織分布廣泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和腦。CK由兩種不同亞基〔M，B〕組成的二聚體，細胞質(zhì)中存在三種同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，線粒體中存在CK-Mt(CK4)，其電泳速率最慢。CK同工酶又可分為不同亞型，CK-MM有三種亞型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，電泳速率依次減慢；CK-MB有CK-MB2和CK-MB1兩種亞型。3.標本

不得用溶血標本，RBC中含有AK，可干擾測定，引起測定值偏高；測定樣品宜用血清或肝素抗凝血漿，其它抗凝劑都抑制CK活性。

4.臨床意義

CK及其同工酶和亞型是目前臨床上測定次數(shù)最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷。

(1)AMI的早期診斷總CK在AMI診斷中意義不大CK-MB為診斷AMI的金指標CK-MM3/CK-MM1>1.0為診斷AMI的標準（排除急性骨骼肌損傷）CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5為診斷AMI的標準之一

(2)全身疾病特別是肌肉疾病時，CK極度升高

四、乳酸脫氫酶及其同工酶和亞型乳酸脫氫酶〔lactatedehydrogenase，LD/LDH〕1.催化反響

LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同時將氫轉(zhuǎn)移給輔酶而成為NADH，依條件不同而有可逆性。L-乳酸＋NAD+丙酮酸＋NADH＋H+pH8.8～9.8Ph7.4～7.8

2.組織分布

LD是一種含鋅的糖酵解酶，廣泛存在于人體各組織中，以肝、心肌、腎、肌肉、RBC含量最高。LD是由兩種不同亞基（M和H）組成的四聚體，形成5種結(jié)構(gòu)不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。1.以LD1為主，主要在心肌，可占總LD活性50％以上，也存在于RBC內(nèi)；2.以LD5為主，以橫紋肌為代表，肝臟中也有；3.以LD3為主，存在于脾肺。一般成年人血中LD同工酶存在如下規(guī)律：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5，部分正常兒童血中可見LD1>LD2。LDH的亞基分為兩類：骨骼肌型〔M〕、心肌型〔H〕

五種同工酶的亞基組成分別為：

HHHH，HHHM，HHMM，HMMM,MMMM乳酸脫氫酶同工酶的電泳圖譜肝臟肌肉橫隔膜心腎3.標本一般用血清，用血漿需離心去除血小板〔血小板中含有大量的LD〕，采血后迅速別離血清；因RBC中LD含量比血清高100倍以上，不宜用溶血標本。LD4、LD5宜冷變性，不應放在冰箱中，25℃放2-3d，LD活性變化不大。4.臨床意義

亞急性心肌梗死診斷有一定價值，但其特異性差；

(1)診斷心臟疾病心肌梗死和心肌炎時以LD1和LD2升高為主，大多數(shù)AMI患者血中會出現(xiàn)“反轉(zhuǎn)比率〞，即LD1>LD2；

(2)診斷肝臟疾病

肝細胞損傷時常出現(xiàn)LD5>LD4;

急性肝炎時LD1LD2相對下降，LD5升高；慢性肝炎時LD5升高，且LD1<LD3；肝硬化時為LD2下降和LD5升高；肝癌時LD5升高，但LD1>LD3；

(3)診斷骨骼肌疾病

骨骼肌損傷時常出現(xiàn)LD5>LD4;五、堿性磷酸酶及其同工酶堿性磷酸酶〔alkalinephosphatase，ALP/AKP〕1.催化反響一種含鋅的糖蛋白，在堿性環(huán)境中〔pH10.0〕可以水解各種天然及人工合成的磷酸單酯化合物。2.組織分布

ALP廣泛存在于各組織器官中，其