牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）

牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）I牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）范圍本文件規(guī)定了牛結(jié)核病診斷技術(shù)（γ-干擾素體外ELISA法）的試劑及儀器、檢測方法、質(zhì)量控制和結(jié)果判定等。本文件適用于牛結(jié)核病診斷。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18645動物結(jié)核病診斷技術(shù)GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T32945牛結(jié)核病診斷體外檢測γ干擾素法術(shù)語和定義本文件沒有特別需要界定的術(shù)語和定義。原理感染牛分枝桿菌的牛，其T淋巴細胞已被牛分枝桿菌致敏并產(chǎn)生免疫記憶。當體外再次遇到牛分枝桿菌特異性抗原（結(jié)核菌素）刺激時，牛外周血中淋巴細胞被激活并大量釋放γ-干擾素，而未被感染的牛則不會分泌或低水平分泌γ-干擾素。通過雙單克隆抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性γ-干擾素濃度水平，即可診斷牛結(jié)核病。試劑及儀器5.1試劑外周抗凝血培養(yǎng)所需材料參見附錄A。夾心ELISA所需試劑和材料參見附錄B。5.2儀器檢測所需儀器參見附錄C。檢測方法6.1試劑配制檢測所需試劑的配制見附錄D。6.2樣品采集與處理6.2.1無菌采集牛尾靜脈血3mL～4mL，加入至含肝素鋰或肝素鈉的抗凝血真空管中，輕輕顛倒2次～3次使血液和抗凝劑混合均勻。室溫（22±5℃）運送至實驗室并在采血后24h內(nèi)進行培養(yǎng)。6.2.2分裝前輕輕顛倒抗凝血真空管，充分混勻血液樣品。將抗凝血無菌加入至48孔細胞培養(yǎng)板，每頭?？鼓盅b3孔，1.0mL/孔（可參考表1）。6.2.3在每頭牛的3孔抗凝血樣品中，分別無菌加入67μLPBS、67μL禽型PPD溶液和67μL牛型PPD溶液（可參考表1），用微量振蕩器低速充分振蕩，使刺激抗原與抗凝血完全混合。6.2.4蓋上細胞培養(yǎng)板蓋，避免液體揮發(fā)。將含有抗凝血和刺激抗原的48孔細胞培養(yǎng)板在37℃濕溫培養(yǎng)箱中孵育16h～24h。6.2.5使用移液器小心吸取上層血漿200μL～300μL，轉(zhuǎn)至1.5mL離心管中。吸取血漿時應盡量避免吸入紅細胞。表1.抗凝血樣品和刺激原加入到48孔細胞培養(yǎng)板（豎排放置）動物1PBSA1禽型PPDA2牛型PPDA3PBSA4禽型PPDA5牛型PPDA6動物2動物3PBSB1禽型PPDB2牛型PPDB3PBSB4禽型PPDB5牛型PPDB6動物4動物5PBSC1禽型PPDC2牛型PPDC3PBSC4禽型PPDC5牛型PPDC6動物6動物7PBSD1禽型PPDD2牛型PPDD3PBSD4禽型PPDD5牛型PPDD6動物8動物9PBSE1禽型PPDE2牛型PPDE3PBSE4禽型PPDE5牛型PPDE6動物10動物11PBSF1禽型PPDF2牛型PPDF3PBSF4禽型PPDF5牛型PPDF6動物12動物13PBSG1禽型PPDG2牛型PPDG3PBSG4禽型PPDG5牛型PPDG6動物14動物15PBSH1禽型PPDH2牛型PPDH3PBSH4禽型PPDH5牛型PPDH6動物166.3酶聯(lián)免疫吸附試驗6.3.1溶解陽性、陰性對照凍干粉，配制1×PBST洗滌液，按“操作注意事項”平衡其他試劑。6.3.2取商品化已包被有γ-干擾素單克隆抗體的酶標板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用），先加入50μL樣品稀釋液至各孔中，再加入50μL血漿樣品及陽性對照、陰性對照至各孔中，輕輕振勻孔中樣品，貼上封板膜，37℃孵育2h。6.3.3棄去孔內(nèi)液體。使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。6.3.4用酶標抗體稀釋液按1：100稀釋酶標抗體（現(xiàn)配現(xiàn)用）。在每孔中加入100μL新鮮配制的酶標抗體，貼上封板膜，37℃孵育2h。6.3.5使用1×PBST洗滌液洗板5次，300μL/孔。每次靜置1min后棄洗滌液，洗滌完畢后在吸水紙上拍干。6.3.6每孔加入100μL底物顯色液，貼上封板膜，37℃避光顯色10min。6.3.7按照加入底物顯色液的順序和時間間隔每孔加入50μL終止液，15min內(nèi)在酶標儀上測定OD450nm。6.4操作注意事項6.4.1由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要使細胞損傷降至最低。任何情況下不應將抗凝血貯存于冰箱中。6.4.2刺激后的血漿樣品如不直接進行酶聯(lián)免疫吸附試驗，血漿可在2℃～8℃貯存7天，在-20℃可貯存6個月。貯存前，每個貯存管必須用合適的蓋子密封。應在樣品架上標記日期、操作者的首字母、管內(nèi)容物、動物編號和牛群細節(jié)等相關(guān)信息。檢測前，樣品應恢復至室溫并充分混勻。6.4.3除酶標抗體外，試劑盒使用前各組份應平衡至室溫，使用后即放回2℃～8℃。6.4.4不同批號試劑盒的試劑組分不得混用，使用過程中各試劑組份應避免交叉污染。6.4.5底物顯色液避免暴露于強光和接觸氧化劑。6.4.6終止液中含有H2SO4，使用時注意不要接觸到身體和衣物。6.4.7抗體包被酶標板拆封后應避免受潮或沾水（每次將剩余的抗體包被酶標板用封口袋扎緊后盡快置于2℃~8℃）。6.4.8陽性對照和陰性對照凍干粉用滅菌純水稀釋并使用后，盡快置于2℃～8℃保存。6.4.9待檢血漿樣品數(shù)量較多時，可先使用樣品稀釋液稀釋完所有待檢血漿，再將稀釋好的血漿轉(zhuǎn)移到反應板，保證反應時間一致。6.4.10嚴格按照操作說明書要求進行，操作過程中移液、定時和洗滌等過程應精確。7質(zhì)量控制在判定結(jié)果前必須檢查對照樣品的結(jié)果，確定陰性對照和陽性對照的OD450nm值在規(guī)定范圍之內(nèi)：陰性對照OD450nm值范圍為0.0~0.15。陽性對照OD450nm值范圍為0.7~3.0。如果有一條標準不符合，試驗是無效的，應重新進行檢測。結(jié)果判定8.1計算每個樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的OD450nm值。如果做重復孔，應計算每頭牛所有樣品PBS刺激組、禽型PPD刺激組和牛型PPD刺激組的平均OD450nm值。8.2結(jié)果判定標準陽性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值≥0.1。陰性判定標準：牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值＜0.1，或牛型PPD刺激組OD450nm值-PBS刺激組OD450nm值≥0.1且牛型PPD刺激組OD450nm值-禽型PPD刺激組OD450nm值＜0.1。安全措施按照GB/T18645和GB19489執(zhí)行。

附錄A（資料性）外周抗凝血培養(yǎng)所需材料A.1肝素鋰或肝素鈉真空抗凝管；A.25mL或10mL動物采血器；A.3無菌48孔細胞培養(yǎng)板；A.4牛型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.5禽型PPD溶液（2.5mL/瓶）；A.6100μL、1000μL槍頭；A.7用于貯存血漿的1.5mL離心管；A.896孔板架。

附錄B（資料性）夾心ELISA所需試劑和材料B.1酶標板（包被牛γ-干擾素單克隆抗體，含0.1%ProClin300）；B.2牛γ-干擾素陽性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；B.3牛γ-干擾素陰性對照凍干粉（含0.1%ProClin300）；B.4樣品稀釋液（血漿稀釋緩沖液，含0.1%ProClin300）；B.5PBST洗滌液（20×）（含0.1%ProClin300）；B.6酶標抗體（含0.1%ProClin300）；B.7酶標抗體稀釋液（含0.01%的硫柳汞）；B.8底物顯色液（TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）溶液）；B.9終止液（0.5MH2SO4）；B.10滅菌純水（用于溶解陽性對照、陰性對照凍干粉）；B.11蒸餾水（用于稀釋洗液）；B.12酶聯(lián)免疫吸附試驗所需的試劑、反應槽、封板膜和槍頭。

附錄C（資料性）檢測所需儀器C.137℃濕溫培養(yǎng)箱；C.2精密可調(diào)移液器（100μL、1000μL）；C.31mL、5mL、10mL的移液器；C.4100mL、1L、2L的量筒；C.512道移液器（50μL～300μL）；C.6微量振蕩器（可選）；C.7洗板機（可選）；C.837℃水浴鍋；C.9酶標儀（含450nm濾光片）。

附錄D（規(guī)范性）檢測所用試劑的配制D.1刺激抗原牛型PPD溶液（10000IU/mL）和禽型PPD溶液（7500IU/mL）在使用前徹底混勻，2.5mL/瓶。D.2酶標板在開封前將酶標板恢復至室溫，可放置30min以上。D.3陽性對照和陰性對照用0.2mL滅菌純水分別溶解陰、陽性對照凍干粉。應保證完全溶解，溶解的陽性對照、陰性對照在2℃～8℃可儲存1個月，但再次使用前應恢復至室溫并充分混勻。D.4樣品稀釋液恢復至室溫并充分混勻，用作血漿稀釋緩沖液。D.5酶標抗體和酶標抗體稀釋液酶標抗體必須一直保存于2℃～8℃。酶標抗體稀釋液可直接使用。按表2配制酶標抗體工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，未用完的試劑應立即丟棄。未用完的酶標抗體