醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)課件

Preface分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容分子生物學(xué)的歷史分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用分子生物學(xué)的主要內(nèi)容分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動及規(guī)律。包括生物大分子、基因組的結(jié)構(gòu)與功能；基因的復(fù)制、表達、調(diào)控；細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；基因工程的各種技術(shù)體系。第一節(jié)

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)主要內(nèi)容生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能基因組的結(jié)構(gòu)與功能基因的復(fù)制、表達、調(diào)控細胞通訊與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)；基因工程的各種技術(shù)體系（克隆、測序、雜交、PCR、轉(zhuǎn)基因、DNA芯片）基因與疾病基因診斷與基因治療第二節(jié)分子生物學(xué)的歷史一、孕育階段1871年Miescher核素;1900年，Gene1910年，Morgan：Gene存在于染色體上1944年，Avery證實DNA攜帶遺傳信息。創(chuàng)立階段

二十年代，Levene研究了核酸的結(jié)構(gòu)，并提出了四核苷酸假說。1953年Watson和CrickDNA雙螺旋1958年Crick中心法則1958年，Meselson和StahlDNA半保留復(fù)制。1960年發(fā)現(xiàn)mRNA，DNApol1961年，Jacob和Monod操縱子學(xué)說1961年，Nirenberg破譯第一個遺傳密碼發(fā)展階段1970年，Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶。阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶,獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。Sanger設(shè)計測定DNA分子內(nèi)核苷酸序列，1980年與伯格(Berg)（重組DNA技術(shù)）分享

Nobel生理醫(yī)學(xué)獎。1989年Altman、Cech發(fā)現(xiàn)核酶共享Nobel化學(xué)獎。PCR技術(shù)的建立。顯微注射術(shù)開始轉(zhuǎn)基因動物的研究。轉(zhuǎn)基因植物的誕生?；蛑委熂夹g(shù)。人類基因組計劃?？寺⊙虻恼Q生。第三節(jié)

分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用一、人體發(fā)育調(diào)控和人體功能調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)二、基因與疾病三、生物工程與生物制藥四、預(yù)防醫(yī)學(xué)一、人體發(fā)育調(diào)控和人體功能調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)發(fā)育、分化與衰老的分子生物學(xué)基礎(chǔ)細胞增殖調(diào)控的分子生學(xué)基礎(chǔ)神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)二、基因與疾病三、生物工程與生物制藥基因工程酶工程蛋白質(zhì)工程微生物工程第一節(jié)核酸生物大分子（biopolymer）

:

nucleicacid、protein、polysaccharose（多糖）。分子量：10~103kD一級結(jié)構(gòu)：基本結(jié)構(gòu)單位的排列順序。

nucleicacid：

DNA（deoxyribonucleicacid）

RNA（ribonucleicacid）DNAStructures&functions

Primarystructure：DNA分子中核苷酸的排列順序。Secondarystructure：雙螺旋（doublehelix）三股螺旋（triplehelix）Tertiarystructure：超螺旋（supercoil）DNAprimarystructure

&function一級結(jié)構(gòu)的基本特點：

兩類核酸分子的組成比較嘌呤嘧啶核糖磷酸DNAA，GC，T脫氧核糖磷酸RNAA，GC，U核糖磷酸5’末端的磷酸基團3‘，5’-磷酸二酯鍵3‘末端羥基DNA攜帶的遺傳信息

※有功能活性的DNA序列所攜帶的遺傳信息。

※調(diào)控信息：能被各種蛋白質(zhì)分子特異性識別和結(jié)合。DNA的甲基化（MythylationofDNA）原核生物：多為對一些酶切位點的修飾，作用是對自身DNA產(chǎn)生保護作用。真核生物：在基因表達調(diào)控中起主要作用。DNASecondaryStructures&functions

1、雙螺旋結(jié)構(gòu)（doublehelix）三股螺旋DNA（triplehelix）三鏈DNA（triplestrandsDNA，tsDNA）1957年由Felesnfeld及Davis首先發(fā)現(xiàn)。三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，Hpu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy）。兩種基本類型：

Pu-Pu-Py型：在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定。

Py-Pu-Py型：在偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定。三鏈DNA既可以是B-DNA與另一條DNA鏈結(jié)合成的鏈間的三鏈DNA，又可以是B-DNA與其自身的一條鏈結(jié)合形成的鏈內(nèi)的三鏈DNA。分子內(nèi)三鏈DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中發(fā)現(xiàn)。其形成要求雙螺旋中存在連續(xù)的嘌呤或嘧啶序列，而且必須是鏡像重復(fù)序列。

鏡像重復(fù)序列：由反方向完全相同的兩個序列組成。5′GGAATCGATCTTTTCTAGCTAAGG3′3′CCTTAGCTAGAAAAGATCGATTCC3′反轉(zhuǎn)重復(fù)（invertedrepeated)：由反方向互補的兩個DNA片段組成，兩個反轉(zhuǎn)重復(fù)序列又叫回文序列(palindromesequence)。鏡像重復(fù)(mirrorrepeat)：由反方向完全相同的兩個序列組成。直接重復(fù)(directrepeat)：由同一方向完全相同的兩個序列組成。正向重復(fù)序列、順向重復(fù)序列。DNA的三級結(jié)構(gòu)——超螺旋（supercoil）

生物體閉環(huán)DNA都以超螺旋形式存在，如細菌質(zhì)粒、病毒、線粒體DNA。線性DNA分子或環(huán)狀DNA分子中有一條鏈有缺口時不能形成超螺旋。超螺旋的意義：緊密，體積更?。荒苡绊戨p螺旋的解鏈程序，因而影響DNA分子與其它分子之間的相互作用。真核生物染色體三級結(jié)構(gòu)：RNAStructures&functions

一、mRNA：messengerRNA二、tRNA：transferRNA三、rRNA：ribosomalRNA四、核酶（ribozyme）五、核內(nèi)不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA）六、小分子核內(nèi)RNA（smallnuclearRNA，snRNA）七、反義RNA（antisenseRNA）mRNA

原核生物mRNA結(jié)構(gòu)特點：1、多順反子（polycistron）:一分子mRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息，可以作為幾種蛋白質(zhì)的模板，能翻譯出幾種蛋白質(zhì)。2、mRNA5′端無帽子結(jié)構(gòu),3′端一般無多聚A的尾巴。3、一般沒有修飾堿基。每種順反子是一個特異的翻譯區(qū)；每個翻譯區(qū)與核蛋白體之間有一個獨立的結(jié)合部位；各個翻譯區(qū)之間借一段無編碼功能的核苷酸序列相連，5′端、3′端也有非編碼區(qū)。真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的特點1、5′末端有帽子結(jié)構(gòu)。2、3′端多數(shù)帶有多聚A的尾巴(polyadenylatetail),其長度為20~200個A.3、分子中可能有修飾堿基,主要是甲基化.4、分子中有編碼區(qū)與非編碼區(qū)。非編碼區(qū)（untranslatedregionUTR）位于編碼區(qū)的兩端；5′非編碼區(qū)有翻譯起始信號。tRNA：轉(zhuǎn)運氨基酸1、單鏈小分子，含73~93個核苷酸。2、含有很多稀有堿基或修飾堿基。多為甲基化。3、5′端總是磷酸化，且常是pG。4、3′端為CCAOH。5、二級結(jié)構(gòu)為三葉草形。6、三級結(jié)構(gòu)為倒L型。rRNA原核生物真核生物核糖體70S80S小亞基30S40SrRNA16S(1542個核苷酸)18S（1874個核苷酸）蛋白質(zhì)21種(占總重量的40%)33種（占總重量的50%）大亞基50S60SrRNA23S(2940個核苷酸)28S（4718個核苷酸）5S(120個核苷酸)5.85S(160個核苷酸)5S(120個核苷酸)蛋白質(zhì)31種(占總重量的30%)49種(占總重量的35%)核糖體的組成原核生物16SrRNA3′端有一保守序列ACCUCCU，是mRNA的識別結(jié)合位點。原核生物5SrRNA43~47位核苷酸為CGAAC序列，可與tRNA上GTΨCG互補。真核生物5.8SrRNA上也有相同的CGAAC序列,是tRNA與rRNA相互識別、相互作用的部位。rRNA上有許多rRNA之間識別結(jié)合部位及蛋白質(zhì)的相互作用部位。核酶：有催化活性的RNA1982年，美國ThomasCech在研究四膜蟲rRNA自我剪接時發(fā)現(xiàn)，同時加拿大的SidneyAltman發(fā)現(xiàn)RNaseP分子中的RNA組分有催化活性；1989年分享了Noble化學(xué)獎。不僅拓寬了生物催化劑的領(lǐng)域，而且對RNA的生物學(xué)功能開創(chuàng)了一種歷史性的新認識：RNA不僅具有儲存和傳遞遺傳信息的功能，而且還具有生物催化劑的功能，在一定程度上可以說，RNA一身兼有DNA和蛋白質(zhì)兩大類生物大分子的功能。核酶的二級結(jié)構(gòu)對于催化活性很重要。Symons提出“錘頭”（hammerhead）狀二級結(jié)構(gòu)。三個螺旋區(qū)；13（或11）個保守核苷酸序列。核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）真核細胞轉(zhuǎn)錄生成mRNA的前體。加工過程包括：5′加帽；3′端加尾；內(nèi)含子的切除和外顯子的拼接；分子內(nèi)部的甲基化修飾作用；核苷酸序列的編輯作用。小分子核內(nèi)RNA(snRNA)真核細胞核內(nèi)一組小分子RNA,含70~300堿基,序列中尿嘧啶含量較高,因此又用U命名.既非任何RNA的前體,也非某種RNA代謝的中間產(chǎn)物,而是具有獨特功能且獨立存在的實體,參與mRNA的加工。常與多種特異的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成小分子核內(nèi)核蛋白顆粒（smallnuclearribonucleoproteinparticle，snRNP）反義RNA堿基序列正好與有意義mRNA互補的RNA，又稱為調(diào)節(jié)RNA?？膳cmRNA配對結(jié)合形成雙鏈，最終抑制mRNA作為模板進行翻譯。還可作為DNA復(fù)制的抑制因子，與引物RNA互補結(jié)合抑制DNA復(fù)制，及在轉(zhuǎn)錄水平上與mRNA5′端互補，阻止RNA合成轉(zhuǎn)錄?？梢匀斯ず铣煞戳xRNA來調(diào)節(jié)基因的表達,用于疾病治療。原核生物中也有一種mRNA干擾互補RNA（MrnainterferingcomplementaryRNA，micRNA），也可與特異mRNA結(jié)合并阻止翻譯。核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標準程序：酚——酚-氯仿——氯仿。核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機溶劑中不溶，也不會變性。醋酸鈉為沉淀DNA、RNA的最常用鹽類。有機溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇。溫度：冰水真核細胞RNA的提取純化一個典型的哺乳動物細胞約含10-5μgRNA，其中80~85%為rRNA，mRNA為細胞總RNA的1~5%。制備高質(zhì)量真核細胞RNA的關(guān)鍵是在抽提的最初步驟就需要抑制核糖核酸酶的活性，并避免所用玻璃器皿及液體污染微量核糖核酸酸酶。創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境潔凈實驗室環(huán)境一次性手套，勤換環(huán)境潔凈（避免飛塵中細菌真菌產(chǎn)生外源性RNA酶污染）玻璃和塑料器皿處理玻璃：常規(guī)洗凈后，200℃干烤4小時塑料：一次性。溶液配制：加0.1%DEPC37℃12~16Hr，高壓除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的溶液，用DEPC處理過的無RNA酶的三蒸水配制，用濾膜過濾除菌。

DEPC：焦碳酸二乙酯，是一種強烈但并不徹底的RNA酶抑制劑，通過和RNA酶中His結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，抑制RNA酶活性。C2H5-O-CO-O-CO-O-C2H5抑制內(nèi)源性RNA酶酶活異硫氰酸胍：強烈變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎，使RNA從細胞中釋放，又稱解偶劑。

β-巰基乙醇和異硫氰酸胍能使細胞內(nèi)各種RNA酶失活。十二烷基肌酸鈉：可使核糖體蛋白質(zhì)與RNA分子分離。

Rnasin：核糖核酸酶素,是RNA酶的一種非競爭性抑制劑。第二節(jié)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)與功能

一級結(jié)構(gòu)與功能一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中也有一些特定的序列能阻礙蛋白質(zhì)表現(xiàn)出生物功能，只有將其切除后才能形成有活性的蛋白質(zhì)。如牛胰島素原和酶原。分子病：基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)出生理功能的異常，使機體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象。如鐮刀狀紅細胞貧血。二級結(jié)構(gòu)與功能α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-pleatedsheet）、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲（randomcoil）、π-螺旋及Ω環(huán)（Ω-loop）。α-螺旋多的蛋白質(zhì)分子緊密、穩(wěn)定。如毛發(fā)、細菌纖毛的蛋白質(zhì)。富含β-折疊的蛋白如絲心蛋白柔軟有強度,但缺乏彈性.蛋白質(zhì)超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure):相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)單元相互聚集，形成更高一級的有規(guī)律的結(jié)構(gòu)。1973年，Rossman提出。三種基本形式：(αα)、（βαβ）、（βββ）.超二級結(jié)構(gòu)的形成主要是氨基酸殘基側(cè)鏈基團間相互作用的結(jié)果。結(jié)構(gòu)域（domain）：某些較大的球狀蛋白質(zhì)分子多肽鏈往往形成幾個緊密的構(gòu)象，彼此分開，各行其功能。1970年Edelman描述IgG分子構(gòu)象提出。功能域是蛋白質(zhì)分子中能獨立存在的功能單位，可以由一個或幾個結(jié)構(gòu)域組成。一些具有不同功能的蛋白質(zhì)可能具有某個相似的結(jié)構(gòu)域。如枯草桿菌蛋白酶、己糖激酶和磷酸化酶中都含有一個核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。三級結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)分子的一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)和超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步盤旋和折疊形成的空間結(jié)構(gòu)，靠次級鍵維系，二硫鍵加固。親水基團朝外翻，疏水基團朝內(nèi)鉆。三級結(jié)構(gòu)的完整性是其功能的基礎(chǔ)。若蛋白質(zhì)嚴密有序的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，則其生理功能喪失。四級結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)分子中亞基的空間排布和相互間的布局。具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的功能活性可以通過變構(gòu)作用（allostericeffect）而被調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)變構(gòu)有兩種模式：

第三節(jié)生物大分子的相互作用生物大分子相互作用的力

非共價鍵的作用。離子鍵、氫鍵、vanderwaals力、疏水鍵。信息的傳遞及利用極大地依賴弱的非共價鍵。它們不僅決定著生物大分子的三維結(jié)構(gòu)，還決定著這些結(jié)構(gòu)如何與其它結(jié)構(gòu)相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用

（protein-proteininteraction）蛋白質(zhì)通過分子之間的相互作用實現(xiàn)其特異的生物學(xué)功能。如蛋白質(zhì)酶的催化作用需要酶與特異作用物之間的相互識別、結(jié)合成中間復(fù)合物；抗體參與的防御功能需要抗體與抗原之間的特異識別與結(jié)合。1、蛋白質(zhì)的基元（motif）與結(jié)構(gòu)域由α螺旋和β片層參與的特定組合稱為基元或模體。常見模體有：β發(fā)夾：由位于同一層面內(nèi)的兩條反向平行β折疊鏈與一股環(huán)形肽鏈連接而成。β拱形：由位于不同層面內(nèi)相對的兩條β折疊鏈共價連接一個環(huán)拱結(jié)構(gòu)組成。β-α-β模體：由兩個相鄰的平行β折疊通過一定長度的α螺旋連接在一起α-α模體：一個蛋白質(zhì)分子可包含一個或多個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域的核心由模體組成。一級結(jié)構(gòu)決定空間結(jié)構(gòu)，除一級結(jié)構(gòu)，特異折疊的空間結(jié)構(gòu)形式的形成尚需分子伴侶（chaperone）存在及適當(dāng)?shù)娜芤涵h(huán)境。2、蛋白質(zhì)的結(jié)合位點一個蛋白質(zhì)分子與其配體之間的結(jié)合需要在兩個分子的特定部位之間形成很多弱化學(xué)鍵，兩分子間相互作用的部位稱為結(jié)合位點。僅僅屬于多肽鏈的一小部分，其余的氨基酸殘基為維持正確的空間位置所必需。3、蛋白質(zhì)之間相互作用的特異性由其結(jié)合位點決定。兩分子的結(jié)合位點必需存在能夠配對形成非共價鍵的基團，而且每對基團在空間上恰好能達到形成非共價鍵的最佳距離。信號傳遞過程中，正是通過蛋白質(zhì)分子之間相互作用的特異性而保證信號傳遞的特異性。DNA-蛋白質(zhì)相互作用（DNA-proteininteraction）一、DNA-蛋白質(zhì)相互作用的化學(xué)鍵1、氫鍵:具有識別功能蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)常與DNA的大溝相互作用。2、疏水鍵：暴露于大溝側(cè)緣的T-CH3基團是疏水性的，可與疏水氨基酸殘基側(cè)鏈相互作用。3、離子鍵：二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用中的序列特異性1、序列特異識別的結(jié)合能：依賴兩種類型的相互作用。一是多肽鏈與DNA大溝暴露的堿基之間通過氫鍵和范德華力建立的聯(lián)系；二是多肽鏈中的堿性氨基酸與戊糖-磷酸骨架之間的電荷聯(lián)系。2、序列特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)基元：螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helixHTH），鋅指結(jié)構(gòu)（zincfingermotif）HTHHTH基元：最初發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體的阻遏蛋白中，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在很多原核及真核DNA結(jié)合蛋白中存在。由兩個較短的α螺旋與其間含Gly殘基的絞鏈組成。如大腸桿菌的CAP蛋白含一HTH結(jié)構(gòu)域，HTH通過DNA雙螺旋大溝識別、結(jié)合反向重復(fù)序列TGTG/CACA。鋅指結(jié)構(gòu)首先發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾卵母細胞純化的TFⅢA，它是5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄激活因子，結(jié)合50bp5SrRNA編碼基因的內(nèi)調(diào)控區(qū)。含有9個相同的鋅指結(jié)構(gòu)。基因(gene)：是DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是貯存遺傳信息的遺傳單位?；蚪M(genome)：表示某物種單倍體的總DNA。

千堿基對/

染色體長度

(cm）染色體數(shù)

(單倍體）形狀原核生物

病毒SV405.20.000171環(huán)狀噬菌體φX1745.40.000181線狀單鏈噬菌體λ460.00151線狀細菌大腸桿菌40000.131環(huán)狀真核生物

酵母10000.03317

果蠅410001.44

人1250004.123

不同生物體中DNA的大小第一節(jié)病毒基因組一、病毒基因組核酸的類型1、雙鏈DNA多數(shù)動物病毒，如腺病毒、皰疹病毒、痘病毒，乙肝病毒等，環(huán)形、線形。HIV：先轉(zhuǎn)錄出一個RNA中間體再通過逆轉(zhuǎn)錄2、單鏈正股DNA

序列與mRNA相同的為正股（+），與mRNA互補的為負股（—）3、雙鏈RNA以負鏈RNA為模板轉(zhuǎn)錄出mRNA，如呼腸孤病毒及噬真菌體。4、單鏈負股RNA5、單鏈正股RNA：如逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA

cDNARNA病毒基因組結(jié)構(gòu)特點：1.大小相差較大2.核酸的結(jié)構(gòu)不同3.病毒基因組有連續(xù)的和不連續(xù)的4.編碼序列大于90%5.單倍體基因組（除逆轉(zhuǎn)錄病毒外）6.基因有連續(xù)的和間斷的7、相關(guān)基因叢集病毒基因組核酸序列中功能相關(guān)的蛋白質(zhì)基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。8、基因重疊同一段核酸序列能夠編碼2種或2種以上蛋白質(zhì)。重疊基因雖然共用一段核酸序列，但轉(zhuǎn)錄成的mRNA鏈的開放閱讀框（ORF）不同，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子大不相同。9.含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因（1）幾個結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)無間隔：幾個基因的編碼區(qū)是連續(xù)的、不間斷的，即編碼一條多肽鏈，翻譯后切割成幾個蛋白質(zhì)。（2）mRNA沒有5′端帽子結(jié)構(gòu)：

5′端非編碼區(qū)的RNA形成特殊的空間結(jié)構(gòu)稱翻譯增強子。（3）結(jié)構(gòu)基因本身沒有翻譯起始序列：必須在轉(zhuǎn)錄后進行加工、剪接，與病毒RNA5′端的帽結(jié)構(gòu)相連，或與其它基因的起始密碼子連接，成為有翻譯功能的完整mRNA。幾種典型的病毒基因組1.SV40病毒基因組動物病毒中以SV40研究較多，由sweet和Hilleman從恒河猴細胞分離。無包膜，直徑45nm，雙鏈環(huán)狀DNA，DNA長5.2kb。在自然界不引起疾病和腫瘤，當(dāng)大量接種于免疫缺損動物或新生動物時，引起腫瘤發(fā)生。SV40基因編碼兩種抗原。2.乙型肝炎病毒（HBV）基因組不同毒株的HBV以負股DNA為模板轉(zhuǎn)錄的RNA均有4個開放閱讀框架（ORF):S、C、P、X。S區(qū)段編碼病毒的外膜蛋白，C區(qū)段編碼HBV核心抗原（HBcAg)

P區(qū)段編碼DNA聚合酶X區(qū)段位于C區(qū)段上游。3.逆轉(zhuǎn)錄病毒（retroviruses)單鏈正股RNA基因組的一般特征5′帽-R-U5-PB--DLS-Ψ-gap-pol-env-(onc)-C-PB+-U3-R-poly(A)n▲編碼區(qū)：3個基本的結(jié)構(gòu)基因

gap編碼病毒衣殼蛋白；pol編碼肽鏈內(nèi)切酶、一個逆轉(zhuǎn)錄酶和一個與前病毒整合有關(guān)的酶；env編碼包膜蛋白。5′帽-R-U5-PB--DLS-Ψ-gap-pol-env-(onc)-C-PB+-U3-R-poly(A)n▲非編碼區(qū)（1）R區(qū):20~80個核苷酸。（2）引物結(jié)合區(qū)（PB):位于5端的PB區(qū)引導(dǎo)起始負鏈cDNA的合成，用PB-表示。（3）U區(qū)：位于R區(qū)與PB區(qū)之間。U5與轉(zhuǎn)錄終止和加polyA有關(guān)，U3含強啟動子，起始轉(zhuǎn)錄RNA。（4）DLS、Ψ和C區(qū)。DLS是兩條病毒（+）RNA鏈以氫鍵相結(jié)合的位點。Ψ為包裝信號?？墒筊NA包入病毒顆粒；C區(qū)不編碼蛋白質(zhì)，為調(diào)控區(qū)。人類免疫缺陷病毒（HIVGenome）HIV(humanimmunodeficiencyvirus)俗稱艾滋病毒(AIDS)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一類，引起人類獲得性免疫缺損綜合癥，長約9.3kb，除了逆轉(zhuǎn)錄病毒一般的特征外，另外至少含有6個調(diào)控基因如tat、rev、nef、vif、vpu及vpr。已發(fā)現(xiàn)的HIV有兩種：HIVⅠ和HIVⅡ.HIVⅠ從歐洲和美洲分離的毒株,致病力強,是引起全球艾滋病流行的主要病原;HIVⅡ毒力較弱主要局限于非洲西部。tat(反式激活基因）編碼一種反式激活蛋白（transactivator,Tat),Tat是HIV基因組復(fù)制和基因表達所必須的反式激活因子。存在于兩段分隔存在的基因部分。失去tat的功能則成為完全無感染性的病毒。rev基因（regulatorofvirionproteins)編碼產(chǎn)物對gag、pol、env、vpu、vpr、vif的表達有正調(diào)控作用，對nef、tat、rev的表達則行使負調(diào)控作用。nef(negativeregulationfactor,nef)兼有正負調(diào)節(jié)效應(yīng)。vif編碼病毒感染因子(viralinfectivityfactor,vif)vpr編碼病毒蛋白R(viralproteinR)激活基因的表達。vpu:HIV-1vpx:HIV-2小結(jié)1.掌握基因、基因組的概念以及逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組復(fù)制方式。2.熟悉病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能特點；第二節(jié)原核生物基因組一、原核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點：1、常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成2.只有一個復(fù)制起始點。3.具有操縱子（operon)結(jié)構(gòu)。4.編碼順序一般不會重疊。

5.基因是連續(xù)的，無內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后不需剪接。6.編碼區(qū)在基因組中所占比例遠遠大于真核基因組，小于病毒基因組。7.基因組中重復(fù)序列少。8.具有編碼同工酶的基因（isogene).9.細菌基因組中存在可移動的DNA序列，如：插入序列和轉(zhuǎn)座子。10.在DNA分子中具有多種功能的識別區(qū)域。二、質(zhì)粒（plasmid)1.定義：存在于細菌染色體外能獨立復(fù)制、穩(wěn)定遺傳的共價閉合環(huán)狀DNA分子。（大小在1~200kb）2.質(zhì)粒的分類按功能：R質(zhì)粒：抗藥性質(zhì)粒F質(zhì)粒(fertilityfactor):性質(zhì)粒（sexplasmid)可決定細菌的性別Col質(zhì)粒：大腸桿菌素質(zhì)粒,合成大腸桿菌素，殺死不含大腸桿菌素質(zhì)粒的親緣細菌。根據(jù)質(zhì)粒能否在細胞間進行傳遞：接合型質(zhì)粒可移動型質(zhì)粒自傳遞質(zhì)粒按復(fù)制機理：嚴緊型質(zhì)粒（stringentplasmid):即低拷貝數(shù)質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒（relaxedplasmid):高拷貝數(shù)質(zhì)粒。3.質(zhì)粒的特性1、能自主復(fù)制。2、質(zhì)粒的不相容性（incompatibility)兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌。3、質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)移。質(zhì)粒DNApBR322EcoRⅠ、PstⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ只有一個酶切位點，便于外源基因的插入。4.質(zhì)粒的遺傳控制1、復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)：控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)。2、分配系統(tǒng)：使質(zhì)粒在細菌分裂過程中精確分配到子細胞。3、細胞分裂控制系統(tǒng)：抑制細胞分裂，使細胞分裂與質(zhì)粒復(fù)制相協(xié)調(diào)。4、位點特異重組系統(tǒng)。5、質(zhì)粒的不相容性。具有相同復(fù)制起始位點和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌。5.質(zhì)粒DNA的提取1、細菌的培養(yǎng)：可加少量抗生素（如氯霉素）抑制宿主蛋白質(zhì)的合成，質(zhì)粒大量擴增。2、細菌的收集和裂解：離心棄上清3、質(zhì)粒DNA的分離純化三、轉(zhuǎn)位因子(transposableelement)定義：能在一個DNA分子內(nèi)部或兩個DNA分子之間移動的DNA片段。類型：1、插入序列（insertionsequence,IS)2、轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn)3、轉(zhuǎn)座的噬菌體（transposablephage)1.Insertionsequence由一個轉(zhuǎn)位酶基因及兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，不帶任何其它基因，一類簡單轉(zhuǎn)位因子，長度約700~2000bp。轉(zhuǎn)位時復(fù)制宿主靶位點一小段DNA（4~15bp）形成兩端的正向重復(fù)序列。反轉(zhuǎn)重復(fù)（invertedrepeated)：由反方向互補的兩個DNA片段組成，兩個反轉(zhuǎn)重復(fù)序列又叫回文序列(palindromesequence)。鏡像重復(fù)(mirrorrepeat)：由反方向完全相同的兩個序列組成。直接重復(fù)(directrepeat)：由同一方向完全相同的兩個序列組成。正向重復(fù)序列、反向重復(fù)序列。2.轉(zhuǎn)座子（transposon)一類較大的可移動成分。除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)并決定宿主菌遺傳性狀的基因。轉(zhuǎn)座子中的轉(zhuǎn)位酶常稱為轉(zhuǎn)座酶，其功能是介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子插入到DNA的其它部位。復(fù)合型Tn：由一個基因序列及兩側(cè)臂組成。兩側(cè)臂為IS序列。TnA族Tn:兩端是正向或反向重復(fù)序列，中間有與Tn功能相關(guān)的基因（編碼轉(zhuǎn)座酶）及抗生素抗性基因?？偸亲鳛橐粋€單位進行轉(zhuǎn)座，其末端不能單獨轉(zhuǎn)座。接合型Tn：3.Transposablephage具有轉(zhuǎn)座功能的溶源性噬菌體，包括Mu和D108等。轉(zhuǎn)位作用的機制四、細菌基因組學(xué)研究及意義小結(jié)掌握質(zhì)粒、轉(zhuǎn)位因子、插入序列、轉(zhuǎn)座子的基本概念。熟悉原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點與功能。第三節(jié)真核生物基因組

基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點基因組結(jié)構(gòu)人類基因組的組織結(jié)構(gòu)特征人類基因組計劃一、真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點1、體細胞多為二倍體2、基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜3、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子4、含有大量重復(fù)序列5、非編碼序列（non-codingsequenceNCS)占90%以上。

6、斷裂基因（splitgene)。

基因與基因間的非編碼序列為間隔DNA（spacerDNA).7、功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族，可串聯(lián)在一起，也可相距很遠。8、有自私基因（selfishDNA).二、真核生物基因組的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因順式作用元件（cis-actingelement)基因家族(genefamily)重復(fù)序列(repeatsequence)端粒(telomere)（一）結(jié)構(gòu)基因定義：可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一段DNA稱為結(jié)構(gòu)基因。內(nèi)含子外顯子（二）順式作用元件（Cis-actingelements）定義：與結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的DNA序列。包括啟動子、增強子、上游啟動子元件、反應(yīng)元件、加尾信號等。反式作用因子（trans-actingelements):可通過結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。轉(zhuǎn)錄因子（TF）：直接、間接結(jié)合RNA聚合酶的反式作用因子，均為蛋白質(zhì)。1.啟動子（promoter)是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點的上游-25bp處，本身不被轉(zhuǎn)錄。啟動子必須與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合才能被RNA聚合酶識別與結(jié)合。TATA盒。2.上游啟動子元件（upstreampromoterelements)TATA盒上游的一些特定的DNA序列。反式作用因子能與這些元件結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率。上游啟動子元件包括CAAT盒、CACA盒及GC盒。CAAT盒：5`GCNCAATCT3`GC盒：5`CCGCC3`CACA盒：GCCACACCC3.反應(yīng)元件（responseelement)定義：能介導(dǎo)基因?qū)毎獾哪撤N信號產(chǎn)生反應(yīng)的DNA序列，稱為反應(yīng)元件。一些信息分子的受體被細胞外信息分子激活后，能與特異DNA序列的結(jié)合，調(diào)控基因的表達。。糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（GRE）4.增強子（enhancer)指能使和它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。其中含有多個能被反式作用因子識別與結(jié)合的順式作用元件，能增強鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。增強子通常具有下列性質(zhì)：1、增強效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍。2、增強效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論增強子以什么方向排列（5‘→3’或3‘→5’），甚至和基因相距較遠，或在基因下游，均表現(xiàn)出增強效應(yīng)；

3、大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個核心序列：GTGTGGAAAG，是產(chǎn)生增強效應(yīng)時所必需的；

4、增強效應(yīng)有嚴密的組織和細胞特異性，說明只有特定的蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）參與才能發(fā)揮其功能；增強子的作用原理：

一種觀點認為，增強子為轉(zhuǎn)錄因子提供進入啟動子區(qū)的位點。第二種認為，增強子能改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象。因為增強子區(qū)域容易發(fā)生從B-DNA到Z-DNA的構(gòu)象變化。

增強子的功能是可以累加的。SV40增強子序列可以被分為兩半，每一半序列本身作為增強子功能很弱，但合在一起，即使其中間插入一些別的序列，仍然是一個有效的增強子。因此，要使一個增強子失活必須在多個位點上造成突變。負增強子（negativeenhancer)又稱沉默子（silencer)：負調(diào)控序列。1986年Maniatis5.加尾信號結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個保守序列AATAAA與下游一段GT豐富區(qū)或T豐富區(qū)共同構(gòu)成polyA加尾信號。與RNA聚合酶結(jié)合的延長因子能識別這種結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合，然后在AAUAAA下游10~30個堿基的部位切斷RNA并加上polyA尾巴。（三）基因家族（genefamily)指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。假基因（pseudogene):在多基因家族中并不能表達出有功能的產(chǎn)物的基因?；蚣易宓念愋停?、核酸序列相同即為多拷貝基因。如rRNA基因家族，tRNA基因家族，組蛋白基因家族。球蛋白基因2、核酸序列高度同源如人類生長激素基因家族包括三種激素的基因，人生長激素、人胎盤促乳素和催乳素，它們的序列高度同源。3、編碼產(chǎn)物有同源功能基因序列的相似性可能較低，但基因編碼的產(chǎn)物具有高度保守的功能區(qū)。如src癌基因家族4、編碼產(chǎn)物具有小段保守基序有些基因家族中各成員的DNA序列可能不明顯相關(guān)，而所編碼的產(chǎn)物卻有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序。5.基因超家族（genesuperfamily)：指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族。基因家族與基因超家族的區(qū)別：

基因家族：核苷酸序列或產(chǎn)物有一定的同源性。

基因超家族：可能起源于相同的祖先基因，但它們功能并不一定相同。免疫球蛋白基因超家族：與免疫有關(guān)的一些分子的基因與免疫無關(guān)的成員的基因絲氨酸蛋白酶基因超家族蛋白質(zhì)水解酶載脂蛋白（四）重復(fù)序列（repeatsequence)1、高度重復(fù)序列：這類重復(fù)序列一般較短，長10-300bp，在哺乳類基因組中重復(fù)106次左右，占人的基因組DNA序列總量的20%，功能不知。如衛(wèi)星DNA和反向重復(fù)序列。2、中度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)為101~105。3、單拷貝序列：大多數(shù)編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因?qū)龠@一類。（五）端粒（telomere)真核細胞線性染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由簡單重復(fù)富含G的DNA序列及端粒結(jié)合蛋白組成。功能：保證DNA的完整復(fù)制保護染色體末端決定細胞的壽命

三、人類基因組的組織結(jié)構(gòu)特征（一）人類基因組的重復(fù)順序1、反向重復(fù)序列（invertedrepeats)：5%2、串聯(lián)重復(fù)序列（tandemrepeats):具有一個固定的重復(fù)單位，頭尾相連。10%

（1）編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)順序（2）非編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)順序3、散在重復(fù)順序（interspersedrepeats)反向重復(fù)序列（invertedrepeats)

指兩個順序相同的互補拷貝在DNA鏈上呈反向排列。一種形式為兩個反向排列的拷貝之間隔著一段間隔順序如：5`AAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTT3`3`TTTGGTGGCGACCATCGCCACCAAA5`另一種是兩個拷貝反向串聯(lián)在一起，也稱為回文結(jié)構(gòu)（palindrome).串聯(lián)重復(fù)序列（tandemrepeats):1、編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)順序：如組蛋白基因。編碼五種組蛋白的基因密集在一個基本的7.0kb的重復(fù)單位上，各重復(fù)單位之間有高度的序列一致性。2、非編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)順序：常存在于間隔DNA和內(nèi)含子內(nèi)。是組成衛(wèi)星DNA（satelliteDNA)的基礎(chǔ)。衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）定義：在蔗糖或氯化銫密度梯度離心中所觀察到的位于主帶DNA旁邊的小帶DNA。按重復(fù)單位的長短，又可分為大衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。

1.大衛(wèi)星DNA（macrosatelliteDNA)又稱為經(jīng)典DNA。由大的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，總長度100kb~幾個Mb。根據(jù)浮力密度的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和α、β衛(wèi)星DNA。各類型都由不同的重復(fù)順序家族組成。小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA)由中等大小的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，總長約0.1~20kb，分布在所有染色體，往往近于端粒處。高度可變的衛(wèi)星DNA、端粒DNA微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA):重復(fù)單位為1~5bp,重復(fù)次數(shù)為10~60次，總長度小于150bp，常見以(AC)n和(TG)n二聚核苷酸為重復(fù)單位，由Miesfeld1981年發(fā)現(xiàn)。人類基因組DNA中平均每6～10kb就有一個微衛(wèi)星DNA

的重復(fù)位點，其多態(tài)性成為法醫(yī)中的個人識別和親子鑒定的豐富來源。散在重復(fù)順序（interspersedrepeats)1、短散在核元件（shortinterspersednuclearelementsSINEs),主要是Alu重復(fù)序列家族。序列中有限制酶Alu的酶切位點（AGCT）而得名。重復(fù)次數(shù)30~50萬，散在分布于基因組中，與基因表達調(diào)控有關(guān)。2、長散在核元件（longinterspersednuclearelements,LINEs):KpnⅠ重復(fù)順序。3kb人類基因組DNA的多態(tài)性DNA多態(tài)性：個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為DNA（基因）多態(tài)性。分類：DNA位點多態(tài)性（DNAsitepolymorphism)限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性（tandemrepeatspolymorphism)DNA位點多態(tài)性（DNAsitepolymorphism)由于等位基因間在特定位點上DNA序列存在差異造成的。ABO血型組是發(fā)現(xiàn)的第一個人類DNA多態(tài)性。人類白細胞抗原（HLA）是最復(fù)雜最具多態(tài)性的體系，位于6號染色體。僅其中的DR抗原編碼位點有60多個等位基因。限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）用同一種限制酶消化不同個體的DNA時，會得到長度各不相同的限制性片段類型。當(dāng)堿基組成的變化改變了限制性內(nèi)切酶識別位點時，就會得到不同的限制性片段類型，這樣的位點稱為多態(tài)性位點。通過限制酶酶切片段的長度多態(tài)性來揭示DNA堿基組成不同的技術(shù)稱為限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP技術(shù)）。PFLP的基礎(chǔ)是高度重復(fù)序列和點突變。串聯(lián)重復(fù)順序多態(tài)性重復(fù)單位很小，但重復(fù)次數(shù)有較大的變化，主要發(fā)生在小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA中，也稱為可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列(variablenumberoftandemrepeatsVNTRS)。小衛(wèi)星DNA多態(tài)性：由于重復(fù)單位的數(shù)目不同引起。微衛(wèi)星DNA多態(tài)性：由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)不同而具有高度的遺傳多態(tài)性。四、Humangenomeproject(HGP)人類基因組作圖遺傳圖（geneticmap)物理圖（physicalmap)轉(zhuǎn)錄圖(transcriptionmap)序列圖(sequencemap)基因的鑒定模式生物的基因組計劃人類基因組多樣性計劃本章主要內(nèi)容：

1.DNA復(fù)制的基本特點

2.原核生物DNA復(fù)制的特點

3.真核生物DNA復(fù)制的特點

4.DNA損傷與修復(fù)

5.逆轉(zhuǎn)錄

6.RNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNAProtein遺傳中心法則（thecentral

dogma)遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞規(guī)律

復(fù)制1958F.Crick遺傳中心法則1970H.Temin逆轉(zhuǎn)錄第一節(jié)DNA的復(fù)制

復(fù)制DNA的生物合成 逆轉(zhuǎn)錄DNA復(fù)制（DNAreplication）：

以親代DNA為模板合成兩個相 同的子代DNA的過程。一、DNA復(fù)制的基本特點1.復(fù)制從特定的區(qū)域（oriC）開始2.復(fù)制的方向多樣化3.半保留復(fù)制（self-conservativereplication）4.半不連續(xù)復(fù)制5.復(fù)制的過程復(fù)雜1.復(fù)制從特定的區(qū)域（oriC）開始幾個相關(guān)概念：復(fù)制子:基因組中能單獨進行復(fù)制的單位。每個起始點到終止點的區(qū)域為一個復(fù)制子。起始點（originofreplication,ori):原核生物DNA分子中只有一個，長度200bp左右。真核生物有多個復(fù)制起始點。終止點（ter）：D、A、C、B（23bp共有序列）Tus（terminatorutilizationsubstance）識別終止序列。復(fù)制的方向：單向或雙向

復(fù)制子

復(fù)制叉

(replicationfork)

復(fù)制時雙鏈打開，分開成兩股，新鏈沿 著張開的模板生成，復(fù)制中形成的這種Y

字形的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。解鏈方向2.復(fù)制的方向多樣化單向復(fù)制雙向復(fù)制3.半保留復(fù)制1958年，Meselson和Stahl首次用實驗證實了DNA的半保留復(fù)制。步驟：用普通培養(yǎng)基（14N）培養(yǎng)15N標記的大腸桿菌，用CsCl密度梯度離心法分析DNA。N15-DNA中等密度DNA中等密度DNAN14-DNA半保留復(fù)制(semiconservativereplication)

復(fù)制時，親代的雙鏈DNA解開成兩條單鏈，然后各自作為模板指導(dǎo)合成新的互補鏈。所形成的兩個子代DNA分子與親代DNA分子堿基順序完全相同（復(fù)制）。每個子代DNA分子中的一條鏈來自親代，另一條鏈為新合成的（半保留），稱半保留復(fù)制。

半保留復(fù)制的意義

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代

DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定的分子基礎(chǔ)。

4.半不連續(xù)復(fù)制

半不連續(xù)復(fù)制：DNA復(fù)制時一條鏈為連續(xù)合成，另一條鏈為不連續(xù)的片斷合成稱半不連續(xù)復(fù)制。 前導(dǎo)鏈（領(lǐng)頭鏈）(leadingstrand)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進行的，得到一條連續(xù)的子鏈。

隨從鏈(laggingstrand)

復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等解開足夠長度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，得到的子鏈由不連續(xù)的片段所組成。岡崎片段(Okazakifragment)復(fù)制的基本過程：

①DNA雙鏈解開

②RNA引物的合成

③DNA鏈的延長

④切除引物、填補缺口、連接DNA片段

⑤切除和修復(fù)錯配堿基

二、原核生物染色體DNA的復(fù)制（一）參與DNA復(fù)制的酶與蛋白質(zhì)1.DNA聚合酶（DNApol）催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。DNApolⅠ、DNApolⅡ、DNApolⅢDNApolⅠ

1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取。DNApolⅠ是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主。用特異的蛋白酶處理，可把DNApolⅠ水解為兩個片段，即在F，G螺旋之間發(fā)生斷裂。小片段：323個氨基酸殘基，5`→3`外切酶活性大片段或稱Klenow片段：604個氨基酸殘基，具有DNA聚合酶活性和3`→5`外切酶活性HONMLKPJRIEDFCGBQADNA-polI（36）小片段大片段

①聚合作用：5`→3`

②3`→5`外切酶活性：校對功能

③5`→3`外切酶活性：引物切除、損傷修復(fù)在大腸桿菌中的主要功能是切除引物，填補岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)DNApolⅡ：功能：5`→3`聚合酶活性及3`→5`外切核酸酶活性。DNApolⅢ:由10個亞基組成，分別為α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶。α亞基：5`→3`聚合酶活性ε亞基：3`→5`外切酶,校對和編輯θ為裝配必須大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ

E.coliDNA聚合酶Ⅲ不對稱二聚體

ε

''''

ε

原核生物的DNA聚合酶種類pol-Ipol-IIpol-III5′→3′聚合酶活性+++3′→5′外切酶活性+++5′→3′外切酶活性+–+功能切除引物填補空隙修復(fù)合成不清復(fù)制的主要酶

真核生物的DNA聚合酶已發(fā)現(xiàn)5種，都有5`→3`核酸外切酶活性。DNA-pol

復(fù)制中延長隨從鏈DNA-pol

沒有其他pol時才起作用DNA-pol

催化線粒體DNA的復(fù)制DNA-pol

復(fù)制中延長領(lǐng)頭鏈DNA-pol

校讀、修復(fù)和填補缺口2.引物酶依賴DNA的RNA聚合酶。催化RNA引物的合成。

RNA引物：在DNA模板的復(fù)制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，為DNA聚合提供3′-OH末端。3.DNA解鏈酶(helicase)

模板對復(fù)制的指導(dǎo)作用在于堿基的準確 配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內(nèi)部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。 解鏈酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)，當(dāng)時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。

4.DNA拓撲異構(gòu)酶(topoisomerase)

:

拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保 持物體不變的性質(zhì)。

拓撲異構(gòu)酶：是一類可改變DNA拓撲性質(zhì) 的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又 能連接磷酸二酯鍵?？伤沙贒NA超螺旋， 有利于DNA解鏈。

拓撲異構(gòu)酶I（topoI）:

在原核生物曾被稱為－蛋白。

主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使

DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不打結(jié)，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。

拓撲異構(gòu)酶II（

topoII）:

在原核生物又叫旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)。能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進入負超螺旋，再連接斷端。

5.單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)

:

SSB曾被稱為螺旋反穩(wěn)定蛋白（HDP）。在大腸桿菌，它是由177個氨基酸殘基組成的同四聚體，結(jié)合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。 功能：SSB與解開的DNA單鏈緊密結(jié)合，防止重新形成雙鏈，并免受核酸酶降解。在復(fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)。解螺旋酶helicaseDNA拓樸異構(gòu)酶DNAtopoisomerase單鏈DNA結(jié)合蛋白

SSB(singlestrandDNAbindingprotein)解開、理順DNA鏈、維持DNA單鏈狀態(tài)

6.DNA連接酶（DNAligase）連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P

末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應(yīng)需要ATP。ATP催化兩段DNA之間的連接

DNA連接酶在復(fù)制、DNA修復(fù)、

重組、剪接中均起縫合缺口作用。是重要的工具酶之一。三種酶連接作用比較DNA聚合酶

引物或延長中的新鏈連接酶

復(fù)制中不連續(xù)的兩條單鏈拓撲酶

切斷、整理后的兩鏈(二)原核生物DNA復(fù)制過程1.復(fù)制的起始2.DNA鏈的延長3.復(fù)制的終止1.復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始就是要解開雙鏈和生成引物。

(一)DNA解成單鏈 由拓撲異構(gòu)酶松弛超螺旋，解鏈酶解開雙鏈，SSB結(jié)合到單鏈上使其穩(wěn)定。

復(fù)制起始的解鏈需要多種蛋白質(zhì)參與。這些蛋白質(zhì)與復(fù)制起始點的特有序列結(jié)合，促使其鄰近的DNA解鏈。復(fù)制過程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用

(二)引物合成引發(fā)體引導(dǎo)引物酶到達適當(dāng)?shù)奈恢煤铣梢铩?/p>

引物是由引物酶催化,以DNA為模板,NTP為底物合成的短鏈RNA分子,長度約為十幾個到幾十個核苷酸不等。引物的合成方向也是5′→3′

方向。DNA的聚合就是在引物的3′－OH上進行的。

2.DNA鏈的延長延長的生化過程：

在DNA聚合酶催化下，以解開的單鏈為模板，以四種dNTP為原料，進行聚合作用。即新進入的dNTP與引物3′－OH形成磷酸二酯鍵，由5′3′方 向延長子鏈。

原核生物為DNApolⅢ

真核生物為DNA聚合酶α和δ，其中α與隨從鏈的合成有關(guān)，δ與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)

3.復(fù)制的終止

1.隨從鏈不連續(xù)片段的連接

2.原核生物在復(fù)制終止點的匯合

3.

真核生物端粒的合成

(一)不連續(xù)片段的連接

(二)原核生物復(fù)制的終止原核生物環(huán)狀DNA為雙向復(fù)制，復(fù)制片段在復(fù)制的終止點匯合。

(三)真核生物復(fù)制的終止

染色體DNA呈線性，復(fù)制在末端停止。端粒(telomere):真核生物線性染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，由簡單重復(fù)富含G、T的DNA序列及端粒結(jié)合蛋白組成。功能：保證DNA的完整復(fù)制；保護染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解；解決染色體復(fù)制時末端丟失問題(壽命長短

)。端粒酶:由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶。兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用。端粒與衰老實驗：1.體外培養(yǎng)的細胞端粒的長度隨細胞逐代相傳而縮短，丟失到一定程度后細胞隨之發(fā)生衰老和死亡。2.在無端粒酶活性的成纖維細胞中表達端粒酶時，端粒的縮短和細胞的衰老都受到抑制。結(jié)論：細胞的衰老可能是由端粒驅(qū)動的。端粒的平均長度隨著細胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長而變短，可導(dǎo)致核生物染色體穩(wěn)定性下降，并導(dǎo)致衰老。其分子機制在于，線形DNA分子不能從末端核苷酸外合成RNA引物，如此染色體將逐代縮短。但是在生殖細胞、胚胎細胞和腫瘤細胞中，由于有端粒酶，所以并不出現(xiàn)這種情況。不同個體的端粒初始長度也不同，但對每個個體來說，它們則可隨時間流逝而變短。研究人員最近還發(fā)現(xiàn)，患有一種可加速衰老的遺傳疾病的人具有異常短的端粒，進一步表明端粒在衰老過程中所起的作用。然而在正常情況下，比較長的端粒就意味著長壽嗎？為了弄清這一點，鹽湖城猶他大學(xué)的遺傳學(xué)家RichardCawthon及其同事檢查了143名老年男女的端粒長度(這些人曾經(jīng)在至少15年前提供過血樣)。研究小組在《柳葉刀》雜志上報告說，那些端粒短于平均長度的實驗參與者比那些端粒較長的參與者早死４到５年，而且死于心臟病的幾率比后者高３倍多。端粒最短的參與者（即最短的那25％）死于傳染病的幾率比那些端粒較長的人高８倍多。達拉斯市得克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的分子生物學(xué)家JerryShay表示，這是“關(guān)于端?？赡芟拗屏巳祟悏勖牡谝粭l線索”。但他也提醒說，需要進行更多的研究（使用更多的參與者）以弄清其中的聯(lián)系。Cawthon指出，例如，弄清端粒變短是否確實導(dǎo)致了疾病或僅僅是其他過程的副作用，這點很重要。第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，稱逆轉(zhuǎn)錄。一、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscription)1970年，Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，獲1975年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。

逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′羥基末端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補DNA(complementaryDNA,cDNA)，它與RNA模板形成RNA-cDNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄酶不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因

組復(fù)制過程第一階段：合成負股cDNA的大部分第二階段：以負股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。第三階段：完成cDNA的全部復(fù)制。乙肝病毒基因組的復(fù)制其復(fù)制需通過逆轉(zhuǎn)錄過程經(jīng)RNA中間體實現(xiàn)，其DNA聚合酶也是一種逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用1.用于合成cDNA，建立cDNA文庫，獲得基因或探針。方法：提取組織細胞的mRNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后被克隆入質(zhì)?；蚴删w載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞后獲得克隆群體。可代表某一特定基因。

2.與PCR連用RT-PCR。病毒RNA復(fù)制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質(zhì)炎病毒。RNA（+）→蛋白質(zhì)（酶）→RNA復(fù)制2、病毒含有負鏈RNA和復(fù)制酶如狂犬病毒。RNA（—）→RNA（+）→蛋白質(zhì)、復(fù)制病毒RNA。3、病毒含有雙鏈RNA和復(fù)制酶。如呼腸孤。雙鏈RNA→RNA（+）→蛋白質(zhì)→RNA（—）→雙鏈RNA4、逆轉(zhuǎn)錄病毒。小結(jié)掌握：半保留復(fù)制，半不連續(xù)復(fù)制，領(lǐng)頭鏈，隨從鏈，端粒，端粒酶，逆轉(zhuǎn)錄的基本概念；及逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制的過程。熟悉：原核生物DNA復(fù)制的過程，以及復(fù)制過程中涉及到的各種酶、蛋白因子；逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用；

轉(zhuǎn)錄翻譯DNARNAProtein復(fù)制

第一節(jié)轉(zhuǎn)錄

生物體以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的相似點：

1.模板均為DNA 2.延長機理都是形成磷酸二酯鍵

3.方向均為5′→3′4.都遵從堿基配對規(guī)則

5.產(chǎn)物均為核苷酸鏈

轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的區(qū)別復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板DNA雙鏈DNA的一條鏈原料dNTP(N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物DNARNA配對A-T、G-CA-U、T-A、G-C

一、原核生物RNA的生物合成

（一）RNA聚合酶(RNA-pol)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組 成的五聚體（

2

）

2

2

E.coli

RNA聚合酶組分及功能亞基分子量功能

36512決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄

150618催化功能

155613結(jié)合DNA模板

70263辨認起始點

原核生物的RNA聚合酶都受一類抗 結(jié)核藥利福平或利福霉素的特異性抑制。 這類藥物能與RNA聚合酶的

亞基特異結(jié) 合，從而影響酶的活性。

（二）轉(zhuǎn)錄模板

能轉(zhuǎn)錄出RNA的DNA區(qū)段模板鏈(templatestrand)信息鏈模板鏈信息鏈(sensestrand)

不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)

DNA片段轉(zhuǎn)錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板這種轉(zhuǎn)錄方式稱作不對稱轉(zhuǎn)錄。模板鏈并非永遠在同一單鏈上。

（三）原核生物的轉(zhuǎn)錄過程 起始(initiation)

延長(elongation)

終止(termination)

1.轉(zhuǎn)錄起始

1.RNA聚合酶結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域

2.

DNA雙鏈解開，以一條鏈為模板，合成第一個磷酸二酯鍵

2.轉(zhuǎn)錄延長

轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）： 在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的

DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。3.轉(zhuǎn)錄終止DNA終止轉(zhuǎn)錄信號RNA聚合酶識別轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶及新RNA鏈脫落轉(zhuǎn)錄完成

（1）依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

2.不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

DNA模板上靠近終止處，有特殊的 堿基序列，轉(zhuǎn)錄出的RNA產(chǎn)物形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。

（四）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工1.tRNA前體的加工①剪接作用②添加和修復(fù)3’端CCA序列③堿基的化學(xué)修飾

剪接作用:5’前導(dǎo)序列RNaseP3’拖尾序列RNaseF、RNaseQ間隔序列RNaseⅢ

、RNaseQ、連接酶

添加和修復(fù)3’端CCA序列由tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化形成3’端CCA序列

堿基的化學(xué)修飾脫氨、甲基化、羥基化等化學(xué)修飾而生成的。如氨基酸臂上5′的4-硫尿嘧啶（4tu），D臂上的2甲基鳥嘌呤（2mG）

原核生物有16S、23S及5S三種rRNA，這三種rRNA均存在于30S的rRNA前體中。轉(zhuǎn)錄作用完成后，在RNaseⅢ催化下，將rRNA前體切開產(chǎn)生16S、25S及5SrRNA的中間前體。進一步在核酸酶的作用下，切去部分間隔序列，產(chǎn)生成熟的16S、23S及5SrRNA，還有成熟的tRNA。并對16SrRNA進行甲基化修飾，生成稀有堿基。

二、真核生物RNA的生物合成(一)真核生物RNA聚合酶Ⅰ（A）Ⅱ（B）Ⅲ（C）定位核仁核質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5.8S、18S、28SrRNAmRNAtRNA、5SrRNA對利福霉素不敏感不敏感不敏感

（二）真核生物的轉(zhuǎn)錄過程

起始延長終止

1.轉(zhuǎn)錄起始形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與DNA的特殊序列及RNA聚合酶結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄的蛋白因子稱轉(zhuǎn)錄因子

(TF）。相應(yīng)于RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的TF，分別稱為TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又分為TFⅡA、TFⅡB……等。TFⅡD是唯一能結(jié)合TATA盒的蛋白質(zhì)，它是由TBP和TAF組成。

RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄起始

2.延長3.真核生物的轉(zhuǎn)錄終止DNA轉(zhuǎn)錄終止信號RNA聚合酶