細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查

關(guān)于細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查兩個分隔的世界

微生物人員的無奈標(biāo)本采集不合格有些病原菌難以生長或生長周期長不是所有細(xì)菌都能做藥敏試驗不是所有培養(yǎng)出的細(xì)菌都是致病菌沒有培養(yǎng)出細(xì)菌不代表沒有感染不是所有細(xì)菌或所有藥物都有判斷標(biāo)準(zhǔn)臨床醫(yī)生不主動聯(lián)系試驗室人員臨床醫(yī)生的抱怨苛養(yǎng)菌檢出率低結(jié)果重復(fù)性差報告速度慢感染菌與污染菌不易區(qū)分藥敏結(jié)果與治療反應(yīng)存在差第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天關(guān)注微生物報告時效性問題操作最簡單費用最低標(biāo)本直接涂片用時最短顯微鏡檢測結(jié)果最直觀

可在第一時間向臨床報告鏡下所見，醫(yī)生根據(jù)鏡檢結(jié)果可作初步診斷，并以此進(jìn)行針對性用藥。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天主要內(nèi)容標(biāo)本涂片制作方法常用染色方法及技巧如何閱片第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)本涂片制作方法痰液：棉簽挑取干酪樣或膿性痰部分0.05-0.1ml，均勻涂抹成卵圓形痰

膜（約2cm長），每張玻片只涂一份標(biāo)本膿液：同痰涂片大便：取粘液便或血便少量均勻涂布玻片，不可過厚無菌體液：標(biāo)本足量，>1ml，離心或甩片集菌后涂片(3000r/min15min）

標(biāo)本量少，直接涂片病灶組織或干酪塊：先用組織研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片，

注意絲狀真菌

第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量控制涂片的厚薄以鏡下見到單層細(xì)胞為宜染色結(jié)果細(xì)胞核、漿清晰，胞內(nèi)吞噬物清楚可見革蘭染色陰、陽性分明

涂片的制備水平及染色的質(zhì)量，直接影響到鏡檢的結(jié)果第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天標(biāo)本染色方法及技巧根據(jù)檢測目標(biāo)的不同選擇最適合的染色方法病原體染色方法細(xì)菌、真菌革蘭染色真菌10%KOH、乳酸酚棉藍(lán)新型隱球菌墨汁染色結(jié)核分枝桿菌抗酸染色、熒光染色奴卡菌弱抗酸染色耶氏肺孢子菌六胺銀染色細(xì)胞壁缺陷菌吖啶橙染色第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天革蘭染色涂片固定待涂片干后加熱固定，火焰固定時菌膜朝上，以中

等速度通過火焰3此即可（溫度不宜過高，以防菌體蛋白

變性，影響染色結(jié)果），也可用乙醇或甲醇固定。染色

龍膽紫10s水洗甩干

碘液10s水洗甩干

脫色液10-20s水洗甩干

沙黃10s水洗待干鏡檢油鏡下觀察，紫色→革蘭氏陽性

紅色→革蘭氏陰性第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天革蘭染色注意事項注意取材部位，涂片的厚薄。染色時間應(yīng)視標(biāo)本種類、涂片厚薄調(diào)整，婦科白帶標(biāo)本染色時間應(yīng)燒延長（>10s）,以獲得更好的染色效果。脫色不宜過度。固定不可用酒精燈直接加熱，避免影響染色效果。染液用完后及時改上蓋子，避免揮發(fā)。被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基條件、菌齡的不同影響染色效果，如培養(yǎng)時間過長，革蘭陽性菌可能染成陰性。18—24小時為宜。某些菌存在染色困難，不易脫色的情況，出現(xiàn)染色不均，陰陽不定（某些G+b、鮑曼不動桿菌等）。注意生物安全，自我防護(hù)。第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天抗酸染色涂片固定同革蘭染色染色

石碳酸復(fù)紅≥10min水洗甩干

酸性酒精1-2min水洗甩干（必要時可重復(fù)）

亞甲基藍(lán)30s水洗待干

合格的片子肉眼觀察痰膜呈亮藍(lán)色，無紅色斑塊鏡檢抗酸菌呈紅色，背景及其他菌呈藍(lán)色第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天抗酸染色注意事項染色時避免玻片上的染液干燥直接涂抹的痰膜厚薄適宜，以透過痰膜看報紙上的5號字跡較模糊為適宜的厚度香柏油能溶解復(fù)紅染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝結(jié)，對油鏡頭造成傷害，故避免使用香柏油，應(yīng)使用專用油鏡油酸性酒精用盡，可自制5%的鹽酸酒精作為脫色液有時同一個抗酸菌體上，紅色的深淺亦有不同，鏡檢時注意冬季室溫過低，染色時間適當(dāng)延長試劑用完后及時蓋好，避免揮發(fā)注意生物安全，自我防護(hù)第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天墨汁染色標(biāo)本（腦脊液）離心取沉淀涂片在標(biāo)本涂片處滴加1滴墨汁，加蓋玻片在低倍鏡下找有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍或油鏡確認(rèn)結(jié)果：新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，細(xì)胞壁明顯，有時有出芽現(xiàn)象，背景黑色

注意事項

腦脊液與墨汁的最適比例，墨汁太多影響觀察腦脊液離心后涂片，離心10-30min痰液、支氣管灌洗液均可作為隱球菌的檢測標(biāo)本，防止漏檢第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天乳酸酚棉藍(lán)染色在玻片上滴加1滴乳酸酚棉藍(lán)染液剪一段約1cm長的透明膠帶，將一端貼在棉拭子木棒的一端，形成旗幟樣將膠帶粘性一面按在菌落表面，將菌絲粘在膠帶上并平放進(jìn)入染液，取下木棒，再膠帶表面再滴加一滴染液，蓋上蓋玻片使用顯微鏡在低倍鏡、高倍鏡或油鏡下觀察真菌形態(tài)

第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天科茲洛夫斯基染色涂片，可混合大腸桿菌做對比，干燥、固定滴加2%沙黃水溶液，略加熱，使之冒蒸汽，約30s—1min后水洗1%孔雀綠染液復(fù)染2—3min，也可用堿性美藍(lán)染色1—2min吸水紙吸干后鏡檢結(jié)果布氏桿菌呈淡紅色球桿菌，其它菌或細(xì)胞呈綠色或藍(lán)色第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天六胺銀染色涂片固定染色

1%高碘酸，氧化10min，流水沖洗2%鐵明礬10min,流水沖洗

玻片放入60℃預(yù)熱20min的工作液中40min左右，每5min觀察

一次，至涂片呈淡褐色，流水沖洗0.2%氯化金調(diào)色3—5min，流水沖洗2%硫代硫酸鈉固定3min，流水沖洗

置60℃烤箱內(nèi)烤干，封片結(jié)果油鏡下肺囊蟲包囊呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，包囊呈黑色第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量控制每天質(zhì)控與標(biāo)本同步進(jìn)行一年一次人員比對，以當(dāng)次比對職稱最高人員結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)染色方法質(zhì)控菌株結(jié)果革蘭染色ATCC25923（金黃色葡萄球菌）ATCC25922（大腸埃希菌）紫色紅色抗酸染色ATCC14468（恥垢分枝桿菌）ATCC25922（大腸埃希菌）紅色藍(lán)色第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天閱片第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天如何閱片標(biāo)本合格與否的判定感染的確認(rèn)（炎癥細(xì)胞）炎癥性質(zhì)的鑒別（單個核、分葉核或嗜酸細(xì)胞）感染性質(zhì)鑒別（細(xì)菌、真菌、螺旋體、寄生蟲等）微生態(tài)失衡與否及程度（菌群失調(diào)）可疑致病菌的確認(rèn)（根據(jù)微生物與炎性細(xì)胞的關(guān)系）第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天首先判斷標(biāo)本合格與否開放性標(biāo)本（痰液、尿液、傷口標(biāo)本等）肉眼觀察（痰液粘稠、膿性、血性）根據(jù)鏡下細(xì)胞種類，數(shù)量及細(xì)菌種類判斷上皮細(xì)胞多，炎癥細(xì)胞少，多不合格第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天強(qiáng)烈提示感染的鏡下現(xiàn)象吞噬現(xiàn)象

包括中性粒細(xì)胞的非特異性吞噬和巨噬細(xì)胞的特異性吞噬，與粘附區(qū)別第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天包裹現(xiàn)象

有些病原微生物自身具有抗吞噬能力（莢膜），炎性細(xì)胞不能將

其吞噬，而是包裹起來，形成膿球第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

伴行現(xiàn)象

未被炎性細(xì)胞包裹的病原菌分布在炎性細(xì)胞周圍，需與污染菌鑒別

第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天建議對大家公認(rèn)有臨床致病意義的細(xì)菌：結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌、奴卡菌、白喉棒狀桿菌、隱球菌等一經(jīng)檢出應(yīng)立刻報臨床。對來自無菌部位的標(biāo)本并排除污染的鏡下細(xì)菌一經(jīng)檢出立刻報臨床。呼吸道及其他污染部位的條件致病菌（肺炎鏈球菌、嗜血桿菌、卡他莫拉菌銅綠假單胞菌、不動桿菌等）需結(jié)合鏡