和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的抑制作用研究

和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的抑制作用研究【摘要】目的：具核梭桿菌作為牙周病的常見病原菌之一，引起了口腔感染性疾病的發(fā)生和傳播。為了治療該類疾病，抗生素的濫用使得病菌產(chǎn)生耐藥性的問題頻發(fā)，對(duì)人類健康造成危害。因此本課題探究了和厚樸酚對(duì)改善和解決具核梭桿菌通過生物被膜發(fā)揮作用產(chǎn)生耐藥性問題的作用。方法：以具核梭桿菌作為受試菌株，以和厚樸酚作為受試藥，以氯己定作為陽性藥對(duì)照。首先采用微孔板法構(gòu)建具核梭桿菌生物被膜體外模型；并通過CCK-8法、結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線和基質(zhì)總量生長(zhǎng)曲線；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生物被膜的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)，這三種方法驗(yàn)證生物被膜模型構(gòu)建成功與否。其次，采用微量稀釋法測(cè)定和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的最低抑膜濃度（MBIC）；采用CCK-8和結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜代謝活性及基質(zhì)總量的影響；通過SEM觀察藥物干預(yù)后受試菌株生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)及形態(tài)變化。結(jié)果：根據(jù)三種驗(yàn)證方法得知具核梭桿菌受試菌株的生物被膜初始黏附期為0-36h，聚集期為36-48h，成熟期為48-96h。和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌的最佳藥物干預(yù)濃度為60μg/mL，中藥單體和厚樸酚可在一定程度上降低具核梭桿菌不同階段形成的生物被膜的代謝活性（P<0.05）以及減少生物被膜基質(zhì)總量（P<0.05），破壞生物被膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體死亡。結(jié)論：和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌黏附期、聚集期和成熟期生物被膜的形成有一定的抑制作用，進(jìn)而有望抵抗耐藥性的產(chǎn)生。因此，為開發(fā)中藥單體和厚樸酚成為一種新型的生物被膜抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】和厚樸酚；具核梭桿菌；生物被膜StudyonInhibitoryeffectofhonokiolonthebiofilmofFusobacteriumnucleatum[Abstract]Objective:Asoneofthecommonpathogensofperiodontaldisease,Fusobacteriumnucleatumcausestheoccurrenceandspreadoforalinfectiousdiseases.Inordertotreatthistypeofdisease,theabuseofantibioticscausesfrequentproblemsofbacterialresistance,posingathreattohumanhealth.Therefore,thepurposeofthisstudyistoexplorenewdrugstoimproveandsolvetheproblemofdrugresistancecausedbyFusobacteriumnucleatumactingthroughbiofilms.Method:UsingFusobacteriumnucleatumastheteststrain,honokiolasthetestdrug,andchlorhexidineasthepositivedrugcontrol.Firstly,aninvitromodelofFusobacteriumnucleatumbiofilmwasconstructedusingthemicroplatemethod;AndthegrowthkineticscurveofbiofilmandtotalmatrixgrowthcurveweremeasuredthroughCCK-8methodandcrystalvioletsemiquantitativeadhesionexperiment;Threemethodsofobservingthemicrostructureofbiofilmusingfieldemissionscanningelectronmicroscopy(SEM)areusedtoverifythesuccessofbiofilmmodelconstruction.Secondly,theminimuminhibitoryconcentration(MBIC)ofmagnololonthebiofilmofFusobacteriumnucleatumwasdeterminedusingmicrodilutionmethod;TheeffectsofmagnololonthemetabolicactivityandtotalsubstrateofFusobacteriumnucleatumbiofilmweremeasuredusingCCK-8andcrystalvioletsemiquantitativeadhesionexperiments;ObservethemicrostructureandmorphologicalchangesofthebiofilmofthetestedstrainafterdruginterventionthroughSEM.Result:Accordingtothethreevalidationmethods,theinitialadhesionperiodofthebiofilmofthetestedstrainsofFusobacteriumnucleatumwas0-36hours,theaggregationperiodwas36-48hours,andthematurityperiodwas48-96hours.TheoptimaldruginterventionconcentrationforFusobacteriumnucleatumwithmagnololis60μg/mL,traditionalChinesemedicinemonomerandmagnololcantosomeextentreducethemetabolicactivityofbiofilmsformedbyFusobacteriumnucleatumatdifferentstages(P<0.05)andreducethetotalamountofbiofilmmatrix(P<0.05),destroythemorphologyandstructureofbiofilms,andleadtobacterialdeath.Conclusion:Honokiolhasacertaininhibitoryeffectontheformationofbiofilmsduringtheadhesion,aggregation,andmaturationstagesofFusobacteriumnucleatum,whichisexpectedtoresistthedevelopmentofdrugresistance.Thus,theresearchprovidesatheoryfoundationfordevelopingtraditionalChinesemedicinemonomerandmagnololasanovelbiofilmsinhibitor.[Keywords]honokiolFusobacteriumnucleatumbiofilm目錄TOC\o"1-3"\h\u170331前言 具核梭桿菌生物被膜體外模型的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)菌種具核梭桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25586），購(gòu)于北京保藏生物科技中心。實(shí)驗(yàn)儀器表2-1實(shí)驗(yàn)儀器名稱生產(chǎn)廠家SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司24孔板無錫耐思生物科技有限公司DHP-9032B電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司氧氣指示劑日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社JSM-7610FPlus場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本電子株式會(huì)社14mm無菌爬片北京白鯊生物科技有限公司iMark酶標(biāo)儀美國(guó)BIO-RAD公司厭氧密封培養(yǎng)袋日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社DSX-24L自控型手提式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠厭氧產(chǎn)氣袋日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社一次性無菌平皿廣東環(huán)凱生物科技有限公司平底96孔板無錫耐思生物科技有限公司試劑與藥物表2-2試劑與藥物名稱批號(hào)生產(chǎn)廠家0.1%結(jié)晶紫C916088上海麥克林生化科技有限公司腦心浸液肉湯20220208青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司CCK-8試劑盒MA0218-2-Oct-28G大連美侖生物技術(shù)有限公司2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）20220708北京索萊寶科技有限公司PBS緩沖溶液（7.2~7.5）GP2211005830武漢塞維爾生物科技有限公司：無水乙醇20211221廣東光華科技股份有限公司叔丁醇20200612天津市大貿(mào)化學(xué)試劑廠甲醇20220601307天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基的配制腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHI）：按照使用說明配備，準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基顆粒5.2g置于燒杯中，加入去離子水100mL；腦心浸液液體培養(yǎng)基（BHI）：按照使用說明配備，準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基顆粒7.7g置于燒杯中，加入去離子200mL；將以上培養(yǎng)基充分?jǐn)噭虿⑷芙夂螅琾H值調(diào)節(jié)至7.4±0.2，封口后于121℃高壓滅菌30min。恒溫至50℃左右時(shí)加入氯化血紅素（5.0μg/mL）和維生素K1（10.0μg/mL）（瓊脂培養(yǎng)基需加入5%無菌脫纖維羊血后傾注于平板中），混勻后于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)菌懸液的制備用接種環(huán)取活化后的受試菌少許，加入無菌生理鹽水中稀釋調(diào)整至與0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁艿臐岫纫恢?，即達(dá)到1.0×108CFU/mL濃度。取上述菌懸液200μL，加入BHI液體培養(yǎng)基稀釋，得到濃度為1.0×106CFU/mL的實(shí)驗(yàn)菌懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。微孔板法構(gòu)建具核梭桿菌生物被膜體外模型取2.2.2制備的具核梭桿菌菌懸液每孔200μL接種到96孔板中，在37℃恒溫靜置下分別厭氧培養(yǎng)至0、12、24、36、48、72、96、120h。CCK-8法測(cè)定生物被膜的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定受試菌株的生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線。將2.2.3制備的生物被膜相應(yīng)的時(shí)間段取出，使用無菌移液槍吸取并去掉各孔培養(yǎng)基和浮游菌、取生理鹽水沖洗3遍，自然晾干后，加入100μL肉湯，避光加入10μL的CCK-8溶液/孔，全部加完后振蕩混勻，37℃避光孵育1h，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD450處的吸光度值，記錄結(jié)果并繪制菌株的生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線。結(jié)晶紫半定量粘附實(shí)驗(yàn)測(cè)定生物被膜總量生長(zhǎng)曲線采用結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定受試菌株的生物被膜基質(zhì)總量生長(zhǎng)曲線。取2.2.3中構(gòu)建的生物被膜，在相應(yīng)時(shí)間段，使用無菌移液槍吸取并去掉各孔培養(yǎng)基和浮游菌，取生理鹽水輕洗1-3遍后，每孔加200μL甲醇固定生物被膜30min，吸棄甲醇，加入100μL0.1%結(jié)晶紫染液，染色15min后吸棄并使用生理鹽水輕洗未粘附染料1-2遍。最后，加入95%乙醇溶解與生物被膜結(jié)合的染料，充分溶解后用酶標(biāo)儀測(cè)量OD570的吸光度值，記錄結(jié)果，繪制菌株生物被膜基質(zhì)的生長(zhǎng)曲線。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察生物被膜微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)在無菌24孔板上，用鑷子將14mm的圓形爬片放入孔中，每孔加入1mL2.2.2制備的試驗(yàn)菌懸液，在37℃下分別恒溫靜置厭氧培養(yǎng)至12、36、48、72h，使用無菌移液槍吸棄各孔的培養(yǎng)基和浮游菌，用生理鹽水輕洗1-3遍后，加入1mL2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）于4℃下固定一晚。吸棄固定液后，分別用30%、50%、70%、80%、90%、95%濃度梯度乙醇對(duì)各孔進(jìn)行洗脫，各梯度濃度每孔共洗脫2次，每次15min。最后用100%乙醇脫水2次，每次30min。棄去各孔中所有溶液，加入100%叔丁醇置換乙醇兩次，每次30min。將脫水完成的各樣品進(jìn)行冷凍真空干燥后，將待測(cè)樣品用導(dǎo)電膠粘在載物臺(tái)上，采用真空離子濺射儀對(duì)各樣品進(jìn)行噴金處理90s后，置于掃描電子顯微鏡中并拍攝圖片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論具核梭桿菌受試菌株生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線圖2-1具核梭桿菌生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線圖由圖2-1可知，受試菌株在0-36h段快速繁殖，對(duì)應(yīng)生物被膜的黏附期；在36-48h時(shí)細(xì)菌不斷聚集成菌落，對(duì)應(yīng)生物被膜的聚集期；在48-96h細(xì)菌活細(xì)胞量基本保持不變，對(duì)應(yīng)生物被膜的成熟期，此時(shí)菌落繼續(xù)擴(kuò)大并形成致密的成熟生物被膜。96h后，細(xì)菌活細(xì)胞量下降，進(jìn)入生物被膜成熟末期，此時(shí)膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性降低并開始從膜內(nèi)脫落并擴(kuò)散，進(jìn)入下一輪循環(huán)。具核梭桿菌受試菌株生物被膜總量生長(zhǎng)曲線圖2-2具核梭桿菌生物被膜基質(zhì)總量生長(zhǎng)曲線圖由圖2-2可知，0-36h生物被膜基質(zhì)總量增長(zhǎng)得最快，對(duì)應(yīng)生物被膜的黏附期；36-48h時(shí)細(xì)菌不斷聚集成菌落并分泌大量的胞外聚合物，對(duì)應(yīng)生物被膜的聚集期；48-96h細(xì)菌生物被膜總量增幅減緩，為生物被膜的成熟期。96h后生物被膜總量開始下降，即生物被膜開始脫落擴(kuò)散，并進(jìn)入下一個(gè)生物被膜形成的周期。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察具核梭桿菌生物被膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)注：A：12h；B：36h；C：48h；D：72h；觀察倍數(shù)：×10000圖2-3具核梭桿菌不同時(shí)間段的生物被膜模型微觀形態(tài)圖由圖2-3可知，在受試菌株培養(yǎng)到12h時(shí)，僅有單個(gè)細(xì)菌黏附在爬片表面。培養(yǎng)至36h時(shí)，細(xì)菌開始互相聚集，形成少量細(xì)菌團(tuán)塊。培養(yǎng)至48h時(shí)，細(xì)菌相互聚集黏附緊密，疊成團(tuán)塊，大量胞外聚合物產(chǎn)生，初步具有生物被膜的框架。培養(yǎng)至72h時(shí)，細(xì)胞團(tuán)塊有形成片狀的生物被膜聚集體，且被包裹在生物被膜內(nèi)，形成了具有一定厚度且致密的成熟的生物被膜。小結(jié)本章通過CCK-8實(shí)驗(yàn)繪制了具核梭桿菌生物被膜的生長(zhǎng)動(dòng)力曲線，通過結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)繪制了生物被膜基質(zhì)總量的生長(zhǎng)曲線，通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察具核梭桿菌生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)。綜合上述生物被膜生長(zhǎng)動(dòng)力曲線以及生物被膜基質(zhì)總量生長(zhǎng)曲線的結(jié)果，確定具核梭桿菌受試菌株的生物被膜初始黏附期為0-36h，生物被膜聚集期36-48h，生物被膜成熟期為48-96h。從掃描電子顯微鏡觀察的結(jié)果得，培養(yǎng)到12h時(shí)，單個(gè)細(xì)菌黏附在爬片表面。培養(yǎng)到36h時(shí)，細(xì)菌相互聚集形成少量細(xì)菌團(tuán)塊。培養(yǎng)到48h時(shí)，細(xì)菌初步形成生物被膜的框架。培養(yǎng)到72h時(shí)，細(xì)胞團(tuán)塊形成了有一定厚度且致密的成熟生物被膜。進(jìn)一步驗(yàn)證了不同生長(zhǎng)階段生物被膜的生長(zhǎng)狀況。綜上所述，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取第24h，42h，60h分別作為具核梭桿菌生物被膜的黏附期，聚集期及成熟期進(jìn)行藥物干預(yù)，探究中藥單體和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜形成的作用影響。和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的作用實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)菌種具核梭桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25586），購(gòu)于北京保藏生物科技中心。實(shí)驗(yàn)儀器表3-1實(shí)驗(yàn)儀器名稱生產(chǎn)廠家SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司24孔板無錫耐思生物科技有限公司DHP-9032B電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司氧氣指示劑日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社JSM-7610FPlus場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡日本電子株式會(huì)社14mm無菌爬片北京白鯊生物科技有限公司iMark酶標(biāo)儀美國(guó)BIO-RAD公司厭氧密封培養(yǎng)袋日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社DSX-24L自控型手提式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠厭氧產(chǎn)氣袋日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社一次性無菌平皿廣東環(huán)凱生物科技有限公司平底96孔板無錫耐思生物科技有限公司試劑與藥物表3-2試劑與藥物名稱批號(hào)生產(chǎn)廠家和厚樸酚（≥98%）C10026295上海麥克林生化科技有限公司氯己定（98%）C12196688上海麥克林生化科技有限公司0.1%結(jié)晶紫C916088上海麥克林生化科技有限公司腦心浸液肉湯20220208青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司CCK-8試劑盒MA0218-2-Oct-28G大連美侖生物技術(shù)有限公司2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）20220708北京索萊寶科技有限公司PBS緩沖溶液（7.2~7.5）GP2211005830武漢塞維爾生物科技有限公司：無水乙醇20211221廣東光華科技股份有限公司叔丁醇20200612天津市大貿(mào)化學(xué)試劑廠甲醇20220601307天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司實(shí)驗(yàn)方法培養(yǎng)基的配制同2.2.1操作。實(shí)驗(yàn)菌懸液的制備同2.2.2操作。藥物貯備液的配備用DMSO溶解和厚樸酚并制成濃度為64mg/mL的和厚樸酚貯備液；氯己定配制成濃度為16mg/mL的陽性對(duì)照藥物貯備液，用封口膜密封貯備液管口，避光保存于4℃冰箱內(nèi)，備用。測(cè)定和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的最低抑膜濃度（MBIC）用BHI液體培養(yǎng)基將3.2.3制備的藥物儲(chǔ)備液分別稀釋為5120μg/mL的和厚樸酚、2560μg/mL的氯己定藥液。將3.2.2制得的Fn菌懸液取每孔200μL接種于96孔板中，37℃下恒溫靜置厭氧培養(yǎng)48~72h。用無菌PBS沖洗3遍去除各孔培養(yǎng)基和浮游菌。將上述稀釋的藥液分別各取200μL加入到96孔板中，設(shè)置第11列為生長(zhǎng)對(duì)照孔，第12列為空白對(duì)照孔，于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)厭氧培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。評(píng)估結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)：以肉眼未見孔內(nèi)渾濁的最低藥物濃度為最低抑膜濃度（MBIC）。根據(jù)MBIC測(cè)定結(jié)果，確定最佳給藥濃度。采用CCK-8法、結(jié)晶紫法和掃描電子顯微鏡共同評(píng)價(jià)藥物對(duì)受試菌株生物被膜的清除作用。CCK-8法測(cè)定和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的細(xì)菌代謝活性影響取3.2.2制得的菌懸液200μL接種于96孔板上，在37℃下分別恒溫厭氧培養(yǎng)至24h、42h、60h。在相應(yīng)的時(shí)間段內(nèi)，使用無菌移液槍吸棄各孔培養(yǎng)基和浮游菌，取生理鹽水輕洗1-3遍，加入60μg/mL濃度和厚樸酚200μL，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，吸棄各孔溶液并使用生理鹽水輕洗1-3遍，待自然晾干后，加入100μL肉湯，避光加入10μL的CCK-8溶液/孔，避光37℃下孵育1h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD450的吸光度值，重復(fù)3次并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)用5.63μg/mL氯己定CHX設(shè)置陽性對(duì)照組，重復(fù)上述操作并給藥，重復(fù)3次并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)晶紫半定量粘附法測(cè)定和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜總量的影響取3.2.2制得的菌懸液200μL接種到96孔板上，在37℃下分別恒溫培養(yǎng)24h、42h、60h。在相應(yīng)的時(shí)間段內(nèi)，使用無菌移液槍吸棄各孔培養(yǎng)基和浮游菌，并用生理鹽水輕洗1-3遍。加入60μg/mL濃度和厚樸酚200μL后繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸棄培養(yǎng)基和浮游菌，生理鹽水輕洗1-3遍后，每孔加入200μL甲醇固定生物被膜。30min后，吸棄甲醇，每孔加入100μL結(jié)晶紫染液，染色15min后洗去未粘附的染料。使用生理鹽水輕洗1-2遍后，每孔加入200μL的95%乙醇溶解與生物被膜結(jié)合的染料，并輕輕振蕩使之充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)量OD570的吸光度值，重復(fù)3次并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)用5.63μg/mL氯己定CHX設(shè)置陽性對(duì)照組，重復(fù)上述操作并給藥，重復(fù)3次并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。SEM觀察和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜微觀形態(tài)的影響取無菌24孔板，用鑷子將14mm的圓形爬片放入各孔中，每孔加入1mL的菌懸液，在37℃下分別恒溫厭氧靜置培養(yǎng)至24、42、60h。使用無菌移液槍吸棄各孔的培養(yǎng)基和浮游菌，用生理鹽水輕洗1-3遍，分別加入60μg/mL和厚樸酚和5.63μg/mLCHX各200μL，同時(shí)設(shè)置生長(zhǎng)對(duì)照組繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄取培養(yǎng)基和浮游菌，生理鹽水輕洗后，加入1mL2.5%戊二醛固定液（電鏡專用）于4℃下固定過夜。吸棄固定液，分別使用30%、50%、70%、80%、90%、95%濃度梯度乙醇對(duì)各孔進(jìn)行洗脫，各梯度濃度每孔共洗脫2次，每次15min。最后用100%乙醇脫水2次，每次30min。棄去各孔中所有溶液，加入100%叔丁醇置換乙醇兩次，每次30min。將脫水完成的各樣品進(jìn)行冷凍真空干燥后，將待測(cè)樣品用導(dǎo)電膠粘在載物臺(tái)上，采用真空離子濺射儀對(duì)各樣品進(jìn)行噴金處理90s后，置于掃描電子顯微鏡中并拍攝圖片。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用軟件ORIGIN對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用單因素方差分析，遵循t檢驗(yàn)，得出P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的最低抑膜濃度（MBIC）表3-3藥物對(duì)具核梭桿菌用藥的最低抑膜濃度（MBIC）藥物最低抑膜濃度（MBIC）（μg/mL）和厚樸酚60.00±23.09氯己定5.63±3.15由表3-3可知，和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌的最低抑膜濃度MBIC為60±23.09μg/mL，表明和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜具有一定的抑制作用；陽性藥氯己定對(duì)Fn的MBIC為5.63±3.15μg/mL。和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜細(xì)菌代謝活性影響注：*表示和厚樸酚組與生長(zhǎng)對(duì)照組比較，P＜0.05，**表示P＜0.001，***表示P＜0.0001；#表示和厚樸酚組與氯己定組比較，P<0.05。圖3-1各藥物組對(duì)具核梭桿菌三個(gè)生長(zhǎng)階段生物被膜代謝活性的影響圖由圖3-1可知，在受試菌株培養(yǎng)24h、42h、60h后進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果顯示：24h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組代謝活性下降了66.3%，表明和厚樸酚可有效降低生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性（P<0.0001）；CHX組代謝活性下降了93.0%，CHX可有效降低生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性（P<0.0001）。和厚樸酚與CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。42h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組代謝活性下降了60.8%，和厚樸酚可有效降低生物膜內(nèi)的細(xì)菌代謝活性（P<0.05）；CHX組代謝活性下降了91.0%，CHX可有效降低生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性（P<0.05）。和厚樸酚與CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。60h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組代謝活性下降了50.5%，和厚樸酚可有效降低生物被膜內(nèi)的細(xì)菌代謝活性（P<0.05）；CHX組代謝活性下降了93.1%，CHX可有效降低生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性（P<0.0001）。和厚樸酚與CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。在受試菌株黏附階段（24h）、聚集階段（42h)以及成熟階段（60h），和厚樸酚給藥組抑制生物被膜細(xì)菌代謝活性的作用與生長(zhǎng)對(duì)照組對(duì)比效果顯著，與陽性對(duì)照組的效果仍有一定差距。和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜基質(zhì)總量影響注：*表示和厚樸酚組與生長(zhǎng)對(duì)照組比較，P＜0.05，**表示P＜0.001，***表示P＜0.0001；#表示和厚樸酚組與氯己定組比較，P<0.05。圖3-2各藥物組對(duì)具核梭桿菌生物被膜基質(zhì)總量的影響圖由圖3-2可知，在受試菌株培養(yǎng)24h、42h、60h后進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果顯示：24h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組的生物被膜基質(zhì)總量下降了60.8%，和厚樸酚組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）；CHX組的生物被膜基質(zhì)總量下降了95.0%，CHX組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）。和厚樸酚與CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。42h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組的生物被膜基質(zhì)總量下降了40.7%，和厚樸酚組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）；CHX組的生物被膜基質(zhì)總量下降了68.5%，CHX組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）。和厚樸酚與CHX相比，效果相近（P>0.05)。60h時(shí)，與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，和厚樸酚組的生物被膜基質(zhì)總量下降了48.6%，和厚樸酚組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）；CHX組的生物被膜基質(zhì)總量下降了72.3%，CHX組可有效抑制生物被膜總量（P<0.05）。和厚樸酚與CHX相比效果仍有一定差距（P<0.05）。在受試菌株黏附階段（24h）以及成熟階段（60h），和厚樸酚給藥組抑制受試菌株生物被膜總量的作用與生長(zhǎng)對(duì)照組對(duì)比效果顯著，與陽性對(duì)照組的效果仍有一定差距。而在受試菌株聚集階段（42h），和厚樸酚給藥組抑制受試菌株生物被膜總量的作用與生長(zhǎng)對(duì)照組對(duì)比效果顯著且與陽性對(duì)照組的效果相近。和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜微觀形態(tài)的影響電鏡圖圖3-3場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察生長(zhǎng)對(duì)照組、和厚樸酚組以及氯己定組對(duì)具核梭桿菌生物被膜微觀形態(tài)影響圖由圖3-3可知，生長(zhǎng)對(duì)照組在24h、42h及60h三個(gè)階段時(shí)呈正常細(xì)長(zhǎng)、兩端尖細(xì)如梭的形態(tài)，且細(xì)菌逐漸黏連、聚集，疊堆成團(tuán)狀。和厚樸酚處理后與生長(zhǎng)對(duì)照組相比，細(xì)菌數(shù)量降低，且細(xì)菌之間的粘連程度也降低。與陽性對(duì)照組相比，和厚樸酚單獨(dú)作用后，細(xì)菌量減少的程度、生物被膜的粘連程度以及黏附期、聚集期的整體效果與CHX組相近。由此可見，在和厚樸酚的作用下，生物被膜細(xì)菌之間的黏附減少，生物被膜結(jié)構(gòu)破壞，菌體變形皺縮、凹陷。小結(jié)本章通過微量棋盤稀釋法，確定了和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌的最低抑膜濃度(MBIC)，并且使用該藥物濃度對(duì)細(xì)菌生物被膜形成的三個(gè)階段進(jìn)行藥物干預(yù)。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜形成各階段膜內(nèi)細(xì)菌的代謝活性；采用結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜基質(zhì)總量形成的影響；通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察和厚樸酚對(duì)受試菌株生物被膜微觀結(jié)構(gòu)的影響，具體結(jié)果如下：通過微量棋盤稀釋法測(cè)定了和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌的MBIC為60μg/mL。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫半定量黏附實(shí)驗(yàn)可知，和厚樸酚可有效降低具核梭桿菌生物被膜內(nèi)活細(xì)菌的代謝活性以及基質(zhì)總量。通過SEM場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡可知，和厚樸酚可有效減少生物被膜的細(xì)菌量，并減少細(xì)菌之間的相互聚集以及胞外聚合物的形成。綜上所述，中藥單體和厚樸酚在具核梭桿菌生物被膜形成的不同階段均有清除作用。結(jié)論與展望結(jié)論本文從抑制具核梭桿菌的生物被膜角度入手，對(duì)具核梭桿菌生物被膜體外模型的構(gòu)建以及藥物對(duì)生物被膜的干預(yù)作用兩個(gè)方面進(jìn)行了研究。通過本論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，中藥單體和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌的生物被膜形成具有良好的抑制作用。運(yùn)用中藥單體和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的藥物干預(yù)作用是本課題的創(chuàng)新點(diǎn)，同時(shí)結(jié)論表明和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的形成有一定的抑制作用，一定程度上能削弱具核梭桿菌的耐藥性。因此，這為中藥單體和厚樸酚開發(fā)為一種新型的生物被膜抑制劑以及抗菌藥物的研發(fā)提供了新的思路。展望本實(shí)驗(yàn)中藥單體和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜具有一定抑制作用，但效果并未達(dá)到甚至超越陽性藥物氯己定CHX對(duì)具核梭桿菌生物被膜的作用，由此得出單獨(dú)和厚樸酚給藥有一定的效果，但效果仍不如陽性藥。因此可考慮通過聯(lián)合用藥增強(qiáng)藥物療效，并減少用量，探討聯(lián)合用藥對(duì)具核梭桿菌生物被膜的抑制作用影響，同時(shí)與陽性藥物組進(jìn)行對(duì)照，由此佐證試驗(yàn)藥物的有效性。本實(shí)驗(yàn)雖然驗(yàn)證了和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的形成有抑制作用，但其對(duì)生物被膜抑制的具體作用機(jī)制尚不清楚，可以計(jì)劃在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，加入探究和厚樸酚對(duì)具核梭桿菌生物被膜的群體感應(yīng)、細(xì)胞毒力、相關(guān)基因mRNA