加熱溫度和時間對廣陳皮褐變反應(yīng)的影響

前言陳皮為蕓香科植物橘（CitrusreticulataBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮REF_Ref594\r\h[1]。以“陳皮”、“廣陳皮”等為主。主要通過采收成熟的水果，然后將其去皮，然后晾干，也可以在低溫下烘干而成。產(chǎn)地以福建，浙江，廣東為主，廣西，江西，湖南為輔，還有貴州，云南，四川和其他一些省份。根據(jù)藥理實驗REF_Ref666\r\h[2]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，陳皮提取物中有140個左右，以揮發(fā)油、黃酮等為其主要活性物質(zhì)。陳皮具有廣泛的藥理作用，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥、抗肝損傷、抗神經(jīng)損傷等多種功效。陳皮之名首見于《食療本草》。《雷公炮炙論》謂其:“年久者最妙”REF_Ref31026\r\h[3]。陳皮儲藏的時間不同，其藥理作用的活性與成分也有所不同，目前對于陳皮的儲藏年份，一般采取官評價法、近紅外光譜或測定其成分組成與含量等方法來鑒別。如王福REF_Ref12710\r\h[4]闡述了廣陳皮外觀性狀的變化與其貯藏年份的關(guān)系，貯藏時間越長，表皮與內(nèi)囊顏色越深，海綿層完全脫離，清晰油點變多，整體厚度變薄。現(xiàn)代研究中對于陳皮在存放過程中揮發(fā)性成分與黃酮類成分研究較多，認為陳皮在貯藏過程含量均會有所變化，但對于其具體的變化趨勢，不同學者研究結(jié)果不盡相同，如林林REF_Ref7455\r\h[5]研究認為陳皮保存時間增加，也會使得其總黃酮含量增加;段慶REF_Ref8654\r\h[6]研究認為陳皮保存時間延長，其體內(nèi)揮發(fā)油含量會有下降的趨勢，但胡繼藤REF_Ref9444\r\h[7]認為揮發(fā)油含量與貯藏時間并無太大關(guān)系。還有研究表明廣陳皮藥材油室遭到破壞會導致其揮發(fā)性成分隨貯藏時間的延長有極大散失REF_Ref21592\r\h[8]。綜合各方面文獻，普遍認為隨著貯藏時間的增加，陳皮活性成分黃酮類成分含量增加，陳皮揮發(fā)油含量降低，但其揮發(fā)性成分發(fā)生了變化。陳皮放置時間變久顏色會變深，一般認為陳皮發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了類黑素。美拉德反應(yīng)一般有三個反應(yīng)階段，分為初期反應(yīng)階段、中期反應(yīng)階段和末期反應(yīng)階段，其反應(yīng)途徑如下圖[9]。初級階段還原糖的羰基與氨基化合物的游離氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，脫除一分子水生成碳氮雙鍵，環(huán)化生成N-葡萄糖胺。當還原糖是醛糖時，重排形成Amadori產(chǎn)物。若還原糖是酮糖，則會發(fā)生Heynes重排反應(yīng)，美拉德初級反應(yīng)產(chǎn)物不會引起陳皮色澤和香味的變化，但其產(chǎn)物是不揮發(fā)性香味物質(zhì)的前體成分。在中級階段，根據(jù)pH值的不同，重排產(chǎn)物發(fā)生不同的降解反應(yīng)。當在酸性條件下（pH≤7），重排產(chǎn)物主要生成1,2-烯醇化產(chǎn)物，進一步反應(yīng)形成醛，若還原糖為戊糖則生成糠醛，若還原糖為己糖則形成羥甲基糠醛。堿性條件下（pH>7.0），發(fā)生2,3-烯醇化反應(yīng)，產(chǎn)生還原酮類及脫氫還原酮類。最終階段主要為醛類和胺類在低溫下聚合成為高分子的類黑精或稱類黑素。也就是初級反應(yīng)階段和中間反應(yīng)階段生成的N-葡萄糖胺、1-脫氧糖酮、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H）-呋喃酮、α-氨基酮等活性中間體繼續(xù)與體系中的氨基酸或還原糖發(fā)生復雜的環(huán)合、脫氫、重排、異構(gòu)化等反應(yīng)最終生成大分子含氮褐色物質(zhì)類黑精。自20世紀中葉以來，隨著我國人口的急劇增長和中草藥產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，我國中草藥資源的消費量和年消費量成了一個巨大的數(shù)字。但目前已成功培植的中藥僅200多種，80%以上的中草藥仍依賴于挖掘和挖掘。雖然我國中藥資源種類豐富,但野生中藥資源依然短缺,分布范圍和資源貯藏量日益縮減[10]。廣陳皮作為陳皮的道地藥材，其高效的藥用價值使其備受追捧，陳皮貯存的時間越長，其主要有效成分橙皮苷含量越高，其藥用效果越好[11]，因此市面上會出現(xiàn)多種雜陳皮流通于市場，茶水染色以捏造陳皮貯藏年份等現(xiàn)象。由于這些現(xiàn)象能直接影響陳皮飲片及相關(guān)中成藥的藥用療效，因此急需尋找廣陳皮準確測定貯藏年份的鑒定方法。近年來出現(xiàn)一種檢測陳皮的陳化方式的方法，陳皮經(jīng)高溫加速陳化會發(fā)生美拉德反應(yīng)，導致其經(jīng)典中間產(chǎn)物5-HMF含量會明顯得到提升，該方法將5-HMF作為標志物應(yīng)用于檢測陳皮的陳化方法中。本次實驗也是計劃運用該方法檢測不同溫度與時間條件下陳皮的陳化程度。

2儀器與材料2.1儀器主要儀器見表1。表1主要儀器儀器型號公司廠家紫外可見分光光度計T2602S上海佑科儀器儀表有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELAN-1300上海愛朗儀器有限公司低速離心機AnkeTDL80A-2B上海安亭科學儀器廠送風定溫恒溫箱YAMATODKN-612C廣州科朋科學儀器有限公司超聲波清洗器KQ-300E昆山市超聲儀器有限公司pH計雷磁pHS-2F上海雷磁科學儀器廠電子天平（精度0.0001）ME104/02梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司電子天平（精度0.001）ME802/02梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司凍干機EYELAFDU-2110/DRC-1100東京理化機械株式會社水浴鍋HH-6恒溫水浴鍋江蘇金壇宏華儀器廠液相色譜儀LC-20A日本島津公司電子調(diào)溫電熱套98-1-B型天津市泰斯特儀器有限公司2.2材料2.2.1藥物根據(jù)《中國藥典》，廣陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。廣陳皮常3瓣相連，形狀整齊，厚度均勻，約1mm。外表面橙黃色至棕褐色，點狀油室較大，對光照視，透明清晰，質(zhì)較柔軟。經(jīng)鑒定，本次采用藥材為產(chǎn)自廣東省江門市新會區(qū)的廣陳皮，生產(chǎn)年份為2020年。2.2.2試劑主要試劑見表2。表2主要試劑試劑名稱批號公司廠家氫氧化鈉20200425福晨（天津）化學試劑有限公司茚三酮F27HS176588上海源葉生物科技有限公司酒石酸鉀鈉20201020福晨（天津）化學試劑有限公司磷酸二氫鉀20140217天津福晨化學試劑廠磷酸20270608天津市永大化學試劑有限公司甲醇20211215天津市百世化工有限公司色譜甲醇AH230-4霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司5-羥甲基糠醛MUST-20051202成都曼思特生物科技有限公司甘氨酸AF20102451埃法生物科技有限公司無水葡萄糖Y19F11J108781上海源葉生物科技有限公司3實驗方法3.1供試品的制備稱取20g陳皮，撕碎，加純水400mL，冷凝回流提取30min，過濾；添加純水400mL，冷凝回流提取30min，過濾；添加純水200mL，冷凝回流提取30min，過濾。合并三次濾液，攪拌均勻，濃縮至100mL。以上操作重復8次，得到800mL陳皮提取液，攪拌均勻，將其平均分成16份，每份50mL。將上述16份陳皮提取液密封，其中6份分別置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的烘箱中，加熱7天。余下10份置于80℃烘箱中分別加熱3天、6天、9天、12天、15天、18天、21天、24天、27天、30天。取回陳皮提取液，攪拌均勻，放入凍干機中，得到不同加熱溫度與不同加熱時間陳化后的陳皮凍干粉末。3.2DNS試劑的制備甲液：在具刻度的試管中加入5mL的10%氫氧化鈉溶液（10g氫氧化鈉固體微粒精密稱重后，用足量蒸餾水溶解，然后在溫室下進行轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，用純水補置刻度線，振蕩搖勻，即獲得10%氫氧化鈉溶液），將2.3g的苯酚精確稱量加入具刻度的試管中，再用蒸餾水稀釋到23mL，然后加入精密稱取2.3005g亞硫酸氫鈉，混合，即獲得甲液。乙液：將85g的酒石酸鉀鈉精確稱取到100mL10%的氫氧化鈉溶液中，使其充分溶解后，再添加到精密量取的293mL1%的3-5-二硝基水楊酸溶液（將精密稱取1g的1-5-二硝基水楊酸粉末用蒸餾水溶解，然后將其在100mL容量瓶中定容，混合搖勻即得），混合搖勻，即得到乙液。將以上所得的甲液與乙液混合搖勻后，倒入棕色瓶中，置于室溫下，在陰涼處存放7天后再使用。3.3含量測定3.3.1氨基酸含量測定本次實驗采用茚三酮比色法測定各樣品中氨基酸的含量。pH=6.8的磷酸鹽緩沖液的制備：分別精密稱取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液25mL和0.2mol/L氫氧化鈉溶液11.8mL至100mL容量瓶，用純水定容。甘氨酸標準曲線的制備：配置不同濃度的甘氨酸標準溶液，置于10mL容量瓶中定容，得標準品供試液。各取1mL不同濃度的供試液于試管中，各管分別加入2.0mLpH=6.8的磷酸鹽緩沖試劑溶液和1.5mL茚三酮試劑溶液，搖勻后將試管置于95℃水浴加熱30min。取出后迅速冷卻至室溫，而后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加純水定容至10mL。于紫外567nm處測定吸光度，以甘氨酸溶液濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)以上步驟，得到甘氨酸標準曲線：y=131.05x-0.462（R2=0.9954）精密稱取不同樣品粉末各10mg，加少量蒸餾水溶解后定容至10mL，超聲助溶后離心，取上清液為母液。取上述母液各1mL于不同試管中，1mL純水作為空白對照，在各試管中加入純水1mL、茚三酮溶液（精密稱取0.5002g茚三酮粉末至25mL容量瓶，用無水乙醇定容，現(xiàn)配現(xiàn)用）1.5mL、緩沖液2mL，搖勻后用保鮮膜封口，放置95℃水浴鍋中加熱30min。加熱后迅速冷卻使其降至室溫，將反應(yīng)完全的溶液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中用純水定容。用空白試劑調(diào)零，在567nm處測定吸光度。重復上述操作1次。3.3.2還原糖含量測定本次實驗采用DNS比色法測定各樣品中還原糖的含量。葡萄糖標準曲線的制備：配置不同濃度的標準葡萄糖溶液，置于10mL容量瓶中定容，得標準品供試液。各取1.0mL上述供試液于具塞試管中，各試管分別加入純水1.0ml、DNS試劑3.0mL。搖勻后將試管置于100℃水浴加熱10min。取出后迅速冷卻至室溫，而后轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加純水定容至10mL。于紫外498nm波長處測定吸光度，以葡萄糖濃度x為橫坐標，吸光度y為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)以上步驟，得到葡萄糖標準曲線：y=28.626x-0.2351（R2=0.9991）精密稱取不同樣品粉末各10mg，加少量蒸餾水溶解后定容至10mL，超聲助溶后離心，取上清液為母液。取上述母液0.5mL于不同試管中，0.5mL純水作為空白對照，在各試管中加入純水1mL、DNS試劑3mL，搖勻后置于100℃水浴鍋中加熱10min，取出后迅速冷卻至室溫，后移至10mL容量瓶中（多次用純水沖洗試管）定容。用空白試劑調(diào)零，在498nm處測定吸光度。重復上述操作1次3.3.35-HMF含量測定本次實驗采用HPLC法測定各樣品中5-HMF的含量。供試品溶液的配置：取各樣品凍干粉10mg，用少量甲醇超聲溶解后定容至10mL容量瓶中，放入離心機離心20min，取上層清夜，再用有機相濾頭（0.45μm）過濾到棕色進樣瓶中。5-HMF對照品溶液的配置：精密稱取適量的5-HMF對照品，配置成濃度為0.10mg/mL的5-HMF對照品溶液作為定性分析。色譜條件：使用ECOSIL-120-C18色譜柱（以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長為250mm，內(nèi)徑4.6mm，粒徑為5μm）；流動相：水（B）-甲醇（A）；流速：1.0mL/min；檢測波長：284nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl；理論塔板數(shù)按5-HMF峰計算應(yīng)不低于2500。梯度洗脫程序表見表3。表3洗脫程序表洗脫時間（分鐘）甲醇占比（A）0-55%-15%6-1015%-25%11-2025%-28%21-2528%-30%26-3530%-50%峰面積測定：根據(jù)測量5-HMF對照品可得其色譜峰保留時間為11.964分鐘，而供試品在相近的保留時間有峰面積較大的吸收峰，可判斷該為5-HMF目標峰，因此需測量各個樣品在該時間附近出現(xiàn)的色譜峰的峰面積。3.4吸光度測定精密稱取不同樣品粉末各5mg，加少量蒸餾水溶解后定容至10mL，超聲助溶后離心，取上清液在紫外294nm、420nm、470nm處測定吸光度。3.5pH測定供試液的制備：精密稱取不同樣品粉末各5mg，加少量蒸餾水溶解后定容至10mL，超聲助溶后離心，取上清液，為供試液。pH計的校正：利用pH緩沖劑配置pH=4.00與pH=6.86的校正液，本次校正采用兩點定位校正法，具體操作如下：將pH計的電極套筒取出，用蒸餾水清洗電極頭，再用一張吸水紙小心地將水吸走，再把探頭放在pH值為6.86的標準緩沖劑中，讓該溶液浸沒電極頭的玻璃球，然后輕輕地搖晃均勻，直到讀值達到穩(wěn)定為止；調(diào)整位置，當溫度為25攝氏度時，酸堿度為6.86。將該電極移除，洗滌并吸干水分，并將其置于一種pH值為4.00的緩沖劑中，并搖晃至讀取值穩(wěn)定，調(diào)整定位旋鈕，使顯示值為該溶液25℃時標準pH值為4.00。重復以上操作進行校正，直到兩標準溶液的測量值與標準pH值基本相符為止。pH值測定：將校正后的pH計用蒸餾水洗凈，吸干，探頭放入樣品液中，輕輕搖勻，待讀數(shù)穩(wěn)定后記錄讀數(shù)，用蒸餾水將探頭洗凈，吸干后可測量下一個樣品液的pH值。重復以上操作直至所有樣品液測量完畢。4不同加熱溫度樣品實驗結(jié)果與分析4.1模擬陳化樣品外觀性狀類黑素為陳皮陳化的產(chǎn)物，類黑素越多，陳皮表面顏色越深。觀察不同加熱溫度陳皮凍干粉可得，粉末為棕至棕褐色，粉末呈蓬松狀，在相同加熱時間的前提下，加熱溫度越高，陳皮凍干粉的顏色越深。由此可推測加熱溫度的升高能加速陳皮陳化反應(yīng)的進程。4.2含量測定結(jié)果4.2.1氨基酸百分含量測定結(jié)果不同加熱溫度的陳皮提取液在進行茚三酮顯色法后，用空白試劑調(diào)零，在紫外567nm處測定吸光度，每個樣品平行測定兩次，取平均值。將上述平均吸光度分別代入甘氨酸標準曲線計算其濃度，并根據(jù)百分含量公式計算出各樣品的氨基酸百分含量。具體數(shù)據(jù)如表4所示。甘氨酸標準曲線：回歸方程：y=131.05x-0.462，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9954，單位：mg/mL表4不同加熱溫度陳皮凍干粉氨基酸濃度及百分含量計算加熱溫度（℃）粉末重量（g）取樣量（g）平均吸光度濃度（μg/mL）稀釋倍數(shù)百分含量（%）503.340.01020.5767.917102.592603.710.01050.6878.764103.097703.500.01050.6408.409102.803803.180.01060.3726.360101.908903.240.01050.3596.261101.9321002.890.01030.3145.921101.661圖SEQ圖\*ARABIC1不同加熱溫度陳皮樣品中氨基酸百分含量變化趨勢圖美拉德反應(yīng)的主要反應(yīng)底物為氨基酸和還原糖，而由于每份樣品的初始含量是一樣的，每份樣品的處理過程除加熱時間與加熱溫度不相同外其余都相同，因此可以根據(jù)陳化反應(yīng)后氨基酸與還原糖的含量來判斷加熱時間與加熱溫度對陳化反應(yīng)的影響。根據(jù)趨勢圖可得，氨基酸的百分含量總體呈下降趨勢，說明隨著陳皮加熱溫度的升高，陳皮提取液中的氨基酸消耗量增多，由于氨基酸為美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵反應(yīng)底物，由此可判斷加熱溫度越高，陳皮陳化反應(yīng)進程越快。4.2.2還原糖百分含量測定結(jié)果不同加熱溫度的陳皮提取液在進行DNS顯色法后，用空白試劑調(diào)零，在紫外498nm處測定吸光度，每個樣品平行測定兩次，取平均值。將上述平均吸光度代入DNS標準曲線計算濃度，并根據(jù)百分含量公式計算出各樣品的還原糖百分含量。具體計算結(jié)果如表5。DNS標準曲線：回歸方程：y=28.626x-0.2351，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9991，單位：mg/mL表5不同加熱溫度陳皮凍干粉還原糖濃度及百分含量計算加熱溫度（℃）粉末重量（g）取樣量（g）平均吸光度濃度（μg/mL）稀釋倍數(shù)百分含量（%）503.340.01020.4372.348107.688603.710.01050.5272.662109.407703.500.01050.6803.1971010.656803.180.01060.4382.350107.049903.240.01050.5212.640108.1451002.890.01030.5612.779107.798圖SEQ圖\*ARABIC2不同加熱溫度陳皮樣品中還原糖百分含量變化趨勢圖還原糖也是美拉德反應(yīng)初級階段反應(yīng)的重要反應(yīng)底物之一，因此它的含量陳皮陳化反應(yīng)程度也有一定聯(lián)系。根據(jù)還原糖百分含量趨勢圖，隨著加熱溫度的上升，還原糖含量呈先上升后下降再上升的趨勢，還原糖百分含量并沒有特殊的規(guī)律，不能確定還原糖含量的變化是否與陳皮陳化反應(yīng)有確切的關(guān)系。4.2.35-HMF含量測定結(jié)果對5-HMF標準品溶液進行定性分析，得到結(jié)果如圖3。圖35-HMF標準品液相色譜圖HMF標準品溶液所得液相色譜圖譜無雜峰，可以判斷該峰即為5-HMF峰，保留時間為11.965min，可以為樣品后續(xù)判斷5-HMF峰作參考。圖480℃加熱7天樣品液相色譜圖對不同加熱溫度的陳皮提取液使用高效液相色譜法測定后，發(fā)現(xiàn)各樣品在保留時間為11.965min左右均有且僅有一個峰面積較大且旁邊無雜峰的色譜峰，結(jié)合5-HMF標準品的測量結(jié)果判斷該峰為5-HMF色譜峰，記錄各樣品5-HMF色譜峰的保留時間、峰面積、分離度、理論塔板數(shù)。根據(jù)中國藥典規(guī)定，色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5，理論塔板數(shù)應(yīng)大于2000。結(jié)合樣品測量數(shù)據(jù)，本次樣品色譜峰均符合要求，可以進行下一步計算操作。將各樣品測量所得峰面積代入所得的5-羥甲基糠醛標準曲線計算濃度，并根據(jù)含量公式計算出5-HMF含量。具體數(shù)據(jù)見表6。5-羥甲基糠醛標準曲線：回歸方程：y=75691x+893.12，相關(guān)系數(shù)：R2=0.9999，單位：μg/mL，峰面積范圍：9355-3848829。表6不同加熱溫度陳皮凍干粉中5-HMF的濃度及含量加熱溫度（℃）粉末重量（g）取樣量（g）峰面積濃度（μg/mL）含量（μg/g）503.340.0106336340.4326136.297603.710.0104691140.9013321.524703.500.01091975792.5985834.393803.180.01092549383.3563979.190903.240.01082253682.9657889.7021002.890.01062227362.9309799.085圖5不同加熱溫度陳皮樣品中5-HMF含量變化趨勢圖由于陳皮的陳化反應(yīng)是在酸性的環(huán)境中進行的，因此陳皮進行美拉德反應(yīng)中期階段的主要反應(yīng)產(chǎn)物為羥甲基糠醛，因此直接測量陳皮陳化反應(yīng)后的5-HMF含量可以直觀有效的反應(yīng)陳皮陳化反應(yīng)程度。從5-HMF含量變化趨勢圖看，隨著溫度的上升，陳皮提取液中5-HMF的含量總體呈上升趨勢，說明溫度對5-HMF的生成具有重要的影響，溫度越高，5-HMF的生成量越高，陳皮陳化反應(yīng)進程越快。4.3吸光度測定不同加熱溫度陳皮提取液在紫外294nm、420nm、479nm下的吸光度測定結(jié)果如表7、8所示。表7不同加熱溫度陳皮提取液在紫外294nm下的吸光度加熱溫度（℃）濃度（mg/mL）A294（Abs）501.020.284601.050.371701.050.417801.060.380901.050.5181001.030.483表8不同加熱溫度陳皮提取液在紫外420nm、470nm下的吸光度加熱溫度（℃）濃度（mg/mL）A420（Abs）A470（Abs）500.510.1260.091600.560.1560.109700.570.2270.164800.510.2580.178900.560.4880.3251000.550.4770.311圖6不同加熱溫度陳皮樣品在420nm紫外下吸光度變化趨勢圖吸光度為溶液吸光程度的度量,吸光度越大,表面溶液對光的吸收越強,透過的光越少，即溶液顏色越深，而看顏色是人們區(qū)別陳皮陳化程度最直觀的方法之一。根據(jù)趨勢圖，隨著陳皮加熱溫度的升高，供試液在294nm，420nm，470nm中的吸光度總體呈上升趨勢，并在90℃達到最高值，可以說明，在相同加熱時間的前提下，陳皮的顏色隨著溫度的升高而變深，在90℃加熱的陳皮供試液顏色最深。4.4pH值測定不同加熱溫度的陳皮提取液的pH測量值如表9所示。表9不同加熱溫度陳皮提取液pH值加熱溫度（℃）5060708090100pH值4.674.634.354.304.234.04圖7不同加熱溫度陳皮樣品pH值變化趨勢圖結(jié)合樣品數(shù)據(jù)，所有樣品的pH值均小于7，由此可判斷陳皮加熱時進行的是1,2-烯醇化反應(yīng)，生成物以HMF為主，而HMF的積累與褐變速度密切相關(guān)，因此探究陳皮褐變反應(yīng)程度可以從探究HMF的含量方面著手。從不同加熱溫度方面看，隨著加熱溫度的不斷上升，陳皮提取液的pH值不斷下降，可以判斷陳皮陳化反應(yīng)的pH值與加熱溫度有一定關(guān)系，在溫度越高的條件的發(fā)生陳化反應(yīng)，可能會導致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生增多，溶液pH值下降。4.5相關(guān)性分析將不同加熱溫度的陳皮樣品與其測定的氨基酸百分含量、還原糖百分含量、5-HMF含量、吸光度和pH值導入SPSS軟件進行皮爾遜相關(guān)性分析，分析結(jié)果見表10。表10不同加熱溫度與不同測定指標的相關(guān)性分析P值皮爾遜相關(guān)性氨基酸0.037-0.838*還原糖0.598-0.2755-HMF0.0450.801吸光度0.0050.994**pH值0.001-0.974**注：*在0.05級別（雙尾），相關(guān)性顯著。**在0.01級別（雙尾），相關(guān)性顯著。 由表可得，將不同加熱溫度的陳皮樣品與氨基酸含量進行相關(guān)性分析，所得P值<0.05，即為差異顯著，由于相關(guān)性系數(shù)為負值且相關(guān)性顯著，因此陳皮加熱溫度與氨基酸含量呈負顯著相關(guān)性，加熱溫度越高，陳皮所含氨基酸含量越少。將不同加熱溫度陳皮樣品與還原糖含量進行相關(guān)性分析，所得P值>0.05，即為不存在顯著性差異，因此陳皮加熱溫度與還原糖含量并無相關(guān)性。將不同加熱溫度陳皮樣品與5-HMF含量進行相關(guān)性分析，所得p值<0.05，為差異顯著，相關(guān)性為正值，因此陳皮加熱溫度與5-HMF含量呈正相關(guān)性，加熱溫度越高，陳皮所含5-HMF含量越高。將不同加熱溫度陳皮樣品與吸光度進行相關(guān)性分析，所得P值<0.05，為差異顯著，相關(guān)性為正值，即陳皮加熱溫度與吸光度呈正顯著相關(guān)性，加熱溫度越高，陳皮表面顏色越深。將不同加熱溫度陳皮樣品與pH值進行相關(guān)性分析，所得P值<0.05，為差異顯著，相關(guān)性為負值，即陳皮加熱溫度與pH值呈負顯著相關(guān)性，加熱溫度越高，陳皮溶液的pH值越低。5不同加熱時間樣品實驗結(jié)果與分析5.1模擬陳化樣品外觀性狀在相同加熱溫度的條件下，隨著加熱時間的延長，陳皮的凍干粉末的顏色逐漸變深，粉末呈蓬松狀，在前期顏色有較為明顯的改變，但在后期顏色的變化逐漸變小，推測陳皮陳化反應(yīng)同樣受加熱時間影響，延長加熱時間能促進陳皮的陳化反應(yīng)。5.2含量分析結(jié)果5.2.1氨基酸百分含量測定結(jié)果不同加熱時間的陳皮樣品氨基酸測定及計算結(jié)果如表11。表11不同加熱時間陳皮凍干粉氨基酸濃度及百分含量計算加熱時間（天）粉末重量（g）取樣量（g）平均吸光度濃度（μg/ml）百分含量（%）33.640.01060.3616.2802.15763.510.01050.3035.8371.95193.410.01090.3656.3071.973123.490.01020.2865.7081.953153.460.01080.2335.3001.698183.410.01070.6848.7451.393213.340.01070.7068.9131.391243.290.01020.5347.6001.226273.290.01050.7789.4621.482303.280.01090.88110.2441.541圖8不同加熱時間陳皮樣品中氨基酸百分含量變化趨勢圖從不同加熱天數(shù)樣品來看，氨基酸的百分含量呈先下降后上升的趨勢，但總體來說呈下降趨勢?？梢耘袛嚯S著加熱的時間增大，陳皮提取液中的氨基酸消耗量也增多，在一定程度上能反應(yīng)陳皮陳化反應(yīng)的反應(yīng)進程。5.2.2還原糖百分含量測定結(jié)果不同加熱時間的陳皮樣品還原糖測定及計算結(jié)果如表12。表12不同加熱時間陳皮凍干粉還原糖濃度及百分含量計算加熱時間（天）粉末重量（g）取樣量（g）平均吸光度濃度（μg/mL）稀釋倍數(shù)百分含量（%）33.640.01060.79035.811012.29763.510.01050.79235.861011.98893.410.01090.79435.951011.247123.490.01020.68332.051010.968153.460.01080.77035.111011.249183.410.01070.19915.15209.654213.340.01070.29118.362011.463243.290.01020.24016.582010.695273.290.01050.31919.362012.130303.280.01090.30918.992011.429圖9不同加熱時間陳皮樣品中還原糖百分含量變化趨勢圖根據(jù)還原糖百分含量的變化趨勢圖，發(fā)現(xiàn)隨著加熱的增長，還原糖百分含量相對穩(wěn)定，沒有太大的規(guī)律。說明還原糖含量的變化并不能很好地反應(yīng)陳皮陳化反應(yīng)進程。5.2.35-HMF含量測定結(jié)果不同加熱時間的陳皮樣品5-HMF測定及計算結(jié)果如表13。表13不同加熱時間陳皮凍干粉中5-HMF的濃度及含量加熱時間（天）粉末重量（g）取樣量（g）峰面積濃度（μg/mL）含量（mg/g）33.640.01073963755.22501.77763.510.01084435605.84831.90093.410.01074162055.48691.748123.490.01084205695.54461.791153.460.01074235815.58441.805183.410.01013713924.89491.652213.340.01095238846.90962.117243.290.01075384767.10232.183273.290.01094148915.46961.650303.280.01065320407.01732.171圖10不同加熱時間陳皮樣品中5-HMF含量變化趨勢圖從不同加熱時間樣品看，隨著加熱時間的不斷升高，樣品中5-HMF的含量總體呈緩慢上升的趨勢，說明加熱時間對陳皮陳化反應(yīng)有一定的影響，加熱時間越長，陳皮陳化反應(yīng)進程越快，但受加熱時間影響的程度相對加熱溫度較小。5.3吸光度測定結(jié)果不同加熱時間陳皮提取液在紫外294nm、420nm、479nm下的吸光度測定結(jié)果如表14所示。表14不同加熱時間陳皮提取液在294nm、420nm、470nm下的吸光度加熱時間（天）濃度（mg/ml）A294（Abs）A420（Abs）A470（Abs）30.552.1230.2190.15560.531.7740.2370.17290.552.0980.3500.258120.532.0540.3620.260150.572.3600.4410.295180.592.6310.5850.410210.582.7110.5940.409240.552.7390.6070.427270.572.5040.6330.455300.542.2580.4750.321圖11不同加熱時間陳皮樣品在紫外420nm下的吸光度變化趨勢圖根據(jù)吸光度可得，相同加熱溫度的條件下，隨著加熱時間的延長，陳皮供試液總體的吸光度呈上升趨勢，證明陳皮陳化反應(yīng)亦受加熱時間的影響，加熱時間越長，陳皮陳化反應(yīng)進程越迅速，陳皮的顏色越深。5.4pH值測定結(jié)果不同加熱時間的陳皮提取液的pH測量值如表15所示。表15不同加熱時間陳皮提取液pH值加熱時間（天）36912151821242730pH值4.794.644.484.424.304.084.124.113.944.66圖12不同加熱時間陳皮提取液pH值變化趨勢圖從pH值變化趨勢圖看，隨著加熱時間的不斷延長，陳皮提取液的pH值總體呈下降趨勢，可以判斷陳皮陳化反應(yīng)的pH值與加熱時間亦有一定關(guān)系，加熱時間的延長可能會導致陳皮陳化反應(yīng)進程加快，酸性物質(zhì)的產(chǎn)生增多，從而導致溶液pH值下降。5.5相關(guān)性分析將不同加熱時間的陳皮樣品與其測定的氨基酸百分含量、還原糖百分含量、5-HMF含量、吸光度和pH值導入SPSS軟件進行皮爾遜相關(guān)性分析，分析結(jié)果見表16。表16不同加熱時間與不同測定指標的相關(guān)性分析P值皮爾遜相關(guān)性氨基酸0.002-0.848**還原糖0.523-0.2305-HMF0.2170.429吸光度0.0020.856**pH值0.082-0.575注：**在0.01級別（雙尾），相關(guān)性顯著。由表可得，將不同加熱時間的陳皮樣品與氨基酸含量進行相關(guān)性分析，所得P值<0.05，即為差異顯著，由于相關(guān)性為負值且相關(guān)性顯著，因此陳皮加熱時間與氨基酸含量呈負顯著相關(guān)性，加熱時間越長，陳皮所含氨基酸含量越少。將不同加熱時間陳皮樣品與還原糖含量進行相關(guān)性分析，所得P值>0.05，即為不存在顯著性差異，因此陳皮加熱時間與還原糖含量并無相關(guān)性。將不同加熱時間陳皮樣品與5-HMF含量進行相關(guān)性分析，所得P值>0.05，即為不存在顯著性差異，因此陳皮加熱時間與5-HMF含量并無相關(guān)性。將不同加熱時間陳皮樣品與吸光度進行相關(guān)性分析，所得P值<0.05，為差異顯著，相關(guān)性系數(shù)為正值，即加熱時間與吸光度呈正顯著相關(guān)性，加熱時間越長，吸光度越高，陳皮表面顏色越深。將不同加熱時間陳皮樣品與pH值進行相關(guān)性分析，所得P值>0.05，即為不存在顯著性差異，因此陳皮加熱時間與pH值并無相關(guān)性。6結(jié)論與討論6.1結(jié)論1、從不同加熱溫度方面看，隨著加熱溫度的上升，陳皮提取液的顏色變深，氨基酸的含量減少，還原糖的含量變化不大，5-HMF的生成量增多，陳化反應(yīng)后溶液的pH值降低。根據(jù)相關(guān)性分析，氨基酸含量與加熱溫度呈負相關(guān)性，還原糖含量與加熱溫度無相關(guān)性，5-HMF含量與加熱溫度呈正相關(guān)性，吸光度與加熱溫度呈正相關(guān)性，pH值與加熱溫度呈負相關(guān)性。綜合以上信息可得出結(jié)論，陳皮加熱溫度越高，陳皮陳化反應(yīng)進程越快。