堿性磷酸酶的活力測定

關(guān)于堿性磷酸酶的活力測定問題1：

為何要測定血清中酶的活性？有什么意義？第2頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

酶活性測定是目前臨床酶學(xué)分析最為常用的方法。酶測定約占目前臨床生化總工作量的1/4到1/2。用于診斷的酶類已超過100多種，常用的數(shù)十種。引言（1）第3頁,共41頁，2024年2月25日，星期天血漿酶血漿特異酶非血漿特異酶外分泌酶細(xì)胞內(nèi)酶血漿酶的來源第4頁,共41頁，2024年2月25日，星期天（一）血漿特異酶在血漿中發(fā)揮特定催化作用的酶。如凝血酶、膽堿酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、銅氧化酶等。它們大多數(shù)在肝內(nèi)合成，在血漿中的濃度甚至超過器官細(xì)胞內(nèi)濃度。有的可以作為肝功能試驗(yàn)的一部分。血漿特異酶活性的改變，除了反映血液功能外，還反映來源器官的功能。第5頁,共41頁，2024年2月25日，星期天（二）非血漿特異酶在血漿中濃度很低，且無功能，分為兩種。

1.分泌酶：來源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如α-淀粉酶（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶原、胰蛋白酶原、ALP等。正常體液中外分泌酶活性低而穩(wěn)定，不發(fā)生催化作用。在血液中的濃度和其分泌腺體的功能活動(dòng)和疾病有關(guān)，來源增加或排泄受阻時(shí)，血漿中此類酶活性增高。例如，急性胰腺炎時(shí)，血淀粉酶就會(huì)升高。

第6頁,共41頁，2024年2月25日，星期天2.代謝酶：（細(xì)胞酶）在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮催化功能的酶。正常時(shí)這些酶存在于組織細(xì)胞中，血漿中酶活性很低。細(xì)胞內(nèi)、外濃度差異懸殊。當(dāng)酶來源的組織細(xì)胞發(fā)生病變，細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶大量進(jìn)入血漿，導(dǎo)致血漿酶活性顯著增高。其下降的臨床意義很少。這一類酶臨床應(yīng)用較多，如轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等，它們?cè)诟尾?、心臟疾病時(shí)都可能出現(xiàn)變化。第7頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

一些酶在不同器官、組織、細(xì)胞內(nèi)的分布和定位存在明顯差異，而且在細(xì)胞內(nèi)外有明顯濃度梯度差。正常情況下血漿中酶活性相對(duì)恒定。但一些病理情況常導(dǎo)致血漿中酶活性的改變。性別、年齡、運(yùn)動(dòng)、妊娠、人種及環(huán)境因素等可引起人血漿中某些酶的生理性變化。所以酶與其它指標(biāo)相比具有更高的診斷特異性和靈敏度。引言（2）第8頁,共41頁，2024年2月25日，星期天診斷常用血清酶血清酶符號(hào)來源鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶OCT肝卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶LCAT肝谷氨酸脫氫酶GLDH肝山梨醇脫氫酶SDH肝丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT肝、腎、心異檸檬酸脫氫酶ICD肝、胎盤、心

-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶-GT

肝、膽、腎、小腸5ˊ-核苷酸酶5ˊ-NT肝、膽道單胺氧化酶MAO肝、腎、腦天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST心、肝、骨骼肌肌酸激酶CK骨骼肌、心、腦乳酸脫氫酶LDH心、腎、骨骼肌、肝、肺堿性磷酸酶ALP骨骼、牙齒、肝、腎酸性磷酸酶ACP前列腺、紅細(xì)胞、血小板淀粉酶AMS胰、唾液腺脂肪酶LPS胰第9頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALPorAKP)ALP幾乎存在于機(jī)體各個(gè)組織，但以骨骼、牙齒、肝臟和腎臟中含量較多，兒童期含量尤其多。ALP有六種同功酶。其中AKP1、AKP2、AKP6來自肝臟，AKP3來自骨細(xì)胞，AKP4產(chǎn)生于胎盤及癌細(xì)胞，而AKP5來自小腸絨毛上皮與成纖維細(xì)胞。

臨床上測定ALP活性主要用于肝臟疾病和骨骼疾病的診斷。當(dāng)肝臟受到損傷或者障礙時(shí)經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高。第10頁,共41頁，2024年2月25日，星期天是一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶，即通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團(tuán)除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基，這類底物包括核酸、蛋白、生物堿等。而該脫去磷酸基團(tuán)的過程稱為去磷酸化或脫磷酸化。堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中有最大活力。什么是ALP?第11頁,共41頁，2024年2月25日，星期天問題1:為什么要測定堿性磷酸酶的活性？有什么意義？1.生理性增加：如兒童、妊娠期、進(jìn)食高糖、高脂肪食物等均可使血清ALP活性增高。2.病理性改變：升高

（1）肝膽疾病。主要見于阻塞性黃疸，急、慢性黃疸性肝炎，肝癌等均可引起血清ALP活力不同程度的升高，其中以癌性梗阻最明顯。（2）各種骨骼疾病。ALP主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，故骨骼病特別是有新生骨質(zhì)生成時(shí)，血液內(nèi)ALP活性增加，以促進(jìn)磷酸鹽的沉積。如佝僂病、纖維性骨病、成骨不全癥、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等均引起血清ALP活力升高。降低：主要見于呆小癥，磷酸酶過少癥等。第12頁,共41頁，2024年2月25日，星期天問題2：

如何測定酶活性？第13頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

酶活性：酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力常用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量（即酶促反應(yīng)速度）來表示酶活性大小

酶活性的概念注：在實(shí)際測定酶促反應(yīng)速度時(shí)，以測定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好。第14頁,共41頁，2024年2月25日，星期天固定時(shí)間法：（終點(diǎn)法）通常是酶作用一段時(shí)間后，加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止酶促反應(yīng)，測定這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。連續(xù)監(jiān)測法：（速率法）連續(xù)監(jiān)測法是指每隔一定時(shí)間（2～60s），連續(xù)多次測定酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物量隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法。適用于自動(dòng)生化分析儀能動(dòng)態(tài)觀測酶促反應(yīng)進(jìn)程，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在較短時(shí)間內(nèi)完成測定。酶活性的測定方法第15頁,共41頁，2024年2月25日，星期天酶偶聯(lián)測定法應(yīng)用：對(duì)于底物或產(chǎn)物不能直接測定或難于準(zhǔn)確測定的酶促反應(yīng)。

ExEaEiABCP式中A為底物，B、C為中間產(chǎn)物，P為產(chǎn)物（必須能夠直接測定），Ex為待測酶，Ea、Ei都為工具酶。按照工具酶作用的不同，Ea又稱為輔助酶，Ei又稱為指示酶，CP稱為指示反應(yīng)。第16頁,共41頁，2024年2月25日，星期天問題3：

在酶促反應(yīng)進(jìn)程中，是否任一階段的酶促反應(yīng)速度都可以代表酶活性？第17頁,共41頁，2024年2月25日，星期天酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應(yīng)速度，即酶促反應(yīng)初速度。酶的含量酶活性酶促反應(yīng)初速度第18頁,共41頁，2024年2月25日，星期天問題4：測酶活性應(yīng)注意哪些方面？第19頁,共41頁，2024年2月25日，星期天合適的底物與最適底物濃度底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶濃度理想的緩沖液與最適離子強(qiáng)度最適溫度最適pH合適的輔因子、激活劑濃度合理的測定時(shí)間對(duì)于固定時(shí)間法，需在酶作用一段時(shí)間后，加入合適的終止劑終止酶促反應(yīng)。盡量去除各種抑制劑酶最適反應(yīng)條件的選擇第20頁,共41頁，2024年2月25日，星期天問題5：如何表示酶活性大??？第21頁,共41頁，2024年2月25日，星期天酶活性單位定義：在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物（或得到一定量的產(chǎn)物）所需要的酶量。分類：慣用單位：酶活性測定方法的建立者所規(guī)定的單位。國際單位(Internationalunit,IU)：指在規(guī)定條件（最適pH，最適底物濃度）下，每分鐘轉(zhuǎn)化1

mol底物的酶量。單位為IU/L

。Kat單位：指在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量，1Kat=6×107IU。第22頁,共41頁，2024年2月25日，星期天酶的活力單位國際單位：Katal，1s轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量臨床表示：Kings，如血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位，每100ml血清在37℃。pH=7.4的條件下與底物作用60min，生成1μmol丙酮酸所需的酶量為1個(gè)活力單位酶的比活力：單位質(zhì)量酶蛋白或單位體積酶制劑所含有酶活力單位數(shù)，即酶活力濃度。酶活力的測定方法1.終止測定法（定時(shí)法或終點(diǎn)法）2.動(dòng)力學(xué)分析法（連續(xù)監(jiān)測法或速率法）第23頁,共41頁，2024年2月25日，星期天目錄ONTENTSC壹·實(shí)驗(yàn)?zāi)康馁E·實(shí)驗(yàn)原理叁·實(shí)驗(yàn)器材與試劑肆·實(shí)驗(yàn)操作第24頁,共41頁，2024年2月25日，星期天壹實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹さ?5頁,共41頁，2024年2月25日，星期天熟悉血清堿性磷酸酶活性的測定方法（磷酸苯二鈉法）掌握血清堿性磷酸酶測定的臨床意義第26頁,共41頁，2024年2月25日，星期天貳實(shí)驗(yàn)原理

·第27頁,共41頁，2024年2月25日，星期天測定ALP活性的方法主要分為兩種一是測定底物解離下的磷酸根來計(jì)算酶活力，如β-甘油磷酸鈉法，但存在血清本身有磷酸根的缺點(diǎn)二是測定底物解離磷酸根后的羥基化合物，這種方法又可分為：酚化合物在顯色劑的作用下顯色比色測定（如本次實(shí)驗(yàn)方法）。生成的酚化合物本身在一定的條件下就可顯色，如對(duì)硝基苯磷酸二鈉（PNPP）法。無色的對(duì)硝基苯磷酸二鈉在ALP的作用下，生成在405nm處有特異吸收的淡黃色對(duì)硝基苯酚。通過測定在405nm處吸光度的變化速率來計(jì)算ALP的活性。第28頁,共41頁，2024年2月25日，星期天磷酸苯二鈉法在pH10環(huán)境中，ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉。苯酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成醌衍生物?？筛鶕?jù)紅色深淺測定酶活性的大小。4-氨基安替比林（鐵氰化鉀）+苯酚

→紅色醌亞胺衍生物磷酸苯二鈉+H2O(ALP,PH=10)→苯酚+磷酸氫二鈉第29頁,共41頁，2024年2月25日，星期天叁實(shí)驗(yàn)器材與試劑·第30頁,共41頁，2024年2月25日，星期天（一）器材：

5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可調(diào)式移液器，721E分光光度計(jì)，1cm比色皿，37℃恒溫水?。ǘ┰噭?、碳酸鹽緩沖液(0.1mol/L，pH10.0)：溶解無水碳酸鈉6.36g，碳酸氫鈉3.36g。4-氨基安替比林1.5g于蒸餾水800ml中，將此溶液轉(zhuǎn)入1L容量瓶內(nèi)，加蒸餾水到刻度。棕色瓶中貯存。2、20mmol/L磷酸苯二鈉溶液先將500ml蒸餾水煮沸，迅速加入磷酸苯二鈉2.18g(磷酸苯二鈉如含2分子結(jié)晶水，則應(yīng)稱取2.54g)，冷卻后加氯仿2ml防腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不應(yīng)再倒回瓶中）淡黃色結(jié)晶。熔點(diǎn)109℃。溶于水、苯和乙醇，微溶于乙醚。第31頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

3、鐵氰化鉀的硼酸溶液稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸餾水400ml中，兩液混合后，加蒸餾水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出現(xiàn)藍(lán)綠色即棄去)。4、酚標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.05mg/ml）：購買合格的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。4一氨基安替比林用量與吸光度成正相關(guān)，需準(zhǔn)確加入。鐵氰化鉀用量不足時(shí)，反應(yīng)不完全，測量結(jié)果偏低，因此鐵氰化鉀用量必須加足或稍稍過量本實(shí)驗(yàn)采用終止法；終止劑是鐵氰化鉀硼酸液；硼酸改變了PH，使其不再處于最適PH。第32頁,共41頁，2024年2月25日，星期天肆實(shí)驗(yàn)操作·第33頁,共41頁，2024年2月25日，星期天立即混勻。用510nm波長（紅色醌物質(zhì)的最大吸收波長）比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。保持反應(yīng)時(shí)溫度是均衡的，37°C取試管4支，按下表操作實(shí)驗(yàn)過程兩次水浴保溫，一次5min，一次15min。前者是達(dá)到最適溫度，后者是反應(yīng)時(shí)間第34頁,共41頁，2024年2月25日，星期天ADDYOURTITLEHERE12單擊此處編輯您要的內(nèi)容，建議您在展示時(shí)采用微軟雅黑字體，本模版所有圖形線條及其相應(yīng)素材均可自由編輯、改色、替換。更多使用說明和作品請(qǐng)?jiān)旈喣０孀钅┑氖褂檬謨?cè)。單擊編輯標(biāo)題單擊此處可編輯內(nèi)容，根據(jù)您的需要自由拉伸文本框大小單擊此處可編輯內(nèi)容，根據(jù)您的需要自由拉伸文本框大小【注意事項(xiàng)】1、鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定最后所顯色的作用。此液應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍(lán)綠色即作廢。2、底物液中不應(yīng)含有酚，如含有酚時(shí)空白管顯紅色，說明磷酸苯二鈉已開始分解，不宜繼續(xù)使用。3、加入鐵氰化鉀后必須迅速混勻(為了改變PH來終止酶促反應(yīng)）否則對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，偏大。4、一般血清標(biāo)本可以共用對(duì)照管，黃疸血清及溶血血清應(yīng)分別作對(duì)照管5、目前市售的酚標(biāo)準(zhǔn)液多數(shù)為安瓿瓶，開后不能久置第35頁,共41頁，2024年2月25日，星期天計(jì)算ALP活性=（A測定—A對(duì)照）/（A標(biāo)準(zhǔn)—A空白）*0.05*100(金氏單位）金氏單位定義每100ml血清在37℃與底物作用15分鐘，產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)金氏單位。參考值成人：3~13金氏單位兒童：5~28金氏單位第36頁,共41頁，2024年2月25日，星期天臨床意義：血清中ALP活力測定在臨床常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。1．血清ALP活性升高可能原因如下：①肝膽疾?。鹤枞渣S疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；②骨骼疾?。河捎诠堑膿p傷或疾病使成骨細(xì)胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放進(jìn)入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。2．血清ALP活性降低比較少見：主要見于呆小病、重癥慢性腎炎、乳糜瀉、貧血、惡病質(zhì)等。另有一種遺傳性低ALP癥，因成骨細(xì)胞中缺乏ALP，引起骨中的礦物質(zhì)嚴(yán)重缺乏，易發(fā)生骨折