紅心火龍果果皮甜菜紅素提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復作用研究

紅心火龍果果皮甜菜紅素提取工藝優(yōu)化及其對氧化損傷修復作用研究【摘要】目的：優(yōu)化紅心火龍果果皮甜菜紅素的提取工藝，研究甜菜紅素對氧化損傷后斑馬魚的修復作用。方法：通過響應面試驗優(yōu)化紅心火龍果果皮中甜菜紅素提取工藝。測定谷胱甘肽（GSH）含量，建立氧化應激模型作為甜菜紅素對氧化損傷的修復作用指標。利用微分脈沖伏安法測定，得到斑馬魚腦組織中多巴胺含量并使用ImageJ運動跟蹤軟件測量自發(fā)運動，考察甜菜紅素對其神經(jīng)毒性的修復作用。結(jié)果：采用響應面試驗優(yōu)化提取條件，得到最優(yōu)條件為：乙醇濃度：55%，提取溫度：37℃，總甜菜紅素含量為12.8mg/100g。斑馬魚經(jīng)過氧化應激造模后GSH平均含量為：234.4mg/100g，多巴胺含量為5624ng/g，自發(fā)活動表現(xiàn)為行為增強。0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L三組實驗組的斑馬魚給藥168h后GSH平均含量分別為258.8mg/100g、289.8mg/100g、365.8mg/100g，多巴胺含量分別為4255ng/g、4248ng/g、4060ng/g，自發(fā)行為表現(xiàn)為平靜。結(jié)論：紅心火龍果果皮甜菜紅素對氧化損傷后的斑馬魚有修復作用。【關鍵詞】紅心火龍果果皮；甜菜紅素；提取工藝；抗氧化活性；氧化應激修復作用；StudyonextractiontechnologyofbetacyaninsfromPitayapeelanditsrepairtooxidativedamage【Abstract】Objective:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninsinredpitayapeelandinvestigatethereparativeeffectofbetacyaninsonoxidativedamageinzebrafish.Methods:Optimizetheextractionprocessofbetacyaninfromthepeelofredpitayafruitviaresponsesurfacemethodologyanddeterminetheoptimalextractionconditionsbasedonbetacyanincontent.Determinethecontentofglutathioneandinvestigatetheestablishmentofanoxidativestressmodelandthereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Scanthedopaminecontentinzebrafishbraintissueusingdifferentialpulsevoltammetrytoevaluatethereparativeeffectsofbetacyaninonzebrafishneurotoxicity.MeasurespontaneousmovementsusingImageJmotiontrackingsoftware.Comparetheresultsobtained,andexaminethereparativeeffectsofbetacyaninonoxidativestress.Results:Byusingresponsesurfacemethodologytooptimizetheextractionconditions,theoptimalconditionsweredeterminedtobe:ethanolconcentrationof55%,extractiontemperatureof37°C,andatotalbetacyanincontentof12.8mg/100g.Afterundergoingoxidativestressmodeling,theaverageGSHcontentofzebrafishwas234.4mg/100g,andthedopaminecontentwas5624ng/g.Spontaneousactivitywasenhanced.Followingadministrationof0.2g/L,0.1g/L,and0.05g/Loftheextractfor168hours,theaverageGSHcontentofzebrafishinthethreeexperimentalgroupswas258.8mg/100g,289.8mg/100g,and365.8mg/100g,respectively.Thedopaminecontentinthethreeexperimentalgroupswas4255ng/g,4248ng/g,and4060ng/g,respectively,andspontaneousactivityappearedtobecalm.Conclusion:Betacyaninsfromtheredpitayafruitpeelhavearepairingeffectonzebrafishafteroxidativedamage.【Keywords】RedPitayapeel;Betacyanins;Extractiontechnology;Antioxidantactivity;Oxidativestressrepair目錄TOC\o"1-3"\h\u1前言 前言甜菜紅素（betacyanin）是水溶性色素，屬于吡啶類衍生物，分為紅色的甜菜紅素（Betacyanins）和黃色的甜菜黃素（Betaxanthins）REF_Ref14782\r\h[1]。甜菜紅素是一類含氮的天然色素，由甜菜醛氨酸和環(huán)-3,4-二羥基苯丙氨酸（cyclo-Dopa）共軛生成（如圖1所示），甜菜醛氨酸的共軛雙鍵部分構成發(fā)色團REF_Ref14835\r\h[2]；最常見的甜菜紅素是甜菜苷（Betanin），即Betanidin-5-O-葡萄糖苷，為游離的Betanidin與葡萄糖結(jié)合形成的糖苷REF_Ref14946\r\h[3，4]。甜菜紅素具有較高的親水性和著色強度，因而可作為食品、藥品及化妝品的重要且有效天然著色劑REF_Ref28885\r\h[4]。紅心火龍果果皮中甜菜紅素作為著色劑添加到相關食品中且由于其結(jié)構的特殊性，除著色作用外甜菜紅素還可以作為天然抗氧化劑，其機制可能是通過增強肝細胞的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化，并清除自由基來實現(xiàn)的[5]。圖1甜菜醛氯酸（A）、cyclo-Dopa（B）、甜菜苷配基（C）、甜菜苷（D）的化學結(jié)構紅甜菜根、紅火龍果和紅莧菜是甜菜紅素的三大主要來源，據(jù)統(tǒng)計其中甜菜紅素的含量范圍為44-51mg/g凍干提取物[6]。其中在紅皮火龍果果皮以及紅皮紅肉的果肉中均含有甜菜紅素，值得注意的是，果皮占整果18%-24%，其甜菜紅素含量為6-22mg/100g[7]，但果皮常被丟棄，故與此同時丟棄了大量甜菜紅素資源?；瘕埞麃碓吹奶鸩思t素有8種，其中甜菜苷（betanin）占比最大[8]。目前沒有單一結(jié)構的甜菜紅素標品，這在某種程度上制約了相關研究，其含量測定方法為大部分學者利用紫外可見分光光度計測量其在最大吸收波長下的吸光度值后計算[8,9]。用于火龍果源甜菜紅素提取的方法有浸提法、微波輔助提取、超聲波輔助提取、超臨界萃取及雙水相萃取，其中，采用乙醇浸提法的提取量最高，但浸提法耗時長，溶劑用量大，總體成本較高[10-14]。氧化應激是指機體在遭受各種刺激時,體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)過量產(chǎn)生，超出機體的清除能力，致氧化和抗氧化狀態(tài)失去平衡，進而引起組織氧化損傷[15]，是導致衰老、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、高血壓、阿爾茨海默病、帕金森病等疾病的重要因素之一[16-20]。而肝臟是生物代謝主要器官，其中谷胱甘肽含量豐富，毒害后會出現(xiàn)明顯反應[21]。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是細胞內(nèi)含量最豐富的低分子質(zhì)量硫醇化合物，廣泛分布于人的肝臟、脾臟、腎臟、肺等器官組織和細胞中[22]。GSH是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽（圖2），其主要特點是具有游離的巰基（—SH），易受氧化，是兩種酶GSH-PX和GST的底物，為分解水和過氧化物必需的，它可以穩(wěn)定含硫醇基團的酶，并防止血紅蛋白和其他輔因子的氧化損傷，GSH缺乏或耗盡可能會導致或加重許多化學物質(zhì)或環(huán)境因素的中毒，GSH是哺乳動物細胞中的非酶類抗氧化劑，含量豐富，不僅是細胞內(nèi)抵御氧化應激的重要機制，也是對抗ROS的重要抗氧化系統(tǒng)防御線，因而GSH的量的多少是衡量機體的重要因素[23]，谷胱甘肽的測量方法有比色法、HPLC法、熒光法等。圖2谷胱甘肽結(jié)構式氧化應激是多巴胺功能細胞神經(jīng)紊亂的重要原因[24]，是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)（圖3），作為調(diào)控人類情緒和能力的重要物質(zhì)，它在人類的運動功能中也發(fā)揮重要作用。許多研究表面，多巴胺的含量與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種退行性疾病有密切聯(lián)系[25]，同時許多治療疾病的有效藥物也圍繞著多巴胺的研究而產(chǎn)生。多巴胺作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與運動、情感和神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，多巴胺系統(tǒng)是近30年來神經(jīng)科學研究的焦點問題之一，一些疾病如帕金森病（PD）、精神分裂癥、Tourette綜合征（TS）、注意缺陷多動障礙（ADHD）等均與多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙有關[26]，檢測多巴胺含量的方法有HPLC法、液相質(zhì)譜聯(lián)用和電化學分析法。圖3多巴胺結(jié)構式關于體內(nèi)氧化損傷的研究對象，陳晨[27]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚是一種常見的神經(jīng)經(jīng)損傷程度的重要因素科學模式生物，它擁有與人類類似的神經(jīng)發(fā)育等特征，斑馬魚和人類的基因有著70%的同源性，且84%的人類疾病相關基因都能在斑馬魚組織中找到，作為主要模式生物之一被廣泛應用于遺傳學、發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學和藥物篩進等科研領域，所以在對斑馬魚做出的實驗結(jié)果也多適用于人體，可用于藥物恢復性的研究及篩選關于斑馬魚氧化應激建模。較多學者是利用醋酸鉛、AAPH、脂多糖對斑馬魚胚胎進行氧化脅迫的造模[28]，并進行了幾種建模類型的比較。戊唑醇是一種三唑類殺菌農(nóng)藥，具有高效、廣譜和內(nèi)吸性的特點，該農(nóng)藥可實現(xiàn)植物的保護、治療和鏟除三種農(nóng)藥功能，并具備殺菌范圍廣、持續(xù)性強等顯著的特性[29]。對于暴露在戊唑醇下的斑馬魚，則有氧化應激損傷[30]，且伴有神經(jīng)毒性[31]，涉及氧化磷酸化、線粒體功能和脂質(zhì)調(diào)節(jié)的受損。本實驗將圍繞著甜菜紅素出發(fā)，利用響應面法優(yōu)化提取紅心火龍果皮甜菜紅素提取的條件，以斑馬魚為實驗對象，利用戊唑醇建立氧化應激模型，利用比色法測定斑馬魚肝臟谷胱甘肽含量作為氧化應激修復作用指標，利用電化學分析法測定斑馬魚大腦多巴胺含量；利用ImageJ斑馬魚運動行為學作為神經(jīng)損傷修復作用指標[32]，研究甜菜紅素的體內(nèi)修復作用。2實驗材料2.1試劑和儀器本實驗所用試劑及儀器如下表1。表1儀器的型號及廠家名稱型號/規(guī)格生產(chǎn)廠家電子分析天平ML-204梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司恒溫水浴鍋金壇市科析儀器有限公司烘箱ST-01佛山市順德區(qū)柏吳金屬制品有限公司紫外分光光度計UV-1750日本島津公司離心機TD-WS/55湖南平凡科技有限公司電化學工作站CHI660E/CH上海辰華儀器有限公司無水乙醇分析純廣州化學試劑廠紅心火龍果購于廣州市小谷圍街道南亭村市場戊唑醇農(nóng)藥生許（浙）0016拜耳股份公司谷胱甘肽試劑盒20220713南京建城生物工程研究所濃鹽酸化學純廣州化學試劑廠二甲基亞砜分析純天津市科密化學試劑有限公司2.2實驗動物Tubingen品系斑馬魚：購于南京一樹梨花生物科技有限公司。3實驗方法3.1響應面法優(yōu)化甜菜紅素提取根據(jù)響應面分析法的原理，參考琚常鑫[4]設置響應面試驗影響因素與水平，見表2。表2響應面試驗影響因素水平與編碼水平水平及編碼-101A乙醇濃度（%）506070B提取溫度（℃）405060C料液比（g/ml）1：51：12.51：20D提取時間（h）0.511.5稱取紅心火龍果果皮干燥粉末每份1g，分別按照響應面實驗因素條件進行提取。3.2總甜菜紅素的含量測定參考JiangH等REF_Ref28905\r\h[9]的方法，按式（1），采用紫外-可見分光光度法，計算其總甜菜紅素含量（TotalBetacyaninsContent(TBC)）的相對含量。TBC=A538式中：MW=甜菜苷的摩爾質(zhì)量(550gmol?1)，V=樣品的體積(mL)，DF=稀釋倍數(shù)，ε=甜菜苷的摩爾消光系數(shù)(65,000Lmol?1cm?1),L=液層厚度(1cm),W=粗提物重量(g).3.3氧化損傷模型的建立取50尾斑馬魚，分為5組放入培養(yǎng)皿中，每組10尾斑馬魚于1L溶液，分別置于戊唑醇商業(yè)制劑濃度為0.0mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L。暴露48h后記錄每組的死亡個體數(shù)。3.3.1斑馬魚的運動行為學觀察取每組5尾斑馬魚，每尾分別放入培養(yǎng)皿中。將斑馬魚轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿后，待其適應培養(yǎng)皿環(huán)境2-3分鐘后，拍攝視屏長度為2min的動作捕捉畫面。使用ImageJ運動跟蹤軟件以每秒25幀的速度測量游泳活動，在預定義的場地內(nèi)捕捉游泳動作(一個場地對應一個孔洞，內(nèi)徑約為120毫米)REF_Ref7054\r\h[32]。對每個動畫文件設置檢測變量，以保證對所有幼魚的最佳檢測。隨后，使用ImageJ軟件對數(shù)據(jù)進行分析，并提供其移動距離和靜止時間，以表征每個個體的游泳活動。將得到結(jié)果對比，記錄實驗數(shù)據(jù)。3.3.2斑馬魚組織多巴胺含量測定將需要解剖的斑馬魚放入冰水混合物中20-30分鐘，觀察斑馬魚不再活躍游動。將麻醉后的魚置于泡沫板上，在斑馬魚眼部與尾部固定兩根針。從斑馬魚的腹鰭開始，用解剖剪將斑馬魚腹部劃開至頭部，再沿著脊椎剪至尾部，向下剪至排泄孔，挑開腹部皮膚，可以清晰觀察斑馬魚的內(nèi)臟結(jié)構，如下圖4。圖4斑馬魚的內(nèi)臟分布將表面皿清潔干凈后滴入幾滴生理鹽水，后內(nèi)臟團置于表面皿內(nèi)生理鹽水滴中，使用解剖針與鑷子將內(nèi)臟團分離，只取肝臟部分，將分離出的肝臟置于加入了生理鹽水的離心管中。再將斑馬魚的頭部剪下，使用眼科剪沿著脊椎向著斑馬魚兩眼之間剪開，暴露出腦組織，使用解剖針將腦組織從顱骨中分離，分離后將腦組織置于加入了生理鹽水的離心管中。將已放入肝組織或腦組織的離心管35攝氏度的恒溫水浴，保證組織活性，放置待用。從離心管中取出制得的斑馬魚腦組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研磨缽中，加入適量的人工腦脊液，在冰水浴下手動研磨5min使組織勻漿化。將勻漿液倒入1.5mL離心管中，2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液進行測定。取1mL上述步驟制得的腦組織上清液于燒杯中，再加入19mL的人工腦脊液，將溶液混合均勻，等待測定。使用CHI660E電化學工作站，采用飽和甘汞電極參比電極、鉑片對電極、制得的修飾碳纖維電極作為工作電極，使用差分脈沖伏安法(DPV)作為測定方法REF_Ref3029\r\h[33]，在起始電壓為?0.3，終止電壓為0.6V，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為0.2s，脈沖周期為0.5s的條件下測定，記錄峰高REF_Ref18871\r\h[34]。實驗最佳條件下，在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，調(diào)節(jié)掃描速率為10mv/s,從-0.4v—0.6v之間進行掃描，多巴胺的濃度在至1μg/L—3μg/L范圍內(nèi)與峰電流呈現(xiàn)良好的線性關系，以縱坐標為多巴胺濃度，橫坐標為峰電流大小建立多巴胺含量標準曲線，電流單位為A，濃度單位為μg/L。按下列公式計算（2）斑馬魚腦組織中多巴胺含量。斑馬魚腦組織中多巴胺含量=溶液中多巴胺濃度*20*103.3.3斑馬魚肝組織谷胱甘肽含量測定從離心管中取出制得的斑馬魚肝組織，用冰鹽水漂洗，吸水紙吸干，稱重記錄數(shù)據(jù)后放入研磨缽中，加入適量的勻漿遞質(zhì)，在冰水浴下手動研磨5min使組織勻漿化。將勻漿液倒入1.5mL離心管中，2500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清液進行測定。使用谷胱甘肽測定試劑盒進行斑馬魚肝臟組織谷胱甘肽測定，按照試劑盒說明書配置好需要的試液和標準品溶液（100μmol/LGSH）。于420nm處，1cm光徑，測定各管吸光度值，以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立標準曲線。按照試劑盒說明書配置好需要的試液，準備上述步驟制得的肝臟組織勻漿液，開始測定。首先取10%肝臟勻漿液上清液0.5mL，與試劑盒中試劑一應用液2mL混勻，3500-4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液1mL進行顯色反應。在測定管中加入1mL上述步驟制得的肝組織上清液，與試劑盒中試劑二1.25mL，試劑三0.25mL，試劑四0.05mL混合均勻。在空白管加入試劑盒中試劑一應用液1.0mL，試劑二1.25mL，試劑三0.25mL，試劑四0.05mL。靜置五分鐘顯色，使用紫外可見光光度計，在420nm處，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零比色后測量各管OD值，平行測量三次，記錄數(shù)據(jù)，所得OD值查標準曲線上所對應的濃度，并計算給藥組與正常組肝臟中谷胱甘肽含量比值。按照3.3.1方法測定模型組斑馬魚的運動軌跡及其軌跡參數(shù)后與正常組斑馬魚相比較，比較數(shù)據(jù)；按照3.3.2和3.3.3的方法測定模型組斑馬魚的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量進行比較，以上數(shù)據(jù)作為評價氧化應激模型建立成功與否的指標。確定氧化應激模型建立的給藥濃度后，以此濃度給藥，養(yǎng)殖96h，作為模型組備用。3.4甜菜紅素的氧化應激修復作用取0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L作為三組實驗組的給藥濃度，1%的DMSO為溶劑，給藥期為168h，每組1L，10尾斑馬魚。以1L1%DMSO養(yǎng)殖264h，10尾斑馬魚作為溶劑（DMSO）組。以1L蒸餾水養(yǎng)殖264h，10尾斑馬魚作為空白組。損傷96h后的實驗組繼續(xù)給予1%DMSO養(yǎng)殖168h，作為模型組。按照3.3.2方法測定實驗組、空白組、溶劑組和模型組斑馬魚的運動軌跡及其軌跡參數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。按照3.3.2和3.3.3的方法測定實驗組、空白組、溶劑組和模型組斑馬魚的谷胱甘肽含量及其多巴胺含量，記錄數(shù)據(jù)，作為判斷甜菜紅素氧化應激修復作用的指標。4結(jié)果與討論4.1響應面分析法優(yōu)化甜菜紅素的提取4.1.1響應面試驗結(jié)果及分析在單因素的基礎上，采用響應面方案進一步試驗。結(jié)果見表3。表3響應面試驗方案及結(jié)果編號No.A乙醇濃度/（%）B溫度/（°C）C料液比/（0.01mL·g-1）D提取時間/（min）TBC(mg/100g)140300.125604.94260300.1256010.7340500.125602.86460500.125604.52550400.05305.87650400.2309.48750400.059011.5850400.29012.5940400.125303.871060400.125307.281140400.125907.591260400.1259011.71350300.05609.531450500.05605.261550300.26011.51650500.2605.861740400.05606.341860400.056010.71940400.2608.512060400.26012.32150300.125304.232250500.125303.032350300.1259010.02450500.125904.552550400.1256011.32650400.1256012.42750400.1256012.02850400.1256012.42950400.1256011.34.1.2響應面數(shù)學模型的建立與顯著性檢驗用DesignExpert8.0.6分析軟件建立方程：Y=11.94+1.94×A-2.08×B+0.9194×C+2.02×D-1.04×AB-0.1469×AC+0.1780×AD-0.3559×BC-1.07×BD-0.6444×CD-2.24×A2-4.03×B2+0.0216×C2-2.20×D2,模型的回歸系數(shù)顯著性檢驗及結(jié)果見圖7。由模型的“P值”＜0.0001可知該回歸方程模型達到了極顯著的水平，可靠性較高；決定系數(shù)R2=98.71%；注：R2=0.9871,RAdj2圖5模型回歸系數(shù)顯著性檢驗及結(jié)果4.1.3單因素交互作用由DesignExpert8.0.6分析軟件得到最佳提取為乙醇濃度55%，溫度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取時間69min，甜菜紅素的理論含量為12.8mg/100g。反應面更陡峭，意味著各個因素之間的相互影響更大，各因子相互作用等高線和曲面圖在圖6-11中顯示。A:乙醇濃度B：溫度圖6乙醇濃度和提取溫度對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖6知，乙醇濃度一定時，甜菜紅素含量隨著提取溫度的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說明乙醇濃度（A）和溫度（B）之間交互作用較強。A：乙醇濃度C：料液比圖7乙醇濃度和料液比對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖7知，乙醇濃度一定時，甜菜紅素含量隨著料液比的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面較為平淡，表面乙醇濃度（A）和料液比（C）之間的交互作用較弱。A:乙醇濃度D：提取時間圖8乙醇濃度和提取時間對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖8知，乙醇濃度一定時，甜菜紅素含量隨著提取時間的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說明乙醇濃度（A）和提取時間（D）之間交互作用較強。B：提取溫度C：料液比圖9提取溫度和料液比對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖9知，提取溫度一定時，甜菜紅素含量隨著料液比的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說明提取溫度（B）和料液比（C）之間交互作用較強。B：提取溫度D：提取時間圖10提取溫度和提取時間對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖10知，提取溫度一定時，甜菜紅素含量隨著提取時間的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面陡峭、等高線偏向橢圓，說明提取溫度（B）和提取時間（D）之間交互作用較強。C：料液比D：提取時間圖11液料比和提取時間對甜菜紅素含量的等高線及曲面圖由圖11知，料液比一定時，甜菜紅素含量隨著提取時間的增加而增加，達到最大值后逐漸下降。且曲面較為平淡，表面料液比（C）和提取時間（D）之間的交互作用較弱。4.2氧化應激模型的建立如表4所示，當戊唑醇濃度為0.5mg/L死亡個體為0，致死率為0%，故使用0.5mg/L的戊唑醇作為我們的安全劑量組。表4戊唑醇給藥濃度及其致死率戊唑醇濃度（mg.L）死亡數(shù)（尾）致死率（%）0.0000.5000.74401.07702.010100空白組、模型組斑馬魚2min內(nèi)運動軌跡捕捉如圖12所示。由運動軌跡可明顯看出，在建模后斑馬魚自發(fā)行為軌跡明顯混亂，產(chǎn)生明顯行為增強。模型組的斑馬魚更喜愛想中央?yún)^(qū)域游動，活躍性較高；而空白組則相對安靜，活躍性較低。從行為參數(shù)上分析，模型組靜止時間為最短，即其運動最為活躍；空白組則相較靜止時間長，即其運動更為安靜。靜止時間對比，空白組與模型組差異較顯著，說明氧化應激模型建立成功。從移動距離上分析可知，模型組移動距離較長，處于活躍狀態(tài)，與空白組相比，移動距離差異較顯著。結(jié)果表明，模型組行為學上表現(xiàn)為明顯行為增強。注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著A:空白組與模型組運動軌跡B：2min內(nèi)運動距離對比及顯著性差異C：2min內(nèi)靜止時間對比及顯著性差異圖122min內(nèi)斑馬魚自發(fā)行為運動對比多巴胺含量標準曲線：多巴胺的濃度在至1μg/L-3μg/L范圍內(nèi)與峰電流呈現(xiàn)良好的線性關系(如圖13)，回歸方程為：，縱坐標為多巴胺濃度，橫坐標為峰電流大小。電流單位為A，濃度單位為μg/L，相關系數(shù)r=0.9957。圖13多巴胺含量標準曲線圖將空白組與模型組斑馬魚解剖后，將腦組織按照“3.3.3斑馬魚腦組織多巴胺含量測定”方法檢測，結(jié)果如表5和圖14。對比可看出模型組多巴胺含量有較顯著上升，說明建模后斑馬魚有神經(jīng)損傷，氧化應激模型建立成功。表5不同組魚的多巴胺峰電流與含量斑馬魚腦組織質(zhì)量（mg）平均峰電流（10-6A）溶液中多巴胺濃度（μg/L）斑馬魚組織多巴胺含量（ng/g）空白組10.62.0282.0684595模型組10.32.3892.5315624注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著圖14模型組與空白組多巴胺含量對比圖谷胱甘肽含量標準曲線：如圖16所示，谷胱甘肽標準曲線方程為y=0.0038-0.0021，r=0.9987，擬合程度較好。空白組與模型組肝組織中GSH含量如圖15所示，可明顯看出模型組斑馬魚肝組織內(nèi)GSH含量明顯下降，說明建模后斑馬魚肝臟存在明顯氧化應激損傷，該模型可應用于后續(xù)實驗。A:GSH含量標準曲線圖B:GSH含量對比圖圖15GSH含量圖4.3甜菜紅素的氧化應激修復作用空白組、溶劑（DMSO）組、實驗組、模型組組斑馬魚2min內(nèi)運動軌跡捕捉如圖16,17所示。模型組的斑馬魚更喜愛想中央?yún)^(qū)域游動，活躍性較高；而實驗組則相對安靜，活躍性較低。由圖中可知，模型組運動距離最長，且其運動距離顯著高于空白組，說明其有明顯行為增強，實驗組運動距離與空白組無明顯差距，說明甜菜紅素對斑馬魚氧化應激造成的行為增強有明顯修復作用。模型組靜止時間為最短，即其運動最為活躍，且模型組靜止時間與空白組相比顯著降低；實驗組靜止時間最長，即其運動最為安靜，且其靜止時間與空白組相比無明顯差異，說明甜菜紅素對氧化應激有明顯修復作用。結(jié)果表明，正常組的斑馬魚活動規(guī)律正常，勻速平緩在觀察孔中游動，戊唑醇導致斑馬魚行為增強，給予甜菜紅素則會使斑馬魚有所恢復。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無明顯差異，可以認為溶劑毒性不會影響實驗結(jié)果。A:空白組B:模型組C:溶劑（DMSO）組D：0.05g/L組E:0.1g/L組F:0.2g/L組圖162min內(nèi)斑馬魚運動軌跡注：*與空白組相比，p＜0.05;**與空白組相比，p<0.01；***與空白組相比，p<0.001；ns與空白組相比，p>0.05A:斑馬魚運動距離對比B:斑馬魚靜止時間對比圖172min內(nèi)斑馬魚自發(fā)行為運動數(shù)據(jù)對比將空白組、模型組和溶劑（DMSO）組和實驗組（0.05g/L）斑馬魚解剖后，將腦組織按照“3.3.2斑馬魚腦組織多巴胺含量測定”方法檢測，結(jié)果如圖18。由數(shù)據(jù)可知，三組實驗組組給藥后多巴胺濃度均恢復至正常水平，說明給藥可以緩解其氧化應激所導致的神經(jīng)毒性作用。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無明顯差異，可以認為溶劑毒性不會影響實驗結(jié)果。圖18空白組、模型組和溶劑（DMSO）組和實驗組多巴胺含量對比圖給予0.2g/L、0.1g/L、0.05g/L甜菜紅素濃縮物養(yǎng)殖后的斑馬魚、空白組、溶劑（DMSO）組和毒性組肝臟中GSH含量如圖19所示，模型組相較于空白組GSH含量顯著下降，給藥后明顯恢復，且劑量越高恢復作用越好。0.2g/L劑量組與正常組之間不存在顯著差異，可以認為基本上恢復到正常水準。說明甜菜紅素給藥后可以起到明顯的氧化應激修復作用。另外，溶劑（DMSO）組與正常組無明顯差異，可以認為溶劑毒性不會影響實驗結(jié)果。圖19斑馬魚GSH含量對比及顯著性檢測注：*與空白組相比，p＜0.05，差異較顯著;**與空白組相比，差異顯著；p<0.01，差異高度顯著；***與空白組相比，p<0.001，差異極顯著5結(jié)論采用響應面法得到最佳提取為乙醇濃度55%，溫度37℃，料液比1：7.6g/mL，提取時間69min，此條件下甜菜紅素的平均含量為12.8mg/100g。模型組斑馬魚自發(fā)行為更為頻繁，其運動參數(shù)皆高于空白組，呈差異顯著，說明戊唑醇可造成斑馬魚行為增強，氧化應激模型建立成功。模型組多巴胺含量相較于空白組增加，說明戊唑醇有神經(jīng)毒性作用。模型組斑馬魚谷胱甘肽含量明顯低于正常組，模型組與空白組GSH含量存在顯著性差異，說明以戊唑醇喂養(yǎng)斑馬魚建立氧化應激模型效果好。模型組斑馬魚肝組織GSH含量顯著低于空白組，實驗組GSH含量與空白組無顯著性差異；斑馬魚腦組織中模型組的多巴胺含量略高于空白組，實驗組給藥后皆恢復到與空白組無顯著差異；模型組斑馬魚自發(fā)運動靜止時間顯著低于其他組，自發(fā)運動距離顯著高于其他組，實驗組皆與空白組無顯著性差異，說明紅心火龍果果皮甜菜紅素對氧化損傷有修復作用，且0.2g/L為紅心火龍果果皮甜菜紅素最有效劑量。參考文獻CelliGB,BrooksMS.Impactofextractionandprocessingconditionsonbetalainsandcomparisonofpropertieswithanthocyanins-Acurrentreview[J].FoodResearchInternational,2017,100:501-509.Rodriguez-AmayaDB.Updateonnaturalfoodpigments-Amini-reviewoncarotenoids,anthocyanins,andbetalains[J].FoodResearchInternational,2019,124:200-205.AzeredoHMC.Betalains:properties,sources,applications,andstability-Areview[J].InternationalJournalofFoodScienceandTechnology,2009,44:2365-2376.琚常鑫.紅心火龍果甜菜紅素對楊梅花色苷的穩(wěn)定性評價及相互作用研究[D].杭州:浙江大學,2022.劉琪龍.甜菜紅素對酒精性肝損傷保護作用及其咀嚼片的研制[D].烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學.2020.XIYUY,YANQ,MANZ,etal.Developmentofactiveandsmartpackagingfilmsbasedonstarch,polyvinylalcoholandbetacyaninsfromdifferentplantsources[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2021,183:358-368.陳冠林．紅肉火龍果色素提取、純化及其抗氧化、降血脂作用的研究[D]．廣州:廣東藥科大學,2013．呂亞文,朱文嫻,廖紅梅.火龍果來源甜菜紅素的研究及應用進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè):1-11.JiangH,ZhangW,LiX,etal.Nutrition,phytochemicalprofile,bioactivitiesandapplicationsinfoodindustryofpitaya(Hylocereusspp.)peels:Acomprehensivereview[J].TrendsinFoodScience&Technology,2021,116:199-217朱文嫻,夏必幫,廖紅梅,等.四種紅肉火龍果品種制汁適宜性評價研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2020,46:167-173．HERBACHKM,ROHEM,STINTZINGFC,etal.Structuralandchromaticstabilityofpurplepitaya(Hylocereuspolyrhizus[Weber]Britton&Rose)betacyaninsasaffectedbythejuicematrixandselectedadditives[J].FoodResearchInternational,2006,39:667-677.StintzingFC,SchieberA,CarleR.Betacyaninsinfruitsfromred-purplepitaya,Hylocereuspolyrhizus(Weber)Britton&Rose[J].FoodChemistry,2002,77:101-106.JalgaonkarK,MahawarMK,BibweB,etal.Postharvestprofile,processingandwasteutilizationofdragonfruit(HylocereusSpp.):Areview[J].FoodReviewsInternational,2020:1-27.FerreiraVC,AmpeseLC,SganzerlaWG,etal.Anupdatedreviewofrecentapplicationsandfutureperspectivesonthesustainablevalorizationofpitaya(Hylocereusspp.)by-products[J].SustainableChemistryandPharmacy,2023,33,101070:1-18.葉青青,袁鳳梅,袁際學等.高原有氧訓練對機體還原型谷胱甘肽水平的影響及機制[C].第十二屆全國體育科學大會.中國山東日照.2022-03-25.施偉麗,袁蓉,信琪琪等.氧化應激與高血壓[J].醫(yī)學綜述,2018,24:642-650.張維,王紅芳,胥保華.生物衰老的主要分子機制概述[J].生物技術進展,2023,13:228-233.楊麗嬪,朱珍珠,雷紅等.花青素對神經(jīng)退行性疾病保護作用的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng),2021,27:40-45.陳渝春,馮蘭超