基于數(shù)字液滴PCR技術建立細胞治療產(chǎn)品中支原體污染的快速檢查法

[21]對比了ddPCR和針對宏基因組的下一代測序技術（mNGS）在臨床上對疑似敗血癥或膿毒血癥患者的診斷。在60例樣本中，ddPCR和mNGS均顯示出比血培養(yǎng)更好的靈敏度和基本一致的定性診斷結(jié)果。頭對頭的比較顯示，ddPCR在其檢測范圍內(nèi)比mNGS更快速、更靈敏，并且能夠特異性檢測抗生素耐藥基因；而mNGS能檢測到的病原體種類更多。該研究認為，ddPCR方法更適用于快速檢測常見的分離病原體以及抗生素耐藥基因篩查，而mNGS檢測更適用于經(jīng)典微生物學方法或分子診斷方法無法確定致病病原體時的診斷。研究意義通過建立支原體的ddPCR快速檢查法，為外源因子污染快速檢測方法在細胞治療產(chǎn)品中的應用做出示范，對細胞治療產(chǎn)品的整體質(zhì)量和安全評價思路和方法提供范例。如果在細胞治療產(chǎn)品放行檢驗的支原體、分枝桿菌、內(nèi)外源病毒因子等檢查項中使用基于NAT的快速檢驗方法補充或替代傳統(tǒng)檢驗方法，將會極大縮短檢驗用時，提高放行效率，更好地滿足患者的用藥需求。材料與方法儀器與分析軟件本研究使用的儀器設備(表1)表1本研究使用的儀器儀器設備生產(chǎn)公司Eppendorf5425R型冷凍離心機德國Eppendorf股份有限公司Eppendorf5810R型離心機德國Eppendorf股份有限公司賽默飛KINGFISHERFLEX全自動核酸提取儀賽默飛世爾科技有限公司AppliedBiosystemsQuantStudio7Pro熒光定量基因擴增儀賽默飛世爾科技有限公司SLAN-96S熒光定量基因擴增儀上海宏石醫(yī)療科技股份有限公司AppliedBiosystemsProflex基因擴增儀賽默飛世爾科技有限公司BIO-RADQX200微滴數(shù)字分析儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司BIO-RADQX200微滴生成儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司BIO-RADT100TM基因擴增儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司BIO-RADPX1TM封膜儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司IKALABDANCERS000微型渦旋混合儀IKA(廣州)儀器設備有限公司IKAMINIGS000微型離心機IKA(廣州)儀器設備有限公司賽默飛1300系列A2生物安全柜賽默飛世爾科技有限公司本研究使用的數(shù)據(jù)采集與分析軟件為BindlxSoftwareforKingFisherTMApex、QuanStudioDesignandAnalysisd、QXManagerSoftware2.0StandardEdition、試劑主要試劑與耗材表2主要試劑與耗材試劑耗材購買公司貨號ATCC243培養(yǎng)基山東拓普生物工程有限公司MD107BATCC988培養(yǎng)基山東拓普生物工程有限公司MD089B支原體肉湯培養(yǎng)基青海高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司HB7025-2精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基青海高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司HB7025-5胎牛血清生工生物工程(上海)股份有限公司E51008-0500馬血清生工生物工程(上海)股份有限公司E500007-0400滅菌雙蒸水生工生物工程(上海)股份有限公司B541017-0010DEPC處理水生工生物工程(上海)股份有限公司B501005-0500無水乙醇默克股份兩合公司E7023湖州申科支原體DNA檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)湖州申科生物技術有限公司1509841賽默飛MagMAXTMDNAMulti-SampleUltra2.0Kit核酸提取試劑盒賽默飛世爾科技有限公司A36570TE緩沖液賽默飛世爾科技有限公司12090015BIO-RAD鋁箔伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司1814040BIO-RADDG8微滴生成卡伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司1864008BIO-RADPCR液滴生成油伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司186300596孔PCR板德國Eppendorf股份有限公司K199351Q引物與探針表3引物及探針序列引物名稱核酸序列(5,-3,)對應支原體引物Myco16SQf1GCAAAGCTATAGAGATATAGTAGAGGTMycoplasmaorale*,M.mycoidesM.capricolum,Myco16SQf2GCRAAGCTATAGARATATAGTGGAGGTM.arthritidis*,M.gallisepticum*,M.hominis*,M.hyorhinis*,M.penetrans,M.pirum,M.salivarium*,M.synoviaeMyco16SQf3GCAATGCTATAGAGATATAGCGGAGGTM.arginini*Myco16SQf4GCAAAGCTATGGAGACATAGTGGAGGTM.fermentans*Myco16SQf5GCAAAGTTATGGAAACATAATGGAGGTM.pneumoniae*,M.genitalium*Myco16SQf6GCGACGCTATAGAAATATAGTTGAGGTUreaplasmaurealyticum*,U.parvumMyco16SQf7GCAAAGGCTTAGAAATAAGTTCGGAGGCAcholplasmalaidlawii*Myco16sQRGTTGCGYTCGTTGCRGGACallMollicutes探針Myco16sQProbeFAM-TGGTGCATGGTTGTC-MGBallMollicutes主要溶液配制ATCC243培養(yǎng)基:稱取16.25gATCC243培養(yǎng)基粉末于400mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，冷至55℃以下，無菌操作沿瓶壁緩慢加入熱激活(56℃處理30分鐘)后的馬血清100mL,混勻后分裝無菌試管，4℃保存。ATCC988培養(yǎng)基:稱取18.4gATCC988培養(yǎng)基粉末于390mL蒸餾水中,加熱溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，冷至50℃以下，無菌操作加入于55℃滅活1小時的胎牛血清85mL，混勻后分裝無菌試管，4℃保存。支原體肉湯培養(yǎng)基:稱取13.76g支原體肉湯培養(yǎng)基粉末于400mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，冷至室溫，無菌操作加入滅活胎牛血清100mL，混勻后分裝無菌試管，4℃保存。精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基:稱取12.76g精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基粉末于400mL蒸餾水中，加熱溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，冷至室溫，無菌操作加入滅活胎牛血清100mL，混勻后分裝無菌試管，4℃保存。80％乙醇溶液:取160mL無水乙醇,加入40mLDEPC處理水,混勻后常溫保存，備用。供試品人基因組DNA(細胞種屬bb樣本)、Hela細胞、HV-101注射液、ATCC243培養(yǎng)基、ATCC988培養(yǎng)基、支原體肉湯培養(yǎng)基、精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基操作方法DNA提取使用賽默飛世爾科技有限公司的MagMAXTMDNAMulti-SampleUltra2.0kit試劑盒，在KingFisherFlex96自動核酸提取儀上操作提取供試品基因組，洗脫體積50μL，具體操作如下:在核酸提取儀電腦上導入程序MagMAX-Ultra2-200μLV2-Flex.bd2，具體提取步驟如下表4所示表4DNA提取步驟步驟反應條件試劑位置消化65℃混合20分鐘200μL樣品+20μL蛋白酶K+20μL增強液樣品板磁珠結(jié)合混勻5分鐘20μL磁珠+200μL結(jié)合液樣品板洗滌1快速混合2分鐘500μL洗滌液1洗滌板1洗滌2-1快速混合2分鐘500μL洗滌液2洗滌板2-1洗滌2-2快速混合2分鐘500μL洗滌液2洗滌板2-2洗脫2分鐘50μL洗脫液洗脫板取人基因組DNA(細胞種屬bb樣本)、Hela細胞、HV-101注射液、ATCC243培養(yǎng)基、ATCC988培養(yǎng)基、支原體肉湯培養(yǎng)基、精氨酸肉湯培養(yǎng)基其中干擾樣本,其中人基因組DNA10μL、細胞樣本20μL、注射液樣本20μL，用TE水補足體積至200μL，培養(yǎng)基樣本取200μL。每個供試品平行提取兩份，其中一份加入稀釋至10-2濃度的口腔支原體陽性參考品，另用200μLTE水做空白對照。將上述樣本轉(zhuǎn)移至96孔深孔板中，每孔一個樣本；另外準備4塊深孔板，依次標記為洗滌1、洗滌2-1、洗滌2-2、洗脫板，在與樣本板對應的位置，分別加入500μL洗滌液1、500μL洗滌液2、500μL洗滌液2、50μL洗脫液。向每個樣本中加入20μL蛋白酶K、20μL增強液。打開儀器和電腦，在電腦上啟動BindlxSoftwareforKingFisherTMApex軟件，運行程序文件。按提示依次將加好樣本和溶液的深孔板放到儀器對應位置。加入20μL磁珠mix、200μL結(jié)合液經(jīng)過核酸提取儀提取后，每份供試品獲得各50μL洗脫液。深孔板用封板膜密封，或?qū)⑾疵撘恨D(zhuǎn)移到干凈的離心管中，-20℃保存ddPCR法PCR體系配制配制PCR反應將引物和探針用TE緩沖液復溶，稀釋至100μmol/L(例如：標示量為5nmoles/管時，每管加入50μLTE水)，內(nèi)標用TE復溶至100ng/μL長期貯存，稀釋至10pg/μL用于配制mix。按下表5配制引物探針mix表5ddPCR引物探針mix名稱體積μL終濃度μmol/LMyco16sQF1410Myco16sQF2410Myco16sQF3410Myco16sQF4410Myco16sQF5410Myco16sQF6410Myco16sQF7410Myco16sQR820Myco16sQProbe1.64TE緩沖液2.4/總體積40/在PCR反應管或96孔PCR板中按下表6配制反應液表6ddPCR反應液組分每個反應所需體積（μL）終濃度或終含量2xddPCRSupermix101x引物探針mix10.4umol/L(正向引物)樣本5最多66ng水4終體積20制備微滴將一個新的DG8卡槽（DG8cartridge）放入固定器（cartridgeholder）中，注意缺口方向。將固定器兩側(cè)向內(nèi)推，卡緊卡槽。將反應體系逐個加入卡槽中間一排的孔內(nèi)，樣品數(shù)量不足8個孔時，剩余的孔用空白緩沖液補足。加樣時避免產(chǎn)生氣泡。在卡槽最底下一排8個孔中各加入70μL微滴生成油（DGOil），同樣不能有空的孔。蓋上橡膠墊片（gasket），將兩邊的4個小孔掛在固定器的4個透明鉤子上。接通半自動微滴生成裝置電源，按綠色艙門上的開關打開艙門，將固定器放入微滴生成裝置，關閉艙門。儀器自動開始生成微滴。當三個指示燈都變?yōu)榫G色常亮時，表明運行結(jié)束，可以打開艙門，取出卡槽固定器。生成的微滴位于卡槽最上一排的孔內(nèi)。除去墊片，使用移液槍小心吸取含微滴的油層（約40μL），再緩慢注入96孔PCR板的反應孔中。完成后，使用封膜儀封膜。封膜提前5分鐘打開儀器預熱，設置運行程序（推薦的參數(shù)：180℃，5s）。取一張鋁箔封口膜，印有紅線的一面朝上蓋于96孔PCR板上。將蓋上封口膜的96孔PCR板放在底座上，然后用金屬支架壓住，防止封口膜移位。按觸屏上的Seal鍵開始自動封膜。運行結(jié)束后，托盤自動推出，待降溫后取下96孔PCR板。擴增在任意一臺普通PCR儀上運行PCR反應，反應體積應設為40μl，變溫速率為每秒2.0℃,PCR程序設定見表7。表7ddPCR程序步驟溫度時間預變性95℃10min變性95℃15s退火+延伸58℃60s酶滅活98℃10min循環(huán)數(shù)40讀取微滴提前30分鐘打開微滴分析儀電源，預熱儀器。將擴增完畢的96孔PCR板放入微孔板夾（plateholder）的底座中，注意板上A1孔的位置應與板夾一致。然后將板夾上蓋對準底座蓋好，壓下把手，即組裝好。接通分析儀電源，按綠色艙門上的開關打開艙門，將組裝好的板夾放入微滴分析儀，關閉艙門。在電腦上打開QXmanager軟件，設置分析參數(shù)，然后開始運行。微滴讀取完畢后，四個指示燈均顯示綠色。打開艙門，取出板夾，丟棄96孔PCR板。實驗有效性和結(jié)果判定同時滿足下列條件，實驗成立。所有孔讀取的液滴數(shù)在8000個以上，陽性液滴數(shù)在3個以上結(jié)果判斷為陽性，三個以下結(jié)果判斷為陰性。(2)空白對照的結(jié)果應為陰性。條件優(yōu)化引物濃度取口腔支原體供試品，濃度稀釋至10-2，退火溫度為60℃，試驗條件為每個反應中加樣量分別調(diào)整為1μL、1.5μL、2μL；通過觀察陽性信號強度以及陽性液滴和陰性液滴的分離度選擇本次實驗的引物濃度。退火溫度取口腔支原體陽性參考品，濃度稀釋至10-2，引物濃度選擇1μL，在PCR儀上設置退火溫度56℃、58℃、60℃、62℃、64℃；通過觀察陽性液滴和陰性液滴的分離度選擇本實驗的退火溫度。方法學驗證專屬性取2.4.1.1獲得的洗脫液、稀釋至10-2的口腔支原體陽性參考品、滅菌雙蒸水共，按上述ddPCR操作方法進行實驗。供試品、空白對照結(jié)果應為陰性，加標對照及陽性參考品結(jié)果應為陽性。檢測限取MO陽性參考品，稀釋至10-5、10-6，每個濃度各做8個反應，連續(xù)三個實驗天重復操作，按上述ddPCR操作方法進行實驗。耐用性在AppliedBiosystemsProflex基因擴增儀上重復專屬性和檢測限實驗。CCU50法復蘇肺炎支原體(ATCC15531)的復蘇在ATCC988培養(yǎng)基中加入額外5%滅活FBS。打開安瓿瓶。準備T口試管裝2.5mLATCC988培養(yǎng)基，并吸取1mL加入安瓿瓶中溶解支原體。將液體吸回試管，吹打混勻，注意無菌操作。準備總共30個EP管，在每個試管中準備0.25mL肉湯，做倍比稀釋。吸取0.25mL原液加入第一管中，吹打混勻20次后吸取0.25mL加入第二管，重復一次稀釋到第三管結(jié)束，每組共稀釋三次，總共10組。用一管未接種的肉湯試管作為control。完成后放入培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)口腔支原體(ATCC23714)的復蘇。打開安瓿瓶。準備試管裝2.25mLATCC243培養(yǎng)基，并吸取1mL加入瓶中溶解支原體。將液體吸回試管，吹打混勻，注意無菌操作。準備總共27個EP管，在每個試管中準備0.25mLATCC243培養(yǎng)基，做倍比稀釋。吸取0.25mL原液加入第一管中，吹打混勻20次后吸取0.25mL加入第二管，重復一次稀釋到第三管結(jié)束，每組共稀釋三次，總共10組。用一管未接種的肉湯試管作為control。完成后放入培養(yǎng)箱中37℃，無氧環(huán)境中培養(yǎng)。接種取2.5.1中復蘇的肺炎支原體以及口腔支原體，連續(xù)三個實驗天在兩塊48孔板中，取20μL復蘇后的支原體加入第一列。然后在第2-11列中做10倍系列稀釋，稀釋至10的-11次方，第12列為陰性對照。平行做8個重復。使用無菌槍頭吹打混勻。5％CO2、37℃培養(yǎng)2周，觀察顏色變化。計算用下式計算CCU50：log上式中，X0為5個重復全部變色的最低稀釋度的log10對數(shù)；d是稀釋比的log10對數(shù)（此處d=1）；ni是稀釋度的孔數(shù)，ri是每個稀釋級的陽性孔數(shù)；E(ri/ni)是從5個孔全陽性的最低稀釋度開始向高數(shù)，所有出現(xiàn)陽性孔的稀釋級的陽性比例之和。qPCR法操作使用2.4.1.1中方法提取供試品DNA，按下表8在0.2mLPCR管中配置反應，其中陽性質(zhì)控(PC)隨支原體DNA檢測試劑盒提供，標示濃度為1000copies/μL，無模板對照(NTC)為DNA稀釋液，隨支原體DNA檢測試劑盒提供，內(nèi)標(IC)隨支原體DNA檢測試劑盒提供。表8qPCR反應液試劑供試品PCNTCMyqPCRReactionBuffer（μL）888MyPrimer&ProbeMix（μL）1.51.51.5DNA稀釋液（μL）0.5020IC（μL）00.50.5樣品DNA（μL）2000陽性對照（μL）0200總體積（μL）303030加樣完畢后蓋好蓋子，短暫離心，渦旋混勻，短暫離心，上機。qPCR參數(shù)設置如下：支原體檢測探針報告熒光基團為FAM，淬滅熒光基團為none；內(nèi)標探針報告熒光基團為VIC，淬滅熒光基團為none；檢測參比熒光為ROX；PCR程序：95℃預變性10min；95℃15s，62℃30s，72℃1min30s，50個循環(huán)；反應體積30μL。實驗有效性同時滿足下列3點，實驗成立：1.所有孔的內(nèi)標探針（VIC）Cq值均應小于40且有典型的擴增曲線；2.PCS的支原體檢測探針（FAM）Cq值應小于40且有典型的擴增曲線；3.NTC的支原體檢測探針（FAM）Cq值應大于或等于40，或擴增曲線不典型；結(jié)果判定： 供試品支原體檢測(FAM)探針Cq值小于40且有典型的擴增曲線，結(jié)果為陽性；Cq值大于等于40、未擴增或擴增曲線不典型，結(jié)果為陰性。方法學驗證專屬性取干擾樣品的核酸提取液、無模板對照、陽性質(zhì)控、內(nèi)標,按上述操作方法在AppliedBiosystemsQuantStudio7Pro熒光定量基因擴增儀進行實驗。檢測限取湖州申科試劑盒支原體陽性對照(標示濃度1000copies/μL，體積50μL)，稀釋至10copies/μL、1copies/μL，不提取DNA直接取樣進行PCR實驗，平行做8個復孔。按2.6.1操作方法在AppliedBiosystemsQuantStudio7Pro熒光定量基因擴增儀進行實驗。耐用性在宏石SLAN-96S熒光定量基因擴增儀進行專屬性實驗。結(jié)果與討論ddPCR法條件優(yōu)化經(jīng)過對比(表9、圖1),本次實驗中退火溫度對定量結(jié)果無顯著影響，退火溫度越低，陰陽性液滴分離度越好。退火溫度決定了引物和探針在模板序列上結(jié)合的牢固程度，溫度越低結(jié)合越牢固，但溫度太低，堿基不完全匹配的序列也會結(jié)合上，可能會有假陽性的情況出現(xiàn)，因此選擇58℃為本次實驗的退火溫度。圖1條件優(yōu)化退火溫度實驗結(jié)果注:A06、C06、D06、E06、F06分別為64℃、62℃、60℃、58℃、56℃退火溫度的結(jié)果；D07為空白對照結(jié)果。表9退火溫度實驗結(jié)果退火溫度合格液滴總數(shù)陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陰陽性判斷64℃16287551110776陽性62℃1453050689462陽性60℃18350667211678陽性58℃14037514411858陽性56℃15801578610015陽性本次實驗選用2μL、1.5μL、1μL三個引物濃度做比較，經(jīng)過對比(表10、圖2)，2μL引物的實驗結(jié)果陽性信號強度高，但分離度不好；1μL引物的實驗結(jié)果的分離度和陽性信號強度均符合預期，因此選擇1μL引物作為本次實驗的引物用量。圖2條件優(yōu)化引物濃度結(jié)果注：B06為2μL引物加樣量；C06為1.5μL引物加樣量；D06為1μL引物加樣量；G06為空白表10引物濃度實驗結(jié)果引物用量合格液滴總數(shù)陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陰陽性判斷2μL87797963816陽性1.5μL979771642633陽性1μL1037691631213陽性方法學驗證專屬性專屬性結(jié)果顯示(表11)，只有加了陽性對照的供試品以及陽性對照檢測結(jié)果為陽性，未加標的供試品及空白對照結(jié)果均為陰性，說明該方法具有良好的專屬性。表11方法學驗證專屬性實驗結(jié)果供試品是否加標合格液滴數(shù)陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陰陽性判斷人基因組DNA性Hela細胞否20489020489陰性HV-101注射液否19871019871陰性ATCC243培養(yǎng)基否10048010048陰性ATCC988培養(yǎng)基否12841012841陰性支原體肉湯培養(yǎng)基性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基否12204212202陰性提取陰性對照否19606019609陰性人基因組DNA是2043844619992陽性Hela細胞是18607147317134陽性HV-101注射液是20980211618864陽性ATCC243培養(yǎng)基是18130173716393陽性ATCC988培養(yǎng)基是17255120416051陽性支原體肉湯培養(yǎng)基是17590142216168陽性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基是19247160617641陽性提取陽性對照是202581021210046陽性空白對照性檢測限將口腔支原體陽性參考品提取DNA按10倍系列稀釋到107后按上述ddPCR操作進行實驗，QXmanager自動計算濃度。結(jié)果見表12。表12方法學驗證稀釋倍數(shù)結(jié)果稀釋倍數(shù)合格液滴數(shù)陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陰陽性判斷上樣陽性濃度(copies/μL)101880018459341陽性4717.331021702782238804陽性775.9910317305104515990陽性74.481041878312418659陽性7.79105197441219732陽性0.7210617825117824陰性0.0710719518219516陰性0.12空性/圖3方法學驗證稀釋倍數(shù)結(jié)果注：A06-H06分別為稀釋倍數(shù)101-107的結(jié)果；G06為空白對照將表12中稀釋度取對數(shù)，濃度取對數(shù)得下表13。表13稀釋度對數(shù)濃度對數(shù)表序號稀釋度對數(shù)濃度(copies/μL)濃度對數(shù)陰陽性稀釋前陽性參考品濃度值(copies/μL)1-47173.67366+/2-27762.889862+7.8*1043-374.51.872156+7.4*1044-47.790.891537+7.8*1045-50.715-0.14569+7.2*1046-60.066-1.18046-/7-70.0628-1.20204-/由于第6、第7個數(shù)據(jù)點的陽性液滴數(shù)不超過3個，為陰性，軟件自動從陽性液滴比例計算的定量結(jié)果無實際意義，因此剔除第6、7個數(shù)據(jù)點后計算決定系數(shù)和平均濃度。經(jīng)過計算陽性對照品稀釋前的平均濃度為7.6*104copies/μL。結(jié)合上表,選擇稀釋倍數(shù)為105、106兩個濃度做檢測限實驗,在三個不同實驗天重復實驗，每個濃度平行測定8次，結(jié)果如下：圖4方法學驗證檢測限結(jié)果1注：A06-H06為稀釋倍數(shù)105結(jié)果；A07-H07為稀釋倍數(shù)106結(jié)果；A08為空白對照圖5方法學驗證檢測限結(jié)果2注：A06-H06為稀釋倍數(shù)105結(jié)果；A07-H07為稀釋倍數(shù)106結(jié)果；A08為空白對照圖6方法學驗證檢測限結(jié)果3注：A06-H06為稀釋倍數(shù)105結(jié)果；A07-H07為稀釋倍數(shù)106結(jié)果；A08為空白對照表14方法學驗證檢測限結(jié)果1參考品稀釋倍數(shù)合格液滴總數(shù)陽性液滴數(shù)陰形液滴數(shù)陰陽性判斷陽性比例10517869417865陽性24/2419525419521陽性19903619897陽性192361319223陽性204961120485陽性203041220292陽性19952519947陽性198051319792陽性181051618089陽性187741218762陽性196681519653陽性208802020860陽性198521519837陽性208312020811陽性20348920339陽性209571120946陽性201121620096陽性210961521081陽性200961520081陽性201501620134陽性212621221250陽性空性空性空白12973012973陰性表15方法學驗證檢測限結(jié)果2參考品稀釋倍數(shù)合格液滴總數(shù)陽性液滴數(shù)陰形液滴數(shù)陰陽性判斷陽性比例10615467015467陰性6/2416148116147陰性16659016659陰性16906216904陰性19275319272陽性19829019829陰性19119119118陰性19750219748陰性19587019587陰性20909020909陰性20271220269陰性19641219639陰性20335020335陰性20340220338陰性20226320223陽性19940319937陽性空性空性空白12973012973陰性結(jié)果顯示本方法檢測限為1copies/μL重復性將專屬性實驗在AppliedBiosystemsProflex基因擴增儀進行擴增，進行儀器耐用性實驗，結(jié)果如下。表16重復性實驗儀器耐用性結(jié)果供試品是否加標合格液滴數(shù)陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陰陽性判斷人基因組DNA不加標16305016305陰性Hela細胞不加標16603016603陰性HV-101注射液不加性ATCC243培養(yǎng)基不加性ATVV988培養(yǎng)基不加標16959216957陰性支原體肉湯培養(yǎng)基不加標19982019982陰性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基不加標16141116140陰性提取空白對照不加標19168119167陰性人基因組DNA加標1310727312834陽性Hela細胞加標14253123513018陽性HV-101注射液加標12726148911237陽性ATCC243培養(yǎng)基加標14515140713018陽性ATCC988培養(yǎng)基加標14766107813688陽性支原體肉湯培養(yǎng)基加標16354133115023陽性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基加標13372129012082陽性MO陽性參考品稀釋至10-2加標1092158495072陽性空白/854008450陰性結(jié)果顯示在不同的PCR擴增儀上進行擴增，對實驗結(jié)果不產(chǎn)生影響。qPCR法方法學確認方法學專屬性實驗結(jié)果如下所示(圖7、表17)：圖7qPCR方法學確認專屬性結(jié)果表17qPCR方法學確認專屬性結(jié)果供試品是否加標內(nèi)標探針(VIC)Cq值支原體檢測探針(FAM)Cq值實驗有效性是否滿足支原體檢測結(jié)果人基因組DNA否28.525Undetermined是陰性Hela細胞否28.751Undetermined陰性HV-101否26.251Undetermined陰性ATCC243培養(yǎng)基否28.252Undetermined陰性ATCC988培養(yǎng)基否27.345Undetermined陰性支原體肉湯培養(yǎng)基否28.53Undetermined陰性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基否28.22Undetermined陰性人基因組DNA是28.46228.383陽性Hela細胞是28.48528.869陽性HV-101是27.65526.671陽性ATCC243培養(yǎng)基是28.32128.321陽性ATCC988培養(yǎng)基是26.67127.656陽性支原體肉湯培養(yǎng)基是28.86928.485陽性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基是28.38328.462陽性陰性對照/30.982Undetermined陰性陽性對照/31.20425.648陽性無模板對照/30.961Undetermined陰性方法學檢測限結(jié)果如下所示(圖8、表18)：圖8qPCR方法學確認檢測限結(jié)果表18qPCR方法學確認檢測限結(jié)果供試品濃度(copies/μL)內(nèi)標探針(VIC)Cq值支原體檢測(FAM)值實驗有效性是否滿足支原體檢測結(jié)果陽性比例10Undetermined33.715是陽性8/810Undetermined33.333陽性10Undetermined33.367陽性10Undetermined33.577陽性10Undetermined34.165陽性10Undetermined33.7陽性10Undetermined33.09陽性10Undetermined33.152陽性1UndeterminedUndetermined陰性1/81UndeterminedUndetermined陰性1UndeterminedUndetermined陰性1Undetermined37.374陽性1Undetermined41.458陰性1Undetermined40.224陰性1UndeterminedUndetermined陰性1Undetermined43.538陰性陽性對照31.20425.648陽性空白對照30.982Undetermined陰性結(jié)果顯示,本方法的檢測限為10copies/μL重復性在宏石SLAN-96S熒光定量基因擴增儀進行上述QPCR實驗，結(jié)果如下表19所示表19qPCR重復性實驗結(jié)果供試品是否加標內(nèi)標探針(VIC)Cq值支原體檢測(FAM)值實驗有效性是否滿足支原體檢測結(jié)果人基因組DNA否29.05Undetermined是陰性Hela細胞否30.58Undetermined陰性HV-101否28.39Undetermined陰性ATCC243培養(yǎng)基否28.25Undetermined陰性ATCC988培養(yǎng)基否26.82Undetermined陰性支原體肉湯培養(yǎng)基否26.55Undetermined陰性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基否26.68Undetermined陰性人基因組DNA是28.5737.31陽性Hela細胞是30.4837.51陽性HV-101是28.6136.63陽性ATCC243培養(yǎng)基是28.2435.99陽性ATCC988培養(yǎng)基是26.5936.09陽性支原體肉湯培養(yǎng)基是26.4035.20陽性精氨酸支原體肉湯培養(yǎng)基是26.4635.73陽性陰性對照/31.12Undetermined陰性陽性對照/27.9733.78陽性無模板對照/31.05Undetermined陰性結(jié)果顯示在不同的qPCR儀上檢測結(jié)果一致，符合方法學重復性檢驗要求。討論 因支原體復蘇情況不理想，用作對比的CCU50方法不能達到預期結(jié)果，因此選擇用較為成熟的qPCR快速檢測法作為對比。通過對比qPCR方法與ddPCR方法,專屬性方面ddPCR與qPCR表現(xiàn)相當；檢測限實驗結(jié)果顯示qPCR法的檢測限為10copies/μL，ddPCR法的檢測限為1copies/μL，ddPCR法的表現(xiàn)更優(yōu)；儀器耐用性實驗結(jié)果顯示兩法表現(xiàn)相當。但是ddPCR儀成本較高，操作過程用時較長且難度比qPCR高，綜合這些方面考慮ddPCR在目前情況下表現(xiàn)不一定比qPCR法好。結(jié)論本研究基于微滴式數(shù)字PCR技術建立細胞治療產(chǎn)品中支原體污染的快速檢查法，該方法具有良好的靈敏性、特異性與穩(wěn)定性，檢測限實驗表現(xiàn)優(yōu)于目前主流的qPCR法檢測支原體。

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