人生長激素重組蛋白的制備及其純化

人生長激素重組蛋白的制備及純化【摘要】目的：制備人生長激素重組蛋白（rhGH）為制備單克隆抗體打下基礎(chǔ)及其建立GH檢測(cè)方法。方法：本研究將rhGH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tf16分子伴侶)，挑取5個(gè)單克隆菌株誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行可溶性表達(dá)的鑒定。結(jié)果：成功實(shí)現(xiàn)了rhGH蛋白的可溶性表達(dá)，并從中篩選出目的蛋白表達(dá)量最高的2號(hào)菌株；通過GSTrapFF1mL親和層析柱純化rhGH蛋白，得到了比較顯著的結(jié)果；優(yōu)化了2號(hào)rhGH菌株的誘導(dǎo)條件，結(jié)果顯示，在25℃和0.5mmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)10h下rhGH蛋白的表達(dá)效果最好，并利用WB和ELISA鑒定了rhGH蛋白的表達(dá)情況。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了rhGH的可溶性表達(dá)，并探索出了原核表達(dá)的最佳條件，為進(jìn)一步研究rhGH結(jié)構(gòu)和制備單克隆抗體打下基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】重組人生長激素；大腸桿菌；純化Preparation

and

purification

of

recombinant

protein

of

human

growth

hormone[Abstract]Objective:

The

preparation

of

rhGH

recombinant

protein

lays

a

foundation

for

the

preparation

of

monoclonal

antibodies

and

establishes

a

detection

method

for

GH.

Methods:

In

this

study,

rhGH

plasmid

was

transformed

into

BL21(DE3)

receptor

cells

(Tf16

molecular

companion),

and

five

monoclonal

strains

were

selected

to

induce

expression

and

identify

soluble

expression.

Results:

The

soluble

expression

of

rhGH

protein

was

successfully

achieved,

and

strain

No.

2

with

the

highest

expression

of

target

protein

was

screened

out.

The

rhGH

protein

was

purified

by

nickel

affinity

chromatography.

The

results

showed

that

the

rhGH

protein

could

be

eluted

with

imidazole

at

the

concentration

of

500

mmol/L.

The

induction

conditions

of

rhGH

strain

No.

2

were

optimized.

The

results

showed

that

the

expression

of

rhGH

protein

was

the

best

at

25

℃

and

0.5

mmol/L

IPTG.

Conclusions:

In

conclusion,

this

study

successfully

achieved

the

soluble

expression

of

rhGH

through

the

prokaryotic

expression

system,

and

explored

the

optimal

conditions

for

prokaryotic

expression,

which

laid

a

foundation

for

further

study

of

rhGH

structure

and

preparation

of

monoclonal

antibody.[Keywords]Recombinant

human

growth

hormoneE.

colipurification

目錄TOC\o"1-3"\h\u183221前言 前言研究背景人生長激素的簡介人的身體通過腦垂體前葉的嗜酸性細(xì)胞分泌出來生長激素。它是帶有由191個(gè)氨基酸所構(gòu)成的肽類激素，內(nèi)含兩對(duì)二硫鍵，相對(duì)分子質(zhì)量大概為22kd。除此之外，該激素不會(huì)被糖基化修飾。重組表達(dá)的重組人生長激素（rhGH）與人體內(nèi)源性生長激素具有等同作用REF_Ref15574\r\h[1]，其主要通過刺激肝臟分泌胰島素樣生長因子（IGF-1），作用于骨和軟骨，引起身高的增長，同時(shí)能夠促進(jìn)人體蛋白質(zhì)合成及脂質(zhì)分解和脂質(zhì)氧化，調(diào)節(jié)體內(nèi)水鹽平衡[2]。生產(chǎn)人生長激素通過兩種方法，一種是從人的尸體中摘取腦垂體做材料,進(jìn)行人工提取，但不久就被證實(shí)在人體無活性；另一種是目前主要的方法，用基因工程，常見的表達(dá)系統(tǒng)可分成兩類[3]：一種是原核表達(dá)系統(tǒng)，其中，大腸桿菌是最常見的宿主，也是目前最廣泛用于表達(dá)外源蛋白的表達(dá)宿主[4]，此外還有芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)，另一種是真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，比如酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其在真核蛋白表達(dá)和分離純化工藝方面比大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)[5]。重組人生長激素的臨床應(yīng)用目前，體外補(bǔ)充生長激素是生長激素缺乏癥患兒唯一的治療方式，從1958年的人垂體提取生長激素，到今天利用基因工程技術(shù)合成，rhGH的大規(guī)模生產(chǎn)使其被廣泛運(yùn)用于生長激素缺乏癥的相關(guān)治療中，不僅能促進(jìn)先天性卵巢發(fā)育不全綜合征和慢性腎臟病患兒生長，同時(shí)還能協(xié)助治療充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺病、重癥急性胰腺炎、嚴(yán)重?zé)齻?，糾正低蛋白血癥以及促進(jìn)創(chuàng)面愈合[6]。重組人生長激素在體外診斷中的醫(yī)用體外診斷（InVitroDiagnosis，IVD）是指將血液、體液、組織等樣本從人體中取出，使用體外檢測(cè)試劑、儀器等對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)與校驗(yàn)，按照方法學(xué)分為生化診斷、免疫診斷、分子診斷三大類[7]，其中免疫診斷具有高靈敏度、寬的線性范圍、精確的定量檢測(cè)、結(jié)果穩(wěn)定、誤差小以及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)?？乖贵w是診斷試劑的核心，其質(zhì)量決定了診斷的穩(wěn)定性和靈敏度。受研發(fā)技術(shù)及生產(chǎn)工藝限制，我國體外診斷企業(yè)自產(chǎn)原材料能力有限且產(chǎn)能不足，體外診斷產(chǎn)品生產(chǎn)所需原材料多需從國外進(jìn)口[8]。如今，我們都了解，主要用于體外診斷產(chǎn)品研發(fā)的核心因素其中包括:固定相原料、抗原或抗體來源、阻滯劑等。可以選擇與目的分子高度特異能結(jié)合的抗原或抗體，是生產(chǎn)高效快速、具特異性試劑的最決定性因素。研究目的及意義體外診斷試劑行業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈?zhǔn)怯缮嫌卧牧?、中游體外診斷試劑、下游服務(wù)和需求共同組成[9]，為了更好的服務(wù)體外診斷試劑研發(fā)與生產(chǎn)，從上游原料開始嚴(yán)格把關(guān)，選擇高品質(zhì)、穩(wěn)定性好的診斷試劑原料。因此獲取高純度、高活性的rhGH不僅對(duì)于降低工業(yè)成本具有重要意義，還為制備抗生長激素抗體提供原料，最終服務(wù)于人血清中生長激素的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)主要研究內(nèi)容本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌BL21作為宿主細(xì)胞表達(dá)出rhGH蛋白，培養(yǎng)挑取5個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳，初步篩選出呈陽性克隆的菌株，對(duì)鑒定的5個(gè)菌株進(jìn)行擴(kuò)培與誘導(dǎo)表達(dá)，通過蛋白濃度測(cè)定和SDS凝膠電泳，驗(yàn)證其可溶性表達(dá)并篩選出表達(dá)量最高的菌株為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用；對(duì)篩選出的菌株采用GSTrapFF1mL親和層析柱進(jìn)行純化，通過控制單一變量和SDS凝膠電泳判斷rhGH原核表達(dá)的最適條件，最后用WB和ELISA進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。

rhGH的表達(dá)及純化條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒和菌株BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tf16分子伴侶)和GST-hGH重組質(zhì)粒（均由實(shí)驗(yàn)室提供）。主要試劑和試劑盒表2-1主要試劑和試劑盒試劑名稱生產(chǎn)廠家甘氨酸氯霉素氨芐青霉素過硫酸銨蛋白胨TrisL-阿拉伯糖氯化鈉咪唑PCR試劑盒還原型谷胱甘肽考馬斯亮藍(lán)染色液苯甲基磺酰氟（PMSF）酵母粉瓊脂糖GelRed異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）BCA蛋白定量試劑盒VazymeVazyme上海阿拉丁上海阿拉丁BiosharpBiosharp上海阿拉丁上海阿拉丁上海阿拉丁Vazyme北京普博欣公司上海碧云天上海碧云天BiosharpBiosharpBiosharp上海碧云天上海碧云天主要實(shí)驗(yàn)儀器和耗材表2-2主要實(shí)驗(yàn)儀器和耗材名稱生產(chǎn)廠家0.22μm濾膜96孔板各種規(guī)格離心管各種規(guī)格槍頭移液槍磁力攪拌器高速冷凍離心機(jī)PH離子計(jì)全自動(dòng)高壓滅菌鍋超純水系統(tǒng)分析天平超凈工作臺(tái)恒溫振蕩培養(yǎng)箱恒溫金屬浴多功能酶標(biāo)儀超聲細(xì)胞破碎儀PCR儀凝膠成像儀脫色搖床蠕動(dòng)泵GSTrapFF1mL親和層析柱電泳儀上海碧云天BiosharpBiosharpBiosharp賽默飛ITESTER上海一恒科學(xué)儀器有限公司上海精密科學(xué)儀器有限公司日本TOMY公司美國密理博公司上海力辰邦西儀器科技有限公司蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司杭州瑞誠儀器有限公司德國Berthold公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司Bio-RadBio-Rad上海一恒科學(xué)儀器有限公司上海一恒科學(xué)儀器有限公司美國GE公司Bio-Rad主要實(shí)驗(yàn)試劑配制方法表2-3主要實(shí)驗(yàn)試劑配制方法試劑名稱配制方法LB液體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基氨芐青霉素溶液氯霉素溶液IPTG溶液L-阿拉伯糖溶液50×TAE溶液1%瓊脂糖凝膠溶液10%SDS溶液10%過硫酸銨溶液超聲緩沖液PMSF溶液5×Tris甘氨酸電泳液PBS溶液洗脫液包涵體裂解液10g蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化鈉，超純水定容至1L。10g蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化鈉，瓊脂粉15g，超純水定容至1L。1g氨芐青霉素粉末，溶于10mL超純水，0.22μm濾膜過濾，4℃保存。0.175g氯霉素粉末，溶于50mL超純水，0.22μm濾膜過濾，常溫保存。0.2235gIPTG粉末，溶于10mL超純水，0.22μm濾膜過濾，-20℃保存。10gL-阿拉伯糖粉末，溶于50mL超純水，0.22μm濾膜過濾，常溫保存。3.72gNa2EDTA·H2O、24.2gTris醋酸調(diào)pH至8.5超純水定容至100mL。0.5g瓊脂粉，1×TAE定容至50mL。5gSDS粉末，超純水定容至50mL，常溫保存。1g過硫酸銨粉末，超純水定容至10mL，4℃保存。5.844g的NaCl、3.152g的Tris-HCl、20mLTween20，超純水定容至1L。0.871gPMSF粉末，異丙醇定容至50mL，-20℃保存。15.1g的Tris、5g的SDS、94g甘氨酸，超純水定容至1L，常溫保存。140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4調(diào)pH7.3。50mMTris-HCl,10mM還原型谷胱甘肽調(diào)pH為8.0。1.576gTris-HCl、360.36g尿素、2.922g的NaCl、8.71g的L-精氨酸、43.55g的L-精氨酸、1mLEDTA溶液（5mol/L）用超純水定容至500mL于4℃保存。實(shí)驗(yàn)方法與步驟rhGH質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作，將GST-hGH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，根據(jù)以下具體方法進(jìn)行操作：將BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞從-80℃的冰箱中拿出來，放到冰面上化開后，用移液槍吸取50μL感受態(tài)細(xì)胞加入1.5mLEP管中，再換掉移液槍頭，吸取5μL的rhgh質(zhì)粒，并吹打混和在一起。最后，將混合物放入冰水浴中靜置30分鐘；然后42℃水浴熱激90s裝有混合物的EP管，然后用夾子夾起快速轉(zhuǎn)移至冰水浴中靜置2min；用移液器向EP管中加入500μlLB液體培養(yǎng)基（未添加抗生素），吹打混合均勻后將其放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱對(duì)其以220rpm/min振蕩培養(yǎng)1h（以促使質(zhì)?？剐曰虻谋磉_(dá)，為后續(xù)篩選做好準(zhǔn)備）；培養(yǎng)完成后取出，4000rpm離心1min，然后棄去300μL的上清培養(yǎng)基，吹打混勻剩余培養(yǎng)基[10]；用移液器吸取30μL菌液然后用涂布器將其分布均勻的涂布于LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100mg/L）上，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱一晚，等待菌落生成。菌落PCR鑒定取5個(gè)滅菌的1.5mLEP管，用移液器各加1mL的含氨芐青霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基；取出過夜的平皿，在超凈工作臺(tái)中先將鑷子灼燒，冷卻后（用鑷子夾取槍頭時(shí)不粘連即可）夾取一個(gè)10μL的槍頭戳入一個(gè)單克隆菌株，然后將槍頭放入EP管，在37℃恒溫培養(yǎng)箱220rpm/min振蕩培養(yǎng)10h；（對(duì)其進(jìn)行鑒定，以確定目的基因是否正確插入載體。）取菌液為模板按表2-4進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如表2-5所使。

表2-4菌液PCR體系體系組分體積（μL）ddH2O10xPCRBufferdNTPFP-1(10μM)RP(10μM)TapDNA酶Totalvolume7.5210.50.5112.5表2-5菌液PCR反應(yīng)程序循環(huán)步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性變性退火延伸徹底延伸94℃98℃60℃72℃72℃1min10s15s30s5min30個(gè)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒別PCR陽性產(chǎn)物。配制電泳緩沖液（1×TAE）：使用分析天平稱取0.5g瓊脂糖，然后倒進(jìn)錐形瓶中。再用1×TAE緩沖液將其定容至50mL并放入微波爐中稍加溶解。冷卻至50℃左右后，加入1μL染色液并均勻混和，用移液槍加入制膠板中，插上點(diǎn)樣梳，靜置，等待30分鐘凝固后，垂直向上拔出點(diǎn)樣梳。最后，將膠板放入盛有1×TAE電泳緩沖液的電泳槽中，再加入電泳緩沖液，直到膠板被完全淹沒。用移液槍吹打25μLPCR產(chǎn)物與5μL10×LoadingBuffer的混合物，充分混合，然后加入樣品孔中，待加完樣品與maker后，蓋上電泳槽蓋，接上電極插頭，電壓150V開始電泳，待溴酚藍(lán)移至凝膠底部，停止電泳，取出凝膠，在紫外燈下進(jìn)行觀察和鑒定(條帶位置正確的所對(duì)應(yīng)菌液可確定為陽性克隆轉(zhuǎn)化子)。對(duì)轉(zhuǎn)化成功的菌株留一部分保存于4℃冰箱待下一步擴(kuò)培，剩余菌液中加入等體積的甘油混合在一起后進(jìn)行-80℃保種。常溫誘導(dǎo)蛋白表達(dá)SDS電泳驗(yàn)證從4℃冰箱中取出經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證成功的菌株進(jìn)行擴(kuò)培、37℃誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS電泳驗(yàn)證。以溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為200rpm/min的條件下，將保留的各管菌液用LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100mg/L）在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩擴(kuò)培至50mL體系，當(dāng)菌液達(dá)到OD600=0.4~0.6的條件后加入工作濃度為1.0mmol/L和2.0mmol/L的IPTG和L-阿拉伯糖，繼續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)16小時(shí)。到時(shí)間后收集菌體并對(duì)其超聲裂解后進(jìn)行SDS電泳驗(yàn)證（初步鑒定所挑取的菌株的目的蛋白在全菌中是否表達(dá)），剩余樣品放于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆?。鑒定rhGH原核表達(dá)載體rhGH質(zhì)粒的大量表達(dá)復(fù)性與擴(kuò)培將通過篩選的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100mg/L），接種量為1%，在恒溫振蕩培養(yǎng)以溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220rpm/min振蕩培養(yǎng)，直至OD600=0.6-0.8（約2小時(shí)）；誘導(dǎo)和收菌吸取1mL菌液出來留作對(duì)照品，剩余菌液進(jìn)行5分鐘冰水浴后加入誘導(dǎo)劑終濃度為1.0mmoL/L的IPTG和2.0mmoL/L的L-阿拉伯糖，以30℃的溫度，220rpm/min的轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)表達(dá)10h后，在4℃，4000rpm離心10min收集菌體，然后用適量PBS洗滌2次；超聲破碎加適量Bindingbuffer重懸菌液，在冰水混合物中超聲破碎（30w，每次3s，停5s，45min），至懸液澄清。超聲后靜置10min，13000rpm離心1h，收集上清，-80℃保存。SDS凝膠電泳制膠板按表2-6和表2-7配12%的分離膠和5%濃縮膠[11]

表2-612%分離膠配料表（10mL）試劑體積（mL）純水30%丙烯酰胺1.5MTris-HCl（PH8.8）10%SDS10%APTEMED4.03.32.50.10.10.01表2-75%濃縮膠配料表（3mL）試劑體積（mL）純水30%丙烯酰胺1.0MTris-HCl（PH6.8）10%SDS10%APTEMED2.10.50.380.030.030.003樣品處理將離心后的蛋白樣品和5×SDSLoadingbuffer按比例混勻，于100℃金屬浴煮樣(不用蓋)，10min。上樣與電泳每個(gè)孔蛋白質(zhì)20μg，最右側(cè)加入5μLMarker，取煮沸后的蛋白樣品，用移液槍滴加變性后的蛋白樣品到凝膠孔，蓋上泳槽蓋（插頭對(duì)應(yīng)孔的顏色），打開電泳電源，電壓70V，跑濃縮膠25分鐘，然后改變電壓為120V，跑膠80分鐘，電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色30分鐘，用純水脫色直至膠的背景顏色變得干凈，觀察蛋白條帶并拍照記錄目的蛋白表達(dá)情況，根據(jù)條帶顏色的深淺篩選出目的菌株，對(duì)篩選的菌株-80°甘油保存。純化rhGH蛋白利用BIO-RADLP層析系統(tǒng)及GSTrapFF1mL親和層析柱進(jìn)行目的蛋白的分離純化[12]，具體操作步驟如下：取出篩選的菌株解凍，取1mL菌液并加入50mL的LB液體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100mg/L）置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中以200rpm/min振蕩復(fù)性12小時(shí)。復(fù)性后繼續(xù)把50mL的菌液用含氨芐青霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)培至500mL體系，在37℃，200rpm/min的條件下振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5后加入工作濃度為0.1mmol/L的IPTG，在25℃、200rpm/min的條件下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，收集菌體。根據(jù)菌體重量加入超聲緩沖液后進(jìn)行超聲破碎；對(duì)破碎后的菌液進(jìn)行離心，離心機(jī)參數(shù)設(shè)置為10000rpm/min，4℃，20分鐘，離心完成后將上清轉(zhuǎn)移至潔凈的EP管中；打開層析儀和電腦的開關(guān)，連接好層析儀的管道；從4℃冰箱中取出GSTrapFF1mL親和層析柱，然后取下底部的塞子使蛋白純化柱中的20%乙醇滴凈(20%乙醇用于保存純化柱中的填料)；先加入0.5MNaOH清洗管路，然后用超純水清洗管路，接上GSTrapFF1mL親和層析柱，繼續(xù)用超純水沖洗；以1mL/min的流速利用PBS平衡柱子后，按照0.5mL/min的速度上樣，同時(shí)收集穿透液；上樣后，用PBS以1mL/min的速度洗柱，直至流出液無物質(zhì)；用洗脫液以1mL/min的速度洗脫，收集洗脫液；等到洗脫后用超純水洗柱，再用20%乙醇沖洗，最后在純化柱中加入足量的20%乙醇以保護(hù)填料，再放回4℃冰箱中；對(duì)純化前后蛋白樣品作SDS電泳。優(yōu)化rhGH蛋白的表達(dá)條件將上述純化后的菌種按1：1000比例接種于５ｍL含氨芐青霉素100mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，置37℃180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，按1：100比例接種至新鮮上述液體LB培養(yǎng)基，150r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5左右時(shí)，按以下各方式誘導(dǎo)表達(dá)菌株[13]：在25℃條件下，分別向培養(yǎng)液中添加為0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM的IPTG并誘導(dǎo)表達(dá)，6小時(shí)后分別取2mL樣品。，在不同溫度梯度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃下向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.25mM的IPTG，并持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，最終采取2mL樣品。在25℃下誘導(dǎo)表達(dá)，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.25mM的IPTG，分別于4h、6h、8h、10h、12h取2mL樣品。對(duì)以上樣品的處理方法：于12000r/min離心后收集菌體，進(jìn)行洗滌、裂解以及煮沸等處理后，使用SDS電泳分析，來確定最佳的誘導(dǎo)條件，再以確定的優(yōu)化條件培養(yǎng)純化菌株，分別取條件優(yōu)化前后菌株經(jīng)SDS電泳驗(yàn)證。鑒定rhGH蛋白電泳根據(jù)表2-6和表2-7配制12%的分離膠和5%的濃縮膠。樣品前處理對(duì)蛋白樣品進(jìn)行研磨，并添加適量的細(xì)胞裂解液。將裂解后的蛋白樣品離心，轉(zhuǎn)速為12000rpm，20min后取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒定量，按照蛋白量及所需蛋白濃度計(jì)算出勻漿液和buffer的含量，制成上樣buffer，放進(jìn)鍋中煮沸10min（不需要蓋蓋），冷卻后待用。BCA蛋白定量利用該試劑盒作吸光度與蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。首先確定檢測(cè)的樣品量加8個(gè)標(biāo)樣（一般多配一個(gè)孔），并配制合適的BCA工作液（A液：B液=50：1，充分混合均勻），現(xiàn)配先用；將標(biāo)準(zhǔn)品按照0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，16μl，20μl加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加純水把每個(gè)孔補(bǔ)足到20μl，然后加入適當(dāng)體積的樣品到96孔板的樣品孔中，加入用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的溶液補(bǔ)足到20μl[14]；各個(gè)孔加入200μl

BCA工作液，震蕩30min；測(cè)定A562，酶標(biāo)儀選570nm，測(cè)定，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白的濃度。上樣與電泳取煮沸后的蛋白樣品，用移液槍把變性后的蛋白樣品滴加到凝膠孔里，蓋上泳槽蓋（插頭與孔顏色相對(duì)應(yīng)），打開電泳電源，電壓60-70V，電泳時(shí)間25min，待蛋白樣品溴酚藍(lán)跑成一條直線時(shí)，電壓換至120V，當(dāng)跑至底端附近（綠色邊以下）即可停止電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色將膠取下，用考馬斯亮藍(lán)染色40min，脫色三次，20min/次。免疫印跡試驗(yàn)（WesternBlotting）同電泳（一）前三個(gè)步驟轉(zhuǎn)膜與封閉可用刮板將膠從邊縫掀起撥掉，參照Marker分子量區(qū)域部分切除濃縮膠和多余一部分的分離膠，僅保留目的蛋白表達(dá)區(qū)。將PVDF膜事先浸洗1-2分鐘的甲醇中，然后將膜與膠片和濾紙等堆疊，來進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電壓為60V，時(shí)間持續(xù)1小時(shí)；轉(zhuǎn)膜完畢后，當(dāng)心拿下膜，加入適量的脫脂奶粉（5%）浸泡，室內(nèi)溫度下密封振蕩2小時(shí)，封閉結(jié)束后，用TBST振蕩洗膜1min。一抗、二抗孵育加入一抗（兔抗體，1:3000稀釋）37℃振蕩孵育1h，用PBST（20mmol/L

PBS，0.1%

Tween20）漂洗三次；之后直接加入1:5000稀釋后的羊抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，移至37℃下振蕩孵育1小時(shí)，孵育結(jié)束后再對(duì)其三次PBST漂洗。發(fā)光顯影用ECL發(fā)光液400μl在暗房里，孵育膜約2-3分鐘后將富士感光膠片加入，對(duì)其進(jìn)行2分鐘壓片，然后再用顯影劑顯影40秒，定影1分鐘。ELISA檢測(cè)抗原包被以100μL/孔將包被的rhGH抗原（2μg/mL）加到酶標(biāo)板中，并在4℃的電冰箱中儲(chǔ)放一晚。洗板將抗原板內(nèi)的包被液倒掉，甩干，用排槍加入洗滌液，150μL/孔，再倒掉，洗滌三次，最后一次將板內(nèi)的洗滌液在書本上拍干。封閉往酶標(biāo)板孔內(nèi)加入5%的脫脂牛奶（用包被液配制），150μg/孔，室溫中靜置1h，用PBS洗三次。加一抗一抗稀釋2000倍，用PBS稀釋。設(shè)置三個(gè)對(duì)照組，分別是一照對(duì)抗、二照對(duì)抗、抗原對(duì)照，除了二抗對(duì)照，抗原對(duì)照加100μL的PBS外，每孔都加入100μL的一抗，室溫下靜置2h，洗滌3次。加二抗選用PBS加蛋白將二抗稀釋5000倍。除了一抗對(duì)照和抗原對(duì)照加100μLPBS外，每個(gè)孔洞都再添加了100μL的二抗溶液，室溫孔內(nèi)作用40-60min，洗滌5次。顯色反應(yīng)加入新配制的底物溶液100μL/孔，避光作用2-3min。終止反應(yīng)每個(gè)孔中加入50μL的2mol/LH2SO4溶液，在450nm波長下立刻直接用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果rhGH表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將GST-hGH質(zhì)粒在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后涂布于的LB固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100mg/L）培養(yǎng)一晚，挑選5個(gè)單克隆菌落對(duì)其核酸電泳檢驗(yàn)，挑取的5個(gè)菌株在750bp處均有明顯的單一條帶，且條帶位置對(duì)應(yīng)的大小均與預(yù)期相符（見圖3-1），初步證實(shí)了GST-hGH重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tf16分子伴侶)。在PCR擴(kuò)增與瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證成功后對(duì)菌株在37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)離心收集菌體并破碎后對(duì)全菌樣品做SDS電泳鑒定，與Pcold空載菌相比，5個(gè)菌株均在44kDa處有與rhGH蛋白大小一致的條帶，進(jìn)一步證實(shí)了rhGH蛋白在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tf16分子伴侶)中成功表達(dá)。圖3-1rhGH菌株P(guān)CR鑒定M:Marker（DL2000）；1~5：轉(zhuǎn)化挑取的5個(gè)單克隆菌落rhGH菌株的可溶性表達(dá)驗(yàn)證16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)樣品SDS電泳結(jié)果，與Pcold空載菌相比，5個(gè)菌株的上清與沉淀樣品均在44kDa處有與rhGH蛋白大小一致的條帶，成功驗(yàn)證了重組菌株的可溶性表達(dá)。比較5個(gè)菌株目的蛋白條帶顏色的深淺可知，在同樣的誘導(dǎo)表達(dá)條件下，2號(hào)菌株的目的蛋白的表達(dá)量最高，因此選擇2號(hào)菌株作為后續(xù)探究rhGH蛋白的最佳表達(dá)條件的實(shí)驗(yàn)菌株。rhGH蛋白的純化將得到的菌液經(jīng)GSTrapFF1mL親和層析柱純化，對(duì)純化前后rhGH蛋白的沉淀與上清進(jìn)行電泳，可以看到目的蛋白條帶變得更明顯了（見圖3-2）。圖3-2rhGH純化結(jié)果rhGH表達(dá)的條件優(yōu)化經(jīng)SDS電泳分析，2號(hào)菌株分別在IPTG工作濃度為0.5mmol/L、溫度為25℃及誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為10h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高，以優(yōu)化條件培養(yǎng)純化菌株，對(duì)優(yōu)化條件培養(yǎng)前后的菌株作SDS電泳，從結(jié)果來說，可以明顯地看出優(yōu)化后蛋白表達(dá)量更高（見圖3-3）。圖3-3rhGH表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果rhGH蛋白的鑒定BCA蛋白定量：將超聲后樣品上樣10μg所測(cè)OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3-4），經(jīng)處理后可得：上清：1.91μg/μL，沉淀：3.77μg/μL；圖3-4吸光度-蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖電泳結(jié)果：電泳檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，在44.3kDa左右出現(xiàn)很明顯條帶，可以證明順利獲得了目的蛋白（見圖3-5）。圖3-5rhGH蛋白的電泳圖WesternblottingGAPDH的顯影膠圖在34kDa附近出現(xiàn)清晰條帶，rhGH的顯影膠圖在43kDa附近出現(xiàn)清晰條帶，說明制備的rhGH可以和GH抗體特異性結(jié)合，rhGH有生物活性（見圖3-6）。圖3-6WB顯影膠圖ELISArhGH與單抗具有反應(yīng)性，且反應(yīng)性較強(qiáng)（見圖3-7）。圖3-7ELISA（rhGH）

討論原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白的方式可分為可溶性表達(dá)和非可溶性表達(dá)，可溶性表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物可溶于菌體破碎后的上清溶液中，而非可溶性表達(dá)的重組蛋白則以包涵體的形式存在[15]，但后期要從包涵體中純化出重組蛋白這個(gè)過程會(huì)大大降低重組蛋白的生物活性，因此想要制備出高活性的重組蛋白，往往需要通過原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)。Tf16分子伴侶則可協(xié)助目的蛋白在重組菌株中正確折疊，提高高活性蛋白的表達(dá)量，在此作用下成功實(shí)現(xiàn)了rhGH的可溶性表達(dá)。但低溫條件下菌體的生長緩慢，不利于重組蛋白的表達(dá)。為了解決這個(gè)問題，本研究采用了Pcold表達(dá)載體和Tf16分子伴侶相結(jié)合的方式，在低溫條件下用IPTG和L-阿拉伯糖共同誘導(dǎo)原核表達(dá)載體可溶性表達(dá)hGH重組蛋白。對(duì)轉(zhuǎn)化的菌株進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定初步證實(shí)rhGH蛋白在BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(Tf16分子伴侶)中成功表達(dá)，以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度；然后對(duì)5個(gè)單菌落低溫誘導(dǎo)表達(dá)樣品進(jìn)行SDS驗(yàn)證，篩選表達(dá)量最高的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更直觀表現(xiàn)；為了盡可能的得到純化rhGH為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用，使用GSTrapFF1mL親和層析柱進(jìn)行純化，得到了較為明顯的純化結(jié)果；對(duì)于誘導(dǎo)條件優(yōu)化考慮，高濃度的IPTG對(duì)菌體具有毒性作用，低溫條件下菌體的生長緩慢，均不利于重組蛋白的表達(dá)，因此在后續(xù)研究中又對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過電泳結(jié)果的比較得到了誘導(dǎo)的最佳IPTG濃度、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，但由于時(shí)間緣故，是從查閱的文獻(xiàn)作為參考直接設(shè)置的各條件梯度，故梯度設(shè)置的合理性以及得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)論仍有繼續(xù)探索的余地。

結(jié)論與展望本實(shí)驗(yàn)選用rhGH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）的感受態(tài)細(xì)胞中，隨后在低溫狀態(tài)下促使表達(dá)目的蛋白。通過PCR鑒定和瓊脂糖凝膠電泳初步驗(yàn)證了GST-hGH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功，SDS電泳初步驗(yàn)證rhGH的可溶性表達(dá)；以GSTrapFF