生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分分析

關(guān)于生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分分析大綱要求了解體內(nèi)中藥制劑分析的性質(zhì)、意義和任務(wù)熟悉中藥制劑在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化、生物樣品內(nèi)藥物分析方法掌握體內(nèi)中藥制劑樣品的制備方法及注意事項掌握生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分分析方法的建立第2頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述一、生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分分析的意義和任務(wù)含義：體內(nèi)中藥制劑分析又稱體液藥物分析、生物藥物分析，是隨著臨床藥學(xué)、臨床藥理學(xué)的發(fā)展和需要而建立起來的一門研究生物機體中藥物及其代謝產(chǎn)物或內(nèi)源性物質(zhì)質(zhì)與量變化規(guī)律的新興學(xué)科。第3頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述（一）生物體內(nèi)中藥制劑分析的意義

研究中藥制劑在生物樣品內(nèi)的數(shù)量和質(zhì)量變化，獲得藥物代謝動力學(xué)的各種參數(shù)、藥物在生物樣品內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化、代謝的方式和途徑等信息，從而為藥品生產(chǎn)、臨床醫(yī)療、實驗研究等方面對所研究藥物作出估計與評價。ADME/Tox第4頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述（二）體內(nèi)中藥制劑分析的主要任務(wù)1.分析方法學(xué)的研究關(guān)鍵性問題2.生物樣品內(nèi)中藥制劑成分研究原型藥物、代謝產(chǎn)物3.生物樣品內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測定和研究代謝組學(xué)第5頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述二、體內(nèi)中藥制劑分析的對象（一）分析對象體液、器官、組織、排泄物等大鼠、兔、狗、猴、人母體藥物代謝產(chǎn)物第6頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概述（二）體內(nèi)中藥制劑分析的特點1.干擾雜質(zhì)多：內(nèi)源性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、脂肪酸、色素、酶等；代謝物、共存藥物等2.樣品量少：生物體采樣量受限3.分析方法要求高：高選擇性、靈敏度第7頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)中藥制劑化學(xué)成分在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化一、中藥制劑化學(xué)成分在生物樣品內(nèi)的存在狀態(tài)二、藥物代謝第8頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化一、存在狀態(tài)游離藥物結(jié)合藥物

蛋白質(zhì)結(jié)合不能透過細胞膜可逆第9頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化（一）與血漿蛋白結(jié)合可逆的結(jié)合/非特異性的結(jié)合白蛋白/酸性糖蛋白/脂蛋白結(jié)合與解離動態(tài)平衡

Cb/Cf：血漿蛋白結(jié)合率

0—0.9：大于0.9高結(jié)合率，小于0.2低結(jié)合第10頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化（一）與血漿蛋白結(jié)合影響因素：藥物濃度、藥物與蛋白結(jié)合點的親和力、蛋白結(jié)合點的數(shù)量

年齡:新生兒、老年人低第11頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化（一）競爭血漿蛋白結(jié)合的中藥制劑化學(xué)成分間的相互作用理化性質(zhì)相似的成分第12頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化二、藥物代謝（Drugbiotransformation)

藥酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過程1.藥物的代謝部位及化學(xué)途徑

肝臟、腎、脾、肺、腸粘膜、血漿、皮膚等肝微粒體、線粒體、胞漿中存在的藥物代謝酶生物體內(nèi)藥物代謝酶及其特性（熟悉）第13頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化藥物代謝研究的意義了解藥物進入生物體后的狀態(tài)、與生物系統(tǒng)的相互作用，保證臨床用藥安全、有效研究藥物的代謝途徑、酶催化機制、結(jié)構(gòu)與藥理作用的關(guān)系，對避免藥物的毒性及尋找新藥具一定意義研究藥物相互作用、毒性作用機制，使臨床用藥更加安全、合理第14頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化二、藥物代謝（Drugbiotransformation)

藥酶的作用下經(jīng)歷化學(xué)結(jié)構(gòu)變化的過程2.藥物代謝的反應(yīng)類型氧化還原水解第一相反應(yīng)結(jié)合反應(yīng)：第二相反應(yīng)第15頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化舉例川芎嗪：主要是氧化代謝第16頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備一、選擇體液或組織供體內(nèi)藥物分析的一般原則二、常用生物樣品的種類、特點與采集三、樣本的代表性四、樣品的儲存五、樣品的預(yù)處理第17頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備一、選擇體液或組織供體內(nèi)藥物分析的一般原則：1、能夠反映出濃度與藥效之間的關(guān)系2、易于獲得3、便于處理、適合分析4、根據(jù)不同檢測目的與要求進行選取第18頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備二、常用生物樣品的種類、特點與采集按照生物樣品的性質(zhì)，生物樣品可分為：均勻樣品：血液、尿液、唾液、膽汁、腦脊液、淋巴液等非均勻樣品：心、肝、脾、肺、腦等器官組織第19頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備二、常用生物樣品的種類、特點與采集（一）血樣（二）尿液（三）唾液（四）膽汁（五）臟器組織第20頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（一）血樣1、采血方式及評價多用靜脈采血注意：將注射器內(nèi)取好的血液轉(zhuǎn)入試管或其他容器時，應(yīng)注意勿用力壓出，而應(yīng)取下針頭后輕推，以免血球破裂使血漿（或血清）帶紅色。第21頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2、全血、血漿和血清樣品的制備血液自然凝結(jié)離心上層：血清（40％）下層：血細胞加抗凝劑離心上層：血漿（50％）下層：血細胞全血第22頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2.1抗凝劑的選擇：肝素最常用，一般不會干擾藥物分析及導(dǎo)致藥物發(fā)生化學(xué)變化枸櫞酸鹽、乙二胺四乙酸（EDTA）：能與血中Ca2+結(jié)合，可能引起被測組分發(fā)生化學(xué)變化或干擾藥物的測定肝素是一種含硫酸的粘多糖，常用其鈉鹽、鉀鹽，能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白，一般1ml血液需要用肝素0.1~0.2mg，血液放入有抗凝劑的試管后輕輕旋搖容器，但勿太猛烈。第23頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備3.全血、血漿和血清樣品的應(yīng)用3.1血清和血漿可任意選用，測定方法可通用，但血漿量多應(yīng)用方便，若血漿內(nèi)抗凝劑對藥物分析有影響，則應(yīng)使用血清樣品血藥濃度均指血漿或血清中的藥物總濃度（游離的和與血漿蛋白結(jié)合的總濃度）（微透析技術(shù)除外）第24頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備3.2全血：不能很好反映藥物的藥理作用強度，不能作為作用部位藥濃的可靠指標(biāo)（血細胞中的藥物暫時僅作為“儲庫”，失去藥理作用）第25頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備血樣的特點：缺點：損傷性采樣方式、樣品量受限、抽血比較麻煩優(yōu)點：可用于藥物動力學(xué)、生物利用度、臨床治療藥物監(jiān)測第26頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（二）唾液

可用作藥物濃度檢測及藥代動力學(xué)研究唾液中藥物濃度通常與血漿濃度相關(guān)，比血漿藥物濃度低收集方法：漱口后15min收集不同唾液腺分泌不同的唾液，成分不盡相同個體差異大第27頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（三）尿液用于藥物劑量回收、藥物腎清除率及代謝類型等研究體內(nèi)中藥清除主要是通過尿液排出，藥物以原型、代謝物、綴合物形式排出收集方法：規(guī)定的時間內(nèi)采集尿液第28頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1.特點1.1尿中藥物濃度改變不直接反映血藥濃度1.2尿液藥物濃度較高，收集量大，但濃度變化較大，要測定一定時間內(nèi)尿中藥物總量，需要記錄排出的尿液體積及尿藥濃度1.3短時間內(nèi)不能多次取樣，排尿時間較難掌握及不易采集完全等缺點第29頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（四）膽汁闡明藥物的膽汁排泄率及藥物的體內(nèi)動態(tài)特性方法：膽汁引流規(guī)定時間內(nèi)收集膽汁計算累積排泄量第30頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（五）臟器組織用于研究成分在各器官、組織的分布、積蓄或代謝研究臟器組織可與成分形成強烈結(jié)合分離分析前，需預(yù)先制成1：5或1：10勻漿，提高溶劑抽提率，降低組織空白值，避免乳化第31頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備三、樣本的代表性1、取樣條件標(biāo)準化（攝取標(biāo)準膳食、控制飲水量等）2、取樣時間及其間隔一般在吸收相至少需要2~3個采樣點，對于吸收快的血管外給藥的藥物，應(yīng)盡量避免第一個點是峰濃度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3個采樣點；消除相需要4~6個采樣點。整個采樣時間至少應(yīng)持續(xù)到3~5個半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10~1/20第32頁,共89頁，2024年2月25日，星期天冷藏或冷凍1、血漿和血清：采血后及時分離（2h），短期4℃，長期-20℃2、尿樣：應(yīng)立即測定，否則需加防腐劑置冰箱保存3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取樣時測定pH值4、生物樣品總的原則：臨時解凍，解凍的樣品一次測完，不能反復(fù)冷凍→解凍→冷凍(FTC)；樣品應(yīng)以小體積分裝存放。第三節(jié)生物樣品的制備第33頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備

五、樣品的預(yù)處理（掌握）目的1.藥物從綴合物中釋放，測定總濃度2.純化、富集藥物3.適應(yīng)和滿足測定方法要求的靈敏度4.防止對分析儀器的污染和劣化第34頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備

五、樣品的預(yù)處理（掌握）（一）提取方法的選擇依據(jù)（二）藥物的提?。ㄈ┧幬锏姆蛛x與凈化（四）待測組分的富集（五）衍生物處理第35頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（一）提取方法的選擇依據(jù)藥物的理化性質(zhì)藥物的濃度范圍藥物測定的目的生物樣品的類型樣品處理與分析技術(shù)的關(guān)系第36頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（二）藥物的提取

1、蛋白質(zhì)處理：干擾分析、污染測定條件

2、綴合物水解：測定母體藥物

3、水溶性強的藥物：冷凍干燥，凍干后進行液－固萃取第37頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入與水相混溶的有機溶劑有機溶劑使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化沉淀劑：乙腈（2倍）、甲醇（3倍）乙醇、丙酮：很難揮干濃集超速離心（10000r/min）去除90％蛋白加保護柱第38頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入中性鹽蛋白質(zhì)脫水沉淀沉淀劑：硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、枸櫞酸鹽1：290％去除超速離心（10000r/min）第40頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理加入強酸常用溶劑（與蛋白質(zhì)陽離子形成不溶性鹽沉淀）：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－鎢酸混合液體積比：1：0.690％去除方法：超速離心（10000r/min）第41頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、蛋白質(zhì)處理沸水浴超濾、透析法（游離藥物濃度）第43頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2、綴合物水解含義：中藥制劑待測成分或其代謝物與體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合生成的產(chǎn)物特點：綴合物極性較母體藥物大，親水性強，不易被有機溶劑提取，需水解處理第44頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2、綴合物水解水解方法：酸水解，酶水解（葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶），溶解劑趨勢：直接測定綴合物的量，了解藥物代謝情況第45頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備3、冷凍干燥特點：適合于一次不能完成分析的大批量生物樣品、水溶性樣品、揮發(fā)性樣品和對熱不穩(wěn)定的樣品方法：干冰－丙酮浴、用液氮、冷凍干燥儀第46頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（三）藥物的分離和凈化1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)2、液－固萃取(liquid-solidextraction,LSE)第47頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)

大多數(shù)藥物都是脂溶性的，內(nèi)源性物質(zhì)基本上都是水溶性的，當(dāng)用有機溶劑萃取時，藥物被萃取出來而內(nèi)源性物質(zhì)被除去，因此采用有機溶劑萃取法能夠達到純化的目的第48頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)關(guān)鍵要考慮三個方面的因素：（1）有機溶劑的特性（2）有機溶劑相和水相的體積（3）水相的pH值第49頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE)萃取率應(yīng)不低于50％影響提取率的因素：水相的PH值提取溶劑：低沸點、低毒性（乙酸乙酯）、無水Na2SO4脫水離子強度：加入氯化鈉，有利于提取，減少乳化第50頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、液－液萃?。╨iquid-liquidextraction,LLE血漿或其他生物樣品加入萃取溶劑分取有機層必要時調(diào)pH值減壓氮氣吹干流動相溶解后進樣分析第51頁,共89頁，2024年2月25日，星期天1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE消除LLE中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象：1、提取前在水相中加入適量的固體食鹽2、經(jīng)適當(dāng)轉(zhuǎn)速離心消除已產(chǎn)生的輕微乳化3、置于冰箱中快速凍凝破壞乳化層，再融化后離心來消除已產(chǎn)生的嚴重乳化現(xiàn)象第52頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2、液－固萃?。╨iquid-solidextraction,LSE)原理：利用固體材料作為固定相，當(dāng)含多組分的生物樣品溶液通過時，固定相對各組份具有不同的親和性，一些組分受到“分配”或“吸附”作用而滯留在固定相上，當(dāng)使用流動相沖洗時，由于流動相對組分的親和性更強，隨按組分洗脫的難易，將其依次攜帶出柱，使之達到分離。第53頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備LSE與LLE相比其優(yōu)點固相與體液樣品接觸時很少引入外源性雜質(zhì)不會形成乳化現(xiàn)象萃取效率高，可減少生物樣品的用量萃取操作可在室溫進行，適于處理揮發(fā)性及對熱不穩(wěn)定的藥物第54頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備

LSE與LLE相比其缺點不同的藥物應(yīng)選擇合適的固定相，并且應(yīng)試驗洗脫時間和篩選合適的洗脫系統(tǒng)。血漿樣品反復(fù)凍凝和解凍后，會產(chǎn)生絮狀蛋白沉淀，阻塞固相提取柱，需先離心除去后再上柱不同批號的固相之間對藥物的萃取回收率有差異第55頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（四）待測組分的富集方法：揮去萃取溶劑法1.直接通入氣流吹干氣體：壓縮空氣，氮氣（易氧化的被測組分）注意：1.熱穩(wěn)定性成分，可置于一定溫度的水浴中加快揮發(fā)，溶劑吹干后立即停止通氣2.避免某些組分隨溶劑一起揮發(fā)損失，可加入沸點稍高的溶劑（如己醇）第56頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備2.減壓揮去溶劑方法：置玻璃真空干燥器內(nèi)緩緩抽氣適用：易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物注意：注意控制減壓程度和速度第57頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備3.真空離心濃縮儀第58頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)生物樣品的制備（五）衍生物處理注意：注意優(yōu)化衍生化條件第59頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法一、分析方法的設(shè)定依據(jù)二、方法建立的一般步驟三、方法的評價四、常用的定量分析方法第60頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法一、分析方法的設(shè)定依據(jù)1.文獻總結(jié)2.了解待測藥物的特性與生物樣品內(nèi)狀況3.明確測定目的與要求藥動學(xué)參數(shù)測定：不強調(diào)簡便、快速臨床藥物濃度檢測：要求方法簡便、快速第61頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法二、方法建立的一般步驟1.以純品進行測定：Rt2.空白樣品測定:內(nèi)源性干擾3.空白樣品中添加對照品后測定4.空白樣品中添加內(nèi)標(biāo)物后測定5.試制生物樣品的測定第62頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法三、方法的評價（一）專屬性（二）標(biāo)準曲線與定量范圍（三）準確度（四）精密度（五）定量限與檢測限（六）樣品穩(wěn)定性第63頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（一）專屬性1、目的：證明所測定的物質(zhì)是預(yù)期的分析物，內(nèi)源性物質(zhì)和其他代謝物不得干擾樣品的測定。2、方法：色譜法至少要考察6個不同個體空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（注明濃度）及用藥后的生物樣品色譜圖。第64頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（二）標(biāo)準曲線與定量范圍方法：將藥物對照品（實為對照品溶液）加入與供測樣品相同的空白生物基質(zhì)中混勻，配成已知藥濃的標(biāo)準品樣品，然后按照樣品預(yù)處理的方法進行處理后測定，將響應(yīng)值與藥濃建立標(biāo)準曲線使標(biāo)準樣品與供測樣品均處于相同的生物基質(zhì)環(huán)境中，按相同方法平行處理和測定，將所有樣品中的藥物及標(biāo)準曲線各濃度標(biāo)準樣品中的藥物均按相同比例表現(xiàn)為響應(yīng)值第65頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（二）標(biāo)準曲線與定量范圍注意：1.標(biāo)準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內(nèi)濃度測定結(jié)果應(yīng)達到試驗要求的精密度和準確度。2.用至少5個濃度建立標(biāo)準曲線，定量范圍要能覆蓋全部待測濃度，不允許將定量范圍外推求算未知樣品的濃度。3.建立標(biāo)準曲線時應(yīng)隨行空白生物樣品，但計算時不包括該點。第66頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（三）準確度方法：將已知量的藥物純品加到空白樣品中經(jīng)過一系列的處理、測定，所得藥物量與加入量之比值得百分率即為回收率注意：每次測定所得回收率要保持恒定、重現(xiàn)性好分類：絕對回收率和方法回收率第67頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法1.絕對回收率：又稱萃取回收率、提取回收率,反映一個方法的萃取效率高、中、低三種濃度吹干吹干甲乙+空白體液+混勻+有機溶劑萃取取萃取液，吹干+有機溶劑溶解+有機溶劑溶解分析分析結(jié)果比較第68頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法1.絕對回收率：高、中、低濃度的選擇：低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準曲線的上限；中間選一個濃度。每一濃度每批至少測定5個樣品。相對標(biāo)準差一般應(yīng)小于15%，在定量下限附近相對標(biāo)準差應(yīng)小于20%。絕對回收率數(shù)據(jù)要求：≥50％第69頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.方法回收率：又稱為相對回收率加樣回收實驗法

R＝(M-P)/A×100％

85％~115%(樣品藥濃≥200μg/L)80％~120％（樣品藥濃＜200μg/L）考察加入藥物量在真實樣品中的回收率，因此加入藥物量應(yīng)有高、中、低三種，而含藥物的真實樣品則可僅使用一種濃度，應(yīng)將該濃度樣品事先測定3~5次后取均值，作為原藥量p，然后加入高、中、低不同量的藥物標(biāo)準品溶液。第70頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（三）準確度絕對回收率和方法回收率的區(qū)別：方法回收率：表示分析方法的準確度，加樣回收實驗萃取回收率：指經(jīng)預(yù)處理后能將生物樣品中的藥物用于分析的比例第71頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（四）精密度1、方法：要求選擇3個濃度的質(zhì)控樣品（含藥物的真實樣品）同時進行方法的精密度和準確度考察。低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的3倍以內(nèi)；高濃度接近于標(biāo)準曲線的上限；中間選一個濃度。每一濃度每批至少測定5個樣品。2、內(nèi)容：日內(nèi)精密度和日間精密度第72頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.1日內(nèi)精密度：考察分析方法在短期內(nèi)的變異情況2.2日間精密度：考察樣品測定時使用的標(biāo)準曲線、儀器性能、試劑來源，以及環(huán)境條件等都可能有微小變化，從而導(dǎo)致分析結(jié)果的變異程度。第73頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法2.3進行日間精密度的方法：可使用日內(nèi)精密度測定時使用的三種藥濃樣品，在一周內(nèi)不同日分別測定3~5次，計算RSD。3.精密度數(shù)據(jù)要求：一般可控制在RSD≤15％第74頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（五）定量限定量下限是標(biāo)準曲線上的最低濃度點，要求至少能滿足測定3~5個半衰期時樣品中的藥物濃度，或Cmax的1/10~1/20時的藥物濃度，其準確度應(yīng)在真實濃度的80%~120%范圍內(nèi)，RSD應(yīng)小于20%。應(yīng)由至少5個標(biāo)準樣品測試結(jié)果證明。第75頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（六）穩(wěn)定性目的：對含藥生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應(yīng)注意儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性。第76頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物分析方法（六）穩(wěn)定性1.冷凍條件下的穩(wěn)定性2.短期室溫穩(wěn)定性3.冷凍－解凍穩(wěn)定性4.貯備液穩(wěn)定性第77頁,共89頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)生物樣品內(nèi)藥物