電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷

關(guān)于電子顯微鏡的應(yīng)用與診斷電鏡的起始電子顯微鏡誕生于30年代初,但直到60年代以前,電子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要限于細(xì)胞生物學(xué)、微生物、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)等研究領(lǐng)域。60年代初期人們開始將電子顯微鏡應(yīng)用于人體病理標(biāo)本,通過對這些人體病理標(biāo)本的超微結(jié)構(gòu)分析,人們進(jìn)一步了解了疾病的病理變化及其發(fā)生機(jī)制,也同時(shí)認(rèn)識到電鏡做為一個(gè)新的診斷工具可直接為臨床服務(wù),為某些疾病的診斷提供重要的形態(tài)依據(jù)。第2頁,共33頁，2024年2月25日，星期天60年代、70年代是國際上診斷電鏡發(fā)展的黃金時(shí)代,越來越多的疾病通過電鏡檢查而得到確診,越來越多的病理學(xué)家認(rèn)識到了電鏡診斷的價(jià)值,電鏡逐漸成為病理診斷的一個(gè)基本工具,歐美國家中幾乎所有大的醫(yī)療中心及醫(yī)院都將電子顯微鏡用于疾病的研究和診斷。第3頁,共33頁，2024年2月25日，星期天電子顯微鏡在腎活檢診斷、疑難腫瘤的病理診斷、感染性疾病(病毒性,細(xì)菌性等)、代謝性疾病(貯積性疾病)、細(xì)胞外物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉樣變性)、組織細(xì)胞增生癥(郎格罕細(xì)胞增生性疾病)、纖毛運(yùn)動不能綜合征等特殊疾病的診斷中公認(rèn)起著重要的作用。第4頁,共33頁，2024年2月25日，星期天幾種常用電鏡技術(shù)1.1常規(guī)電鏡技術(shù)標(biāo)本經(jīng)固定后用microslicer切片以增加樣品量,取其中一部分(其余切片繼續(xù)保存)做快速常規(guī)包埋、定位及超薄切片,用透射電鏡觀察,整個(gè)過程2～3d。有些特殊結(jié)構(gòu)在器官組織中分布很少,而對于疾病診斷又很有意義。本方法是先切大量半薄切片,在光鏡下先找到這些特殊結(jié)構(gòu)(必要時(shí)可用美藍(lán)染色),然后再做原位包埋、超薄切片,透射電鏡觀察。雖然將光鏡和電鏡的結(jié)果結(jié)合起來分析增加了技術(shù)難度,但可使疾病的電鏡病理診斷結(jié)果更全面、可靠。第5頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.2電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)有些疾病在光鏡和常規(guī)電鏡的基礎(chǔ)上還不能完全確診,需結(jié)合電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)才能明確診斷。經(jīng)過篩選,常用于疾病診斷和鑒別診斷的酶主要有以下幾種[1]:第6頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(1)酸性磷酸酶,主要定位于溶酶體及高爾基體,是兩者的標(biāo)志酶;(2)葡萄糖262磷酸酶,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核膜,是兩者的標(biāo)志酶;(3)琥珀酸脫氫酶,定位于線粒體內(nèi)膜,是其標(biāo)志酶;(4)髓過氧化物酶,定位于粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的線粒體、核膜、高爾基體及胞質(zhì)顆粒,在原始細(xì)胞階段的白血病可依靠該酶來進(jìn)行細(xì)胞分型和鑒別診斷;(5)血小板過氧化物酶,定位于巨核細(xì)胞的核膜、線粒體及致密管道系統(tǒng),對巨核細(xì)胞性白血病的診斷有重要作用。第7頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.3免疫電鏡技術(shù)主要有兩種:一種是免疫凝集電鏡技術(shù),一般是抗原、抗體凝集經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察,多用于診斷病毒性感染疾病。另一種是免疫電鏡定位技術(shù),是用標(biāo)記物標(biāo)記后定位,常用標(biāo)記物有3種[2]:第8頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(1)辣根過氧化物酶,相對分子質(zhì)量較小,標(biāo)記后可用光鏡及電鏡觀察,多用于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記;(2)膠體金顆粒,可根據(jù)需要制備成不同大小(常用直徑為5、10、15nm),能用于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞表面標(biāo)記;(3)鐵蛋白顆粒,相對分子質(zhì)量較大,一般用于細(xì)胞表面標(biāo)記,但不如膠金標(biāo)記優(yōu)越,現(xiàn)使用較少。根據(jù)標(biāo)本來源、種類和疾病診斷的需要可做包埋前和包埋后標(biāo)記,也可進(jìn)行單標(biāo)、雙標(biāo)或多標(biāo)。第9頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.4掃描電鏡技術(shù)可觀察到組織及細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),適用于較大范圍內(nèi)觀察病變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu),在白血病細(xì)胞分類中起重要作用。如毛細(xì)胞性白血病,除了在細(xì)胞內(nèi)找到典型的板層體外,另一個(gè)特征是細(xì)胞表面有大量多而長的微絨毛突化可以分析和判斷對疾病的治療情況。另外遺傳性口形細(xì)胞增多癥可利用掃描電鏡分型,為臨床治療提供依據(jù)。第10頁,共33頁，2024年2月25日，星期天免疫組織化學(xué)技術(shù)與電鏡的比較進(jìn)入80年代后,免疫組織化學(xué)技術(shù)開始引入病理診斷。由于此項(xiàng)技術(shù)的不斷改進(jìn),特異性及敏感性逐漸得到改善,操作技術(shù)不斷地簡化并規(guī)范化,又由于單克隆技術(shù)的發(fā)展使得大量有診斷價(jià)值的抗體得以臨床應(yīng)用,因此這項(xiàng)技術(shù)很快便在人體各種疾病,尤其在腫瘤的診斷中廣泛開展起來,直至今日方興未艾。第11頁,共33頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)時(shí)許多人認(rèn)為人類疾病的診斷進(jìn)入了免疫組化的時(shí)代,免疫組化將取代電子顯微鏡成為人類疾病診斷的一個(gè)重要的手段。不少醫(yī)療單位越來越忽視電鏡在疾病研究、診斷中的作用,甚至錯(cuò)誤地認(rèn)為今后的疾病診斷將不再需要電子顯微鏡的助,有了操作簡單、快捷、費(fèi)用低廉的免疫組化技術(shù)以及近年來發(fā)展起來的分子雜交、PCR、細(xì)胞基因分析等更加先進(jìn)的診斷技術(shù),足以解決人體疾病診斷中的難題。第12頁,共33頁，2024年2月25日，星期天要想讓電鏡仍然發(fā)揮出應(yīng)有的或更大的作用,首先要進(jìn)一步提高和發(fā)展現(xiàn)有的電鏡技術(shù):進(jìn)一步縮短電鏡標(biāo)本的制備時(shí)間,發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用新型固定劑、包埋材料等,簡化規(guī)范電鏡標(biāo)本制備過程,并適用于多種類型的標(biāo)本(新鮮標(biāo)本及甲醛固定甚至石蠟包埋后的標(biāo)本,實(shí)體組織及液體標(biāo)本等);第13頁,共33頁，2024年2月25日，星期天進(jìn)一步簡化,改進(jìn)電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、膠體金免疫電鏡技術(shù)等,不但保持其原來的特異性、敏感性,更要降低對標(biāo)本的要求,更適應(yīng)于臨床的需要,使得這些技術(shù)能更廣泛地應(yīng)用于常規(guī)電鏡診斷。其次,除了進(jìn)一步拓寬常規(guī)透射電鏡、掃描電鏡、電子能量色散譜、微區(qū)電子衍散等。第14頁,共33頁，2024年2月25日，星期天在人體疾病診斷中的應(yīng)用范圍,還要積極地將掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡等新型的超顯微鏡引入到人體疾病的研究及診斷中,開拓病理診斷的新領(lǐng)域。除了開展活檢、外檢組織的電鏡檢查,還要積極開展細(xì)胞學(xué)的電鏡檢查。第15頁,共33頁，2024年2月25日，星期天此外,要提高電鏡診斷水平,還要注意電鏡工作者、病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生之間的協(xié)作,注意培養(yǎng)提高動用臨床醫(yī)療知識、病理知識、超微結(jié)構(gòu)觀察及電鏡技術(shù)綜合知識的能力,積累各種疾病電鏡診斷的要點(diǎn),總結(jié)出各種疾病診斷的標(biāo)準(zhǔn)。要積極參與電鏡診斷各種形式的學(xué)術(shù)交流,不斷充實(shí)、更新知識。第16頁,共33頁，2024年2月25日，星期天在我國,電子顯微鏡以往主要建立于大專院校及科研究院(所),部分電鏡工作者缺乏電鏡診斷的經(jīng)驗(yàn),而臨床醫(yī)生、病理醫(yī)生往往又缺乏電鏡知識,忽視電鏡在疾病診斷中的作用。因此,要推動我國電鏡診斷的進(jìn)一步發(fā)展,積極進(jìn)電鏡工作者、病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生之間的協(xié)作及溝通顯得尤為重要。第17頁,共33頁，2024年2月25日，星期天電鏡在疾病診斷中的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域中,運(yùn)用電鏡技術(shù)觀察研究生物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)已有近半個(gè)世紀(jì)歷史,而將電鏡技術(shù)用于臨床研究和疾病診斷也有近四十年時(shí)間。幾十年來電鏡作為一種先進(jìn)手段,在醫(yī)學(xué)科學(xué)的研究和臨床疾病診斷方面作出了重大貢獻(xiàn)。第18頁,共33頁，2024年2月25日，星期天1.電鏡對病毒性疾病的診斷病毒性疾病的診斷離不開電鏡,電子顯微術(shù)是確定各種病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)最有用的工具。傳統(tǒng)的超薄切片可供觀察感染細(xì)胞內(nèi)病毒的大小、形態(tài)、排列及其復(fù)制組裝、成熟的過程以及某些有包膜病毒的芽生成熟的部位和病毒包涵體的形態(tài)特征[3]。第19頁,共33頁，2024年2月25日，星期天依據(jù)電鏡下病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,包括衣殼的對稱性、殼微粒數(shù)和排列方式、核衣殼在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制組裝的部位、病毒體的形態(tài)和大小以及螺旋對稱核衣殼的直徑等,再結(jié)合病毒的核酸和蛋白分子生物學(xué)特性,可以對致病病毒進(jìn)行鑒定和分類。電鏡負(fù)染技術(shù)是一種快速簡便的操作程序,也是病毒性致病因子電鏡診斷常用的方法,在新病毒的發(fā)現(xiàn)中作出了重要貢獻(xiàn)。免疫電鏡技術(shù)的應(yīng)用更提高了病毒快速診斷的敏感性和特異性[4]。第20頁,共33頁，2024年2月25日，星期天另外,電鏡技術(shù)對研究某些病毒感染的發(fā)病機(jī)理也很有幫助。例如新近Geisbert等[5]報(bào)道了馬爾堡出血熱病人的電鏡觀察結(jié)果是先前無人報(bào)道過的。他們發(fā)現(xiàn)在胰島中有病毒感染,在其他中,巨噬細(xì)胞是最早受病毒攻擊的靶細(xì)胞。肝細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞以及纖維母細(xì)胞也是病毒復(fù)制的重要部位。第21頁,共33頁，2024年2月25日，星期天2.電鏡對腫瘤的診斷病理科醫(yī)生對腫瘤的診斷,主要依賴于光鏡,輔以免疫組織化學(xué)等技術(shù)。一般講,使用這些技術(shù),絕大部分腫瘤都得以明確診斷。但有些腫瘤的診斷及鑒別診斷,電鏡所起的作用很大,如無色素性黑色素瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、嗜酸細(xì)胞瘤、肌源性腫瘤、軟組織腺泡狀肉瘤及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等[6]。第22頁,共33頁，2024年2月25日，星期天對于這些腫瘤,光鏡有時(shí)難以明確診斷。免疫組織化學(xué)方法雖然對腫瘤的診斷發(fā)揮了很大作用,但由于腫瘤的多向分化及部分市售免疫組化試劑存在明顯的交叉反應(yīng)性,所以應(yīng)用免疫組化染色診斷腫瘤有一定的局限性。而電鏡技術(shù)的應(yīng)用為腫瘤的診斷提供了一條新的途徑。如對神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷即為佐證。神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤都含有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒,不論其分化程度如何,是原發(fā)的還是轉(zhuǎn)移的,在電鏡下都很易識別。另外,通過對此類瘤細(xì)胞分泌顆粒及其他超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的識別,還可以對一些內(nèi)分泌腫瘤作進(jìn)一步的功能分類。以上這些都是光鏡難以做到的。第23頁,共33頁，2024年2月25日，星期天電鏡對下列腫瘤的鑒別診斷可起到重要作用:①區(qū)別癌、黑色素瘤和肉瘤;②區(qū)別腺癌和間皮瘤;③在前縱膈腫瘤中可區(qū)別胸腺瘤、胸腺類癌、惡性淋巴瘤和生殖細(xì)胞瘤;④在小圓細(xì)胞瘤中可區(qū)別神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胚胎性橫紋肌瘤、Ewing氏肉瘤、惡性淋巴瘤和小細(xì)胞癌;⑤在軟組織梭形細(xì)胞瘤中可區(qū)別纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤和惡性神經(jīng)鞘瘤;⑥區(qū)別梭形細(xì)胞癌和癌肉瘤[7]。第24頁,共33頁，2024年2月25日，星期天3.電鏡對非腫瘤性疾病的診斷電鏡對各器官系統(tǒng)疾病的病理診斷,在許多單位受到重視,但用得最多的是腎臟活檢和某些皮膚疾病的診斷。對腎臟病的診斷,通常將光鏡、免疫熒光光鏡和電鏡觀察三者結(jié)合。第25頁,共33頁，2024年2月25日，星期天在某些腎病的診斷中,電鏡起著決定作用:①遺傳性腎炎。此病腎小球的組織學(xué)改變無特殊,唯電鏡檢查方能作出準(zhǔn)確診斷;②腎小球薄基底膜病。光鏡檢查無助于對此病的診斷,電鏡檢查是唯一能夠明確此病的手段;③Farbry氏病。此病的嗜鋨顆粒和板層小體只有在電鏡下才能觀察到;④腎淀粉樣變及纖維性腎小球病。此類疾病在電鏡下見到類淀粉纖維由無分枝的周期性細(xì)纖維組成(直徑8~10nm,腎淀粉樣變)或微管狀纖維結(jié)構(gòu)(直徑約20nm,纖維性腎小球病),因而可作出肯定的診斷[8]。第26頁,共33頁，2024年2月25日，星期天4.電鏡獲得的信息對光鏡診斷結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充或修正臨床上,有時(shí)僅靠光鏡難以對疾病明確診斷,而電鏡具有高分辨性能,可以獲得許多不為光鏡捕捉到的信息,往往就是這些信息,為疾病的正確診斷提供了寶貴的資料,甚至修正光鏡的診斷結(jié)論。Wills等[9]對200例病例進(jìn)行了光鏡診斷和電鏡診斷的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)有15%的病例靠電鏡提供新的信息得以診斷。第27頁,共33頁，2024年2月25日，星期天圖1a,1b

Merkel細(xì)胞癌胞漿內(nèi)有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒。Bar=015μm,012μm

Fig.1a,1b

NeurosecretorygranulesinthecytoplasmofMerkelcellcarcinoma.Bar=015μm,012μm第28頁,共33頁，2024年2月25日，星期天電鏡的展望新世紀(jì)來臨之際,回眸過去的一百年中人類對疾病的認(rèn)識有了非常深刻的變化,疾病診斷的技術(shù)手段也有了巨大的進(jìn)步,這其中無疑包含了電子顯微鏡所作的偉大貢獻(xiàn)。有人指出的那樣:“沒有電子顯微鏡增添新的認(rèn)識和知識,就不可能有對疾病或病理過程的了解。時(shí)至今日,電子顯微鏡并未像某些人預(yù)測的那樣隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展而進(jìn)入了末日。相反,近年來越來越多的事實(shí)證明電鏡在人體各種疾病的診斷中仍然發(fā)揮著重要的作用。第29頁,共33頁，2024年2月25日，星期天無疑,對于許多非腫瘤性疾病,由于常常無特異的抗原表達(dá),因此其診斷仍依賴于特異的光鏡及電鏡形態(tài)表現(xiàn)。如腎活檢,除了組織學(xué)特點(diǎn)外,電鏡觀察還能揭示免疫復(fù)合物沉積的確切部位及形態(tài),基底膜及各種細(xì)胞的變化等特點(diǎn),這些仍然是重要的診斷依據(jù),因此腎活檢標(biāo)本目前都常規(guī)地進(jìn)行電鏡檢查。通過檢測各種細(xì)胞器、肌絲的變化及特殊的超微結(jié)構(gòu),電鏡對許多代謝性疾病、細(xì)胞內(nèi)?外異常物質(zhì)沉積性疾病(如淀粉性變性)、肌病的診斷也還起著關(guān)鍵的作用第30頁,共33頁，2024年2月25日，星期天而這些疾病目前尚無法采用免疫組化的方法來診斷。對于許多感染性疾病,目前國內(nèi)外雖然已建立了免疫學(xué)或PCR等診斷技術(shù),但在不知道具體病原體的情況下,電鏡檢查仍然是最快捷、可靠的診斷手段。此外,由于不少病原體(如病毒,弓形蟲等)在電鏡下具有明確可靠的形態(tài)特點(diǎn),易于辨認(rèn),而免疫學(xué)及PCR檢測可出現(xiàn)程度不等的假陰性或假陽性,因此電鏡檢查目前仍公認(rèn)為最可靠的診斷技術(shù)[10]。第31頁,共33頁，2024年2月25日，星期天參考文獻(xiàn)1.顏永碧,陸月良,王英電鏡技術(shù)在病理學(xué)診斷中的應(yīng)用[J]第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2003年6月,第24卷2.鄭尊,于秉學(xué),陳德蕙電鏡診斷