核酸核酸的理化性質(zhì)

關(guān)于核酸核酸的理化性質(zhì)一、核酸的一般理化性質(zhì)1、狀態(tài)：DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；2、溶解性：微溶于水，不溶于一般有機(jī)溶劑（乙醇沉淀核酸），其鈉鹽易溶于水；3、粘度：DNA的粘度極高，而RNA粘度要小得多；（一）物理性質(zhì)第2頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。3',5'-磷酸二酯鍵斷裂切割點(diǎn)不同，產(chǎn)物不同，如3‘-單核苷酸，5’-單核苷酸水解磷酸二酯鍵的酶：核酸酶（二）穩(wěn)定性核酸可被酸、堿或酶水解成各種組分，即核酸的降解第3頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）堿水解：RNA可在室溫下被稀堿水解成核苷酸，而DNA對(duì)堿穩(wěn)定。例如，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA幾乎完全水解，隨著磷酸二酯鍵的斷裂，先生成2′,3′-環(huán)核苷酸中間物，最后生成2′-或3′-磷酸核苷的混合物；DNA由于不存在2′-OH，不能被堿水解。

利用上述性質(zhì)可測(cè)定RNA的堿基組成或除去溶液中的RNA。1、酸或堿水解

DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度不同。第4頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）酸水解

酸性條件下，磷酸二酯鍵比糖苷鍵穩(wěn)定，嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵穩(wěn)定性最差。若對(duì)核酸進(jìn)行酸水解，首先生成的是無(wú)嘌呤酸。因此對(duì)核酸進(jìn)行部分水解時(shí)，很少采用酸水解。1、酸或堿水解

第5頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)底物不同：DNA水解酶（DNase）

RNA水解酶（RNase）根據(jù)作用方式：核酸外切酶(限制性和非限制性)

核酸內(nèi)切酶(5′→3′或3′→5′)核酸內(nèi)切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈中間開(kāi)始，在某個(gè)位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3′-端或5′-端）開(kāi)始，逐個(gè)水解切除核苷酸3、酶水解核酸酶分類(lèi)第6頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天5’5’3’3’外切位點(diǎn)外切位點(diǎn)內(nèi)切位點(diǎn)內(nèi)切位點(diǎn)第7頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)室常用的RNase有3種：

牛胰核糖核酸酶（RNaseI）：專(zhuān)一性?xún)?nèi)切酶，產(chǎn)物為3′-嘧啶核苷酸及以3′-嘧啶核苷酸為結(jié)尾的寡核苷酸。核糖核酸酶T1：產(chǎn)物為3′-嘌呤核苷酸及以3′-嘌呤核苷酸為結(jié)尾的寡核苷酸。核糖核酸酶T2：主要作用于Ap殘基，將tRNA降解為3′-腺苷酸為末端的寡核苷酸。3、酶水解第8頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)室常用的DNase有2種：

牛胰脫氧核糖核酸酶I（DNaseI）：水解產(chǎn)物為平均長(zhǎng)度為4個(gè)核苷酸，以5′-P為末端的寡聚核苷酸。牛胰脫氧核糖核酸酶II（DNaseII）：水解產(chǎn)物為平均長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸，以3′-P為末端的寡聚核苷酸。3、酶水解第9頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天

非特異性核酸酶：即水解DNA又水解RNA的酶。有些非特異性核酸酶也作為工具酶應(yīng)用到科學(xué)研究中。如：蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶均是水解DNA和RNA的外切核酸酶。前者從3′端開(kāi)始，生成5′單核苷酸，后者從

5′末端開(kāi)始，生成3′單核苷酸。

D-核糖與濃鹽酸和苔黑酚（甲基間苯二酚）共熱產(chǎn)生綠色；

D-2-脫氧核糖與酸和二苯胺一同加熱產(chǎn)生藍(lán)紫色。以此區(qū)別DNA和RNA，或作為定量測(cè)定基礎(chǔ)。

第10頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、核酸的紫外吸收第11頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA或RNA的定量A260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA(dsDNA)40μg/ml單鏈DNA(ssDNAorRNA)20μg/ml寡核苷酸確定樣品中核酸的純度

純DNA:A260/A280=1.8

純RNA:A260/A280=2.0紫外吸收的應(yīng)用第12頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為4～4.5，RNA的等電點(diǎn)為2～2.5。三、核酸的酸堿性質(zhì)及等電點(diǎn)第13頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、概念：指核酸的雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀態(tài)的過(guò)程2、變性因素：加熱、酸堿度改變、有機(jī)溶劑、酰胺、尿素等。3、DNA變性的實(shí)質(zhì)：DNA雙鏈間氫鍵的斷裂，生物活性喪失。四、核酸的變性、復(fù)性與雜交

（一）核酸的變性第14頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天第15頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、特點(diǎn)：并不涉及共價(jià)鍵的斷裂，即磷酸二酯鍵不發(fā)生斷裂，因此一級(jí)結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。5、變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸堿滴定曲線改變。

（一）核酸的變性第16頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。6、DNA的熱變性和熔解溫度（Tm）第17頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA的解鏈曲線連續(xù)加熱DNA的過(guò)程中以溫度相對(duì)于A260值作圖，所得的曲線稱(chēng)為解鏈曲線。解鏈過(guò)程中，紫外吸光度的變化達(dá)到最大變化值的一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度，稱(chēng)為熔解溫度，用Tm表示，也稱(chēng)解鏈溫度。熔解溫度(meltingtemperature,Tm)第18頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）G-C對(duì)含量：G-C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通過(guò)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：（G+C)%=(Tm-69.3)×2.44（2）溶液的離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度較低的介質(zhì)中DNA的Tm較低。在純水中，DNA在室溫下變性。（3）溶液的pH值和變性劑影響Tm的因素第19頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、復(fù)性：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程退火：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)，可以復(fù)性，又稱(chēng)“退火”。

（二）核酸的復(fù)性第20頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、復(fù)性表現(xiàn)：許多理化性質(zhì)可恢復(fù)，生物活性得以部分恢復(fù)。

3、影響復(fù)性的因素：分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；DNA的復(fù)性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過(guò)程的條件有關(guān)。

（二）核酸的復(fù)性第21頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA復(fù)性第22頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天

核酸雜交：核酸變性后進(jìn)行復(fù)性的過(guò)程中，來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段，按堿基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子的過(guò)程。 雜交雙鏈可在DNA與DNA鏈之間，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補(bǔ)核酸鏈實(shí)現(xiàn)復(fù)性。 核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。

（三）核酸的雜交第23頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天核酸分子雜交第24頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天第25頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用最廣。原理：堿基配對(duì)；聚合酶可催化在試管內(nèi)合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈；雙脫氧核苷酸無(wú)3’-OH，合成到此終止；可