液相色譜柱選擇的方法及建議 液相色譜常見問題解決方法

第第頁液相色譜柱選擇的方法及建議液相色譜常見問題解決方法一、液相色譜柱選擇方法|液相色譜柱選擇的簡(jiǎn)單思路

1.確定分別目的確定你的應(yīng)用是否要求高分別度、短分析時(shí)間、高靈敏度、長(zhǎng)柱壽命，低的操縱本錢等等。

2.評(píng)估分析物的化學(xué)性質(zhì)評(píng)估分析物的化學(xué)性質(zhì).諸如化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性、穩(wěn)定性等等。

3.選擇合適的色譜柱了解色譜填料的物理和化學(xué)性質(zhì)。

二、液相色譜柱選擇方法|液相色譜柱選擇的條件

填料基質(zhì)

1.硅膠基質(zhì)：純度高本錢低，強(qiáng)度大，化學(xué)修飾輕易，但pH值范圍有限。大多硅膠基質(zhì)填料在pH2—8之間穩(wěn)定，但經(jīng)過特別修飾的硅膠鍵合相可以穩(wěn)定在pH1.5—10、

2.聚合物基質(zhì)：應(yīng)用pH值范圍寬，溫度穩(wěn)定（高溫可以達(dá)到80度以上），機(jī)械強(qiáng)度小。

顆粒外形

大多現(xiàn)代HPLC填料都是球形顆粒，但有時(shí)是不規(guī)定的顆粒。球形顆粒供應(yīng)較低的柱壓、較高的柱效和穩(wěn)定性以及較長(zhǎng)的柱壽命在使用高粘度的活動(dòng)相時(shí)；不規(guī)定顆粒有較大比表面積和相對(duì)低廉的價(jià)格。

顆粒粒徑

粒徑越小柱效越高、分別度越高，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致較高柱壓降。選擇1.5—3m的填料以解決一些多而雜樣品,UPLC可以使用1.5m的填料；另外10m或更大粒徑的填料用作半制備或制備柱。

含碳量

含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例，與比表面積和鍵合覆蓋度等有關(guān)。高含碳量進(jìn)步柱容量、辨別率及分析時(shí)間，用于要求高分別度的多而雜樣品；低含碳量分析時(shí)間短、呈現(xiàn)不同的選擇性，用于快速分析簡(jiǎn)單樣品及需要高含水活動(dòng)相條件的樣品。一般C18的含碳量在7—19%不等。

孔徑和比表面積

HPLC吸附介質(zhì)是多孔的顆粒，盡大多數(shù)的反應(yīng)表面于孔內(nèi)。因此，分子必需進(jìn)進(jìn)孔內(nèi)才能被吸附和分別。

孔徑和比表面積是相輔相成的兩個(gè)概念?？讖叫”缺砻娣e大，反之亦然。比表面積大，加添樣品與鍵合相之間的反應(yīng)，加添保存,上樣量和多而雜成分的分別度；比表面積小，平衡時(shí)間快，適合梯度分析。

孔容和機(jī)械強(qiáng)度

孔容，又稱“孔體積”。指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反應(yīng)填料的機(jī)械強(qiáng)度?？左w積大的填料相對(duì)孔體積小的填料機(jī)械強(qiáng)度要略弱?？左w積為1.5mL/g或更小的填料大多用于HPLC分別，而孔體積大于1.5mL/g的填料使用于尺寸排阻色譜和低壓色譜。

封端封端

封端能夠降低極性堿性化合物由于與暴露的硅醇基相互作用而產(chǎn)生的拖尾峰。不封端鍵合相相對(duì)封端鍵合相見產(chǎn)生不同的選擇性，尤其是極性樣品。

氣相色譜和液相色譜微型化中的關(guān)鍵問題

在器微型化過程中,尺寸的縮小不僅要考慮材料的性質(zhì)和制造上的可能,還要從原理上考慮尺寸縮小后所帶來的一系列問題。這些問題包括：

（1）分別系統(tǒng)中被調(diào)配的分子個(gè)數(shù)是否大于106,由于只有大于106才能得到符合統(tǒng)計(jì)結(jié)果的數(shù)據(jù)；

（2）因分別通道尺寸縮小,自然提高了單位柱長(zhǎng)的效率,但是總長(zhǎng)度的削減可能使總分別效能遠(yuǎn)低于常規(guī)；

（3）對(duì)于質(zhì)量敏感型檢測(cè)器,經(jīng)過分別柱后單位時(shí)間內(nèi)到達(dá)檢測(cè)器的分子個(gè)數(shù)是否充分檢測(cè)原理所要求的最小數(shù)目；

（4）對(duì)于濃度型檢測(cè)器,到達(dá)檢測(cè)池的分子數(shù)目是否能充分符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目；

（5）檢測(cè)微區(qū)內(nèi)的外加能量密度是否超過被檢測(cè)分子所能承受的極限；

（6）微量流動(dòng)相的輸送與掌控；

（7）因材料尺寸的縮小,表面層氧化或腐蝕對(duì)器件功能的影響。最后,色譜儀器微型化所帶來的好處不僅僅是單位長(zhǎng)度分別效率的提高,而是總分別本領(lǐng)的保持甚至提高；不僅僅是分別系統(tǒng)或某個(gè)部件的微型化,而是整體的微型化；不僅僅是質(zhì)量靈敏度的提高,而是濃度靈敏度的保持或提高；不僅僅是能量和物質(zhì)的低消耗,而是使用的便利和友好；不僅僅是整體尺寸的縮小,更緊要的是整機(jī)的穩(wěn)定性和牢靠性的提高!

下面分別討論上述7個(gè)問題。

（1）色譜分別的基本原理是有符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律數(shù)目的分子群經(jīng)過不斷的兩相調(diào)配和分子碰撞,利用其調(diào)配系數(shù)的差異來達(dá)到分別的目的。這是一個(gè)宏觀參數(shù)。當(dāng)分子數(shù)目低于這個(gè)數(shù)目時(shí),就會(huì)偏離統(tǒng)計(jì)規(guī)律而顯現(xiàn)所謂的漲落現(xiàn)象。分子數(shù)目越少,漲落現(xiàn)象越嚴(yán)重。當(dāng)分子數(shù)目低于103個(gè)時(shí),已沒有精準(zhǔn)的色譜保留規(guī)律,因此也就失去了宏觀意義下的分別規(guī)律。一般地,保證符合統(tǒng)計(jì)規(guī)律的分子數(shù)目是106個(gè)。

例如內(nèi)徑30μm的填充毛細(xì)管液相色譜（μ2HPLC）柱或毛細(xì)管電泳柱,若分別保持10萬/m和40萬/m的分別柱效,直接進(jìn)樣時(shí)不過載的進(jìn)樣量分別為40pL（1pL=10—12L）和115pL,分子總數(shù)分別是112×1012～112×1014和415×1010～415×1012、樣品中含量低至1～0.01μL/L（對(duì)μ2HPLC）或低至20～0.2μL/L（對(duì)CE）的組分就不能充分106個(gè)分子的數(shù)目要求,分別過程中就會(huì)顯現(xiàn)上述問題。所以,上述分別系統(tǒng)對(duì)濃度高于這個(gè)指標(biāo)的樣品分別時(shí)可以有重復(fù)的保留時(shí)間。假如考慮檢測(cè)方面的限制[參見下述的（3）和（4）,痕量分析中用粗內(nèi)徑的填充色譜柱總是優(yōu)于微型色譜柱。

為了能進(jìn)行痕量分析,微型分別分析系統(tǒng)往往接受樣品預(yù)濃縮技術(shù)以補(bǔ)償濃度靈敏度的不足。但為此而進(jìn)展的技術(shù)也同樣適用于常規(guī)分別分析系統(tǒng),同樣可以提高常規(guī)儀器的靈敏度,除非樣品量受到嚴(yán)格限制。

（2）45年前的色譜柱理論已經(jīng)指出,毛細(xì)管開口柱的內(nèi)徑越小,或填充柱的填料粒度越小,色譜柱的分別效率就越高。毛細(xì)管電泳亦然,只是理論上有些不同,如有散熱問題和塞子流型的特點(diǎn)。微型化中普遍接受的細(xì)內(nèi)徑分別柱并不是微型儀器的專利,所能達(dá)到的高柱效也不是近來才認(rèn)得到的。假如在現(xiàn)有常規(guī)儀器中使用這種等效內(nèi)徑的色譜柱,再適當(dāng)改進(jìn)進(jìn)樣技術(shù)和檢測(cè)器,就會(huì)有與微型色譜或芯片電泳同樣的單位柱長(zhǎng)的柱效,同時(shí)還可