液相色譜分析法

關(guān)于液相色譜分析法學(xué)習(xí)要求掌握液相色譜法的基本原理，了解液相色譜儀的構(gòu)造，液相色譜法的分類。掌握液相色譜分析方法的選擇以及定性定量分析方法；了解HPLC的應(yīng)用。學(xué)習(xí)方法建議1.通過文獻(xiàn)查閱，理解方法的應(yīng)用及與理論的結(jié)合點(diǎn)。2.采用對(duì)比的方式進(jìn)行GC與HPLC異同點(diǎn)對(duì)照，有助于對(duì)兩種色譜方法的理解。3.從儀器結(jié)構(gòu)上講搞清楚“高效“的含義。4.對(duì)于高效液相色譜的類型，重點(diǎn)在液—固色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法的固定相、流動(dòng)相的特點(diǎn)及其選擇。第2頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第一講概述一高效液相色譜技術(shù)的出現(xiàn)

二、高效HPLC與經(jīng)典LC方法的比較四、液相色譜分離原理及分類三、HPLC與GC的比較第3頁,共33頁，2024年2月25日，星期天

液相色譜是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。早期，是在直徑1～5cm,長(zhǎng)50～

500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。即使這樣，流速仍然很低(＜1mL/min)，分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)！當(dāng)加壓增加流速(真空或空氣泵)時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但柱塔板高度Hmin也相應(yīng)增加了！或者說柱效下降了。為了解決分析時(shí)間及柱效問題，人們認(rèn)識(shí)到：最為有效地增加柱效的方法是減小填充物的粒徑（3~10m

）！直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問題。為保證柱流速，固定相顆粒直徑多在150～

200m范圍內(nèi)。即所謂的高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。一高效液相色譜技術(shù)的出現(xiàn)第4頁,共33頁，2024年2月25日，星期天高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；經(jīng)典方法靠重力加料，速度慢需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高：UV－10-9g,熒光檢測(cè)器－10-11g。HPLC

具有分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化等特點(diǎn),所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。（最高輸送壓力可達(dá)4.9

107Pa）(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬)

二、高效HPLC與經(jīng)典LC方法的比較第5頁,共33頁，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相的選擇：GC：有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用小；HPLC：采用的流動(dòng)相為液體或各種液體的混合，除了起運(yùn)載作用外，可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即流動(dòng)相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。分析對(duì)象及范圍：GC：只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物（占有機(jī)物總數(shù)的20%）HPLC：可分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物（占80%）操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行?；纠碚摚篖C的塔板理論、速率方程與GC基本一致；基本概念：LC的術(shù)語（如保留值等）、定量、定性方法與GC一致。相同點(diǎn)不同點(diǎn)三、HPLC與GC的比較第6頁,共33頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)分離機(jī)制不同HPLC分離的實(shí)質(zhì)

根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。樣品分子與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用力的大小，決定色譜過程的保留行為。液固吸附色譜化合鍵合色譜離子交換色譜分子排阻色譜親和色譜HPLC的分類四、液相色譜分離原理及分類第7頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第二講高效液相色譜儀島津HPLC結(jié)構(gòu)組成一、高壓輸液系統(tǒng)二、進(jìn)樣系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)四、檢測(cè)器記錄系統(tǒng)第8頁,共33頁，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)示意圖高壓泵將儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器輸入色譜柱，待分離試樣由進(jìn)樣器注入，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱分離，被分離組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由記錄儀記錄或經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到色譜圖。第9頁,共33頁，2024年2月25日，星期天He儲(chǔ)液瓶分布器過濾2

m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計(jì)注樣閥分離柱檢測(cè)器儲(chǔ)液器HPLC儀器詳解第10頁,共33頁，2024年2月25日，星期天一、高壓輸液系統(tǒng)貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔很約2m，可防止顆粒物進(jìn)行泵內(nèi)。脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。高壓輸液泵：由貯液器、高壓輸液泵、過濾器、梯度洗脫裝置等組成。梯度洗脫裝置：在分離過程中逐漸改變流動(dòng)相組成的裝置。

對(duì)輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動(dòng)、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。第11頁,共33頁，2024年2月25日，星期天低壓梯度：如果只有一個(gè)泵，可采用低壓混合設(shè)計(jì)（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高壓泵輸出）；高壓梯度：如有兩個(gè)或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。梯度洗脫方式：低壓梯度（外梯度）、高壓梯度（內(nèi)梯度）第12頁,共33頁，2024年2月25日，星期天二、進(jìn)樣系統(tǒng)

與GC相比，HPLC柱要短得多，因此，由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對(duì)要小些。即HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器的死體積。對(duì)進(jìn)樣器的要求：密封性好、死體積小、重復(fù)性好、對(duì)系統(tǒng)的壓力和流量波動(dòng)小，便于自動(dòng)化。（1）隔膜注射進(jìn)樣：微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。（2）高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好進(jìn)樣方式第13頁,共33頁，2024年2月25日，星期天裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱六通閥進(jìn)樣進(jìn)色譜柱出口樣品量管第14頁,共33頁，2024年2月25日，星期天三、分離系統(tǒng)第15頁,共33頁，2024年2月25日，星期天三、分離系統(tǒng)內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱形多為直形，內(nèi)部充微粒固定相。分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。柱長(zhǎng)多為10~30cm，內(nèi)徑為2~5mm色譜柱要求：耐高壓、柱接頭的死體積盡可能小，

柱溫一般為室溫或接近室溫。常規(guī)柱：分析性、制備性快速柱微量柱色譜柱按柱長(zhǎng)和內(nèi)徑不同分類第16頁,共33頁，2024年2月25日，星期天四、檢測(cè)器、記錄系統(tǒng)兩種基本類型的檢測(cè)器：對(duì)HPLC檢測(cè)器的要求p292溶質(zhì)型檢測(cè)器（選擇型）僅對(duì)被分離組分有響應(yīng)，如紫外、熒光及電化學(xué)檢測(cè)器等。至今還沒有即靈敏、通用又可梯度洗脫的檢測(cè)器。總體檢測(cè)器（普通型）對(duì)試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)。如示差折光、介電常數(shù)檢測(cè)器等。第17頁,共33頁，2024年2月25日，星期天四、檢測(cè)器、記錄系統(tǒng)（一）紫外吸收檢測(cè)器（應(yīng)用廣泛）特點(diǎn)：對(duì)流量和溫度的變化不敏感，適用于梯度洗脫，檢出限可達(dá)5×10－10g。溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長(zhǎng)不能小于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液原理：依據(jù)組分對(duì)特定紫外光的選擇性吸收，其濃度與吸光度的關(guān)系符合比爾定律。HPLC分析中，約80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測(cè)器應(yīng)用很廣。注意第18頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（二)光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD：DiodeArrayDetector）可獲得吸光度、波長(zhǎng)、時(shí)間三維彩色圖形，得到更多的信息。快速掃描紫外可見分光檢測(cè)器?？焖賿呙琛怆姸O管陣列（PDA）檢測(cè)所獲得的三維色譜-光譜圖波長(zhǎng)可的松氟美松皮質(zhì)酮吸光度第19頁,共33頁，2024年2月25日，星期天(三)熒光檢測(cè)器（FlorescenceDetector，F(xiàn)D）(四)示差折光檢測(cè)器(DifferdntialRefractometerDetector,)（五)電化學(xué)檢測(cè)器(六)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器

許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。靈敏度比UV檢測(cè)器高1~3個(gè)數(shù)量級(jí)；但線性范圍不如UV檢測(cè)器。靈敏度比UV的低，為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。

其它檢測(cè)器：MS、IR等第20頁,共33頁，2024年2月25日，星期天LC檢測(cè)器性能一覽表了解以上檢測(cè)器的特點(diǎn)、性能、適用范圍、靈敏度等。第21頁,共33頁，2024年2月25日，星期天第三講HPLC方法簡(jiǎn)介根據(jù)固定相和分離機(jī)理不同HPLC分為四類：

尺寸排阻（凝膠）色譜離子交換和離子色譜固體吸附劑吸附方法固定相平衡類型不相溶液體間的分配固定液體涂于載體有機(jī)基團(tuán)鍵合于固體表面液體和鍵合體表面間的分配離子交換樹脂離子交換液體附于多孔聚合物分配／篩析流動(dòng)相：與GC流動(dòng)相不同，HPLC流動(dòng)相為溶劑（又叫淋洗液、洗脫劑），它既有運(yùn)載作用，又和固定相一樣，與組分相互作用。液固吸附色譜分配色譜鍵合相色譜液液色譜第22頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（1）對(duì)待測(cè)物具一定極性和選擇性；（2）與檢測(cè)器相匹配；（3）高純度：否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時(shí)可使截止波長(zhǎng)增加；（4）化學(xué)穩(wěn)定性好；（5）適宜的粘度：粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。理想的流動(dòng)相應(yīng)有下列特性：第23頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（一）液固吸附色譜固定相吸附劑：(硅膠吸附劑應(yīng)用最廣。)極性的：無機(jī)氧化物、硅膠、氧化鋁、分子篩；非極性的：活性碳。選擇流動(dòng)相的基本原則：極性大的試樣用極性強(qiáng)的流動(dòng)相極性小的試樣用極性低的流動(dòng)相分析對(duì)象：分離極性不同的試樣或異構(gòu)體。保留機(jī)制：組分分子和流動(dòng)相分子對(duì)吸附劑表面活性中心發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，與吸附劑性質(zhì)類似的容易被吸附，呈現(xiàn)較高的保留值?；诟鹘M分在吸附劑表面上具有不同的吸附能力而分離。第24頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（二）液液分配色譜流動(dòng)相：為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。固定相：常用硅膠為載體，在其表面涂漬固定液。常用固定液：按極性由高到低為：

,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角鯊?fù)?SQ)。正相液相色譜（Normal-phaseChromatography）反相液相色譜（Reversed-phaseChromatography）固定相：極性（如水、甲醇）流動(dòng)相：非極性（如烷烴）固定相：非極性（如烷烴）流動(dòng)相：極性（如水、甲醇）主要用于分離極性化合物，按極性小的流出。主要用于分離非極性化合物，極性大的先流出，第25頁,共33頁，2024年2月25日，星期天待測(cè)物在互不相溶的兩相中溶解度不同，故分配系數(shù)不同，被測(cè)物在兩相間反復(fù)多次分配，產(chǎn)生差速遷移，實(shí)現(xiàn)分離。保留機(jī)制根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型。由于固定液與載體松散的結(jié)合，固定液易流失，分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不能采用高流速和梯度洗脫。

機(jī)械涂漬型為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。

化學(xué)鍵合型通過共價(jià)鍵將有機(jī)固定液結(jié)合到在載體（硅膠）而得到各種性能的固定相。鍵合相色譜第26頁,共33頁，2024年2月25日，星期天（三）鍵合相色譜固定相分類：按有機(jī)基團(tuán)的性質(zhì)分：極性、非極性、離子交換等。特點(diǎn)可用于正相色譜和反相色譜，HPLC約75%使用反相色譜法。固定相（非極性鍵合相）：如十八烷基鍵合硅膠Octadecysilance、即C18又稱ODS固定相）流動(dòng)相（極性大）：甲醇－水、乙腈－水、無機(jī)鹽的緩沖液等多用于多環(huán)芳烴等低極性化合物分離；改變流動(dòng)相配比也可分離極性化合物；緩沖