菌種選育保藏與復(fù)壯

關(guān)于菌種選育保藏與復(fù)壯111.04.2024Contents第一節(jié)食品發(fā)酵與釀造工業(yè)菌種第二節(jié)菌種選育

第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯第四節(jié)國內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)第2頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)食品發(fā)酵與釀造工業(yè)菌種第3頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.20244一、現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)對菌種的要求（1）非病源菌，不產(chǎn)生有害活性物或毒素；（2）發(fā)酵周期短，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生能力強(qiáng)；（3）高轉(zhuǎn)化，易分離純化，低成本，高質(zhì)量；（4）生長繁殖力強(qiáng)，速度快，較強(qiáng)產(chǎn)孢能力；（5）原料廣，價廉，易被微生物利用、轉(zhuǎn)化；（6）對添加的前體物質(zhì)有耐受能力；（7）菌種純，遺傳特性穩(wěn)定，抗噬菌體能力強(qiáng)。第4頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)常見菌種第5頁,共56頁，2024年2月25日，星期天類別微生物名稱產(chǎn)物用途細(xì)菌短桿菌谷氨酸食用、醫(yī)藥短桿菌肌苷酸食用、醫(yī)藥枯草桿菌淀粉酶葡萄糖、糊精、酒精發(fā)酵、啤酒釀造枯草桿菌蛋白酶醬油速釀、飼料巨大芽孢桿菌葡萄糖異構(gòu)酶由葡萄糖制造果糖酵母菌酒精酵母酒精醫(yī)藥、食用假絲酵母單細(xì)胞蛋白酵母菌體蛋白脆壁酵母乳糖酶食品工業(yè)霉菌黑曲霉檸檬酸食用、醫(yī)藥黑曲霉柚苷酶、酸性蛋白酶柑橘罐頭脫除苦味黑曲霉單寧酶、糖化酶分解單寧、酶精制、酒精發(fā)酵工業(yè)棲土曲霉蛋白酶同枯草桿菌蛋白酶根霉糖化酶、甾體激素葡萄糖制造、酒精廠糖化、醫(yī)藥毛霉蛋白酶腐乳生產(chǎn)青霉菌葡萄糖氧化酶蛋白除葡萄糖、脫氧、食品罐頭貯存木霉菌纖維素酶淀粉和食品加工、飼料黃曲霉菌淀粉酶食用、化工紅曲霉糖化酶、紅曲色素葡萄糖制造、酒精廠糖化、調(diào)色劑米曲霉蛋白酶醬油釀造第6頁,共56頁，2024年2月25日，星期天枯草芽孢桿菌第7頁,共56頁，2024年2月25日，星期天戊糖片球菌第8頁,共56頁，2024年2月25日，星期天植物乳桿菌第9頁,共56頁，2024年2月25日，星期天多粘類芽孢桿菌第10頁,共56頁，2024年2月25日，星期天釀酒酵母第11頁,共56頁，2024年2月25日，星期天粉狀畢赤酵母第12頁,共56頁，2024年2月25日，星期天紅葡萄濃縮汁中的酵母菌形態(tài)第13頁,共56頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)朊假絲酵母第14頁,共56頁，2024年2月25日，星期天黑曲霉第15頁,共56頁，2024年2月25日，星期天黑曲霉第16頁,共56頁，2024年2月25日，星期天青霉第17頁,共56頁，2024年2月25日，星期天米曲霉蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等第18頁,共56頁，2024年2月25日，星期天根霉第19頁,共56頁，2024年2月25日，星期天綠色木霉產(chǎn)生微晶纖維素酶，羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶，可完全水解纖維素。第20頁,共56頁，2024年2月25日，星期天擬康氏木霉產(chǎn)生纖維素酶，羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶，可完全水解纖維素。第21頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)菌種選育

第22頁,共56頁，2024年2月25日，星期天一、新菌種的分離與篩選利用人工環(huán)境，使樣品中目標(biāo)微生物成為優(yōu)勢菌。樣品來源越廣泛，獲得新菌種的可能性越大。純種分離的常用方法有平板劃線分離法、稀釋分離法和涂布分離法。樣品采集富集培養(yǎng)分離純化一般生產(chǎn)性能的測定通過初篩和復(fù)篩的方法來確定。性能鑒定第23頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（一）樣品采集①原則

樣品來源越廣泛，獲得新菌種的可能性越大。②土壤采樣方法土壤的有機(jī)質(zhì)含量和通風(fēng)狀況（5～25cm深度）土壤的pH和植被狀況地理條件季節(jié)條件細(xì)菌、放線菌：耕地、菜園和近郊土壤；酵母菌：果園樹根的土壤中；霉菌：動植物殘體及霉腐土層中；黑曲霉：稻場、谷物堆積處。pH＜7.0：霉菌、酵母菌居多pH7.0～7.5：細(xì)菌、放線菌豐富第24頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）富集培養(yǎng)①富集培養(yǎng)的目的利用人工環(huán)境，使樣品中目標(biāo)微生物成為優(yōu)勢菌。②富集培養(yǎng)的方法控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分控制培養(yǎng)條件③富集培養(yǎng)的方式分批培養(yǎng)（Batchculture）連續(xù)培養(yǎng)（Continuousculture）分批補(bǔ)料培養(yǎng)（Fed-batchculture）第25頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.202426（三）純種分離（1）平板劃線分離法（2）稀釋分離法（3）涂布分離法（4）毛細(xì)管分離法（5）小滴分離法第26頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.202428初篩和復(fù)篩（1）初篩（定性——粗放！）平板篩選（變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈）搖瓶發(fā)酵篩選（2）復(fù)篩（定量——精確?。?個菌株重復(fù)3～5瓶，精確分析如酶活力單位、耐酒精程度等。第28頁,共56頁，2024年2月25日，星期天溶磷細(xì)菌的平板篩選(5d)第29頁,共56頁，2024年2月25日，星期天青霉菌溶磷實(shí)驗高效溶磷的真菌菌株第30頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（四）性能鑒定生產(chǎn)性能測定通常使用初篩和復(fù)篩的方法確定。直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株。我們常將這些自然界中直接獲得的新菌株稱為進(jìn)一步育種工作的原始菌株或出發(fā)菌株。毒性試驗若毒性大而且無法排除者應(yīng)予以淘汰。種屬鑒定第31頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、自然選育自然選育的定義利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)變異，通過分離、篩選，排除劣質(zhì)性狀的菌株，選擇出維持原有生產(chǎn)水平或具有更優(yōu)良生產(chǎn)性能的高產(chǎn)菌株，達(dá)到純化與復(fù)壯菌種、保持穩(wěn)定生產(chǎn)性能的目的。其主要原理是微生物群體分離。自然選育的方法（1）通過表現(xiàn)形態(tài)淘汰不良菌株；（2）考察目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；（3）進(jìn)行遺傳基因型純度試驗，考察菌種純度；（4）傳代穩(wěn)定性試驗：斜面?zhèn)?-5代。第32頁,共56頁，2024年2月25日，星期天自然選育第33頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

資料顯示，某些芽孢桿菌具有分解和利用葡聚糖的能力，請設(shè)計方案從自然界中篩選一產(chǎn)葡聚糖酶的菌株，并簡要分析各主要步驟的依據(jù)。05年江南大學(xué)微生物(發(fā)酵)考研試題第34頁,共56頁，2024年2月25日，星期天三、誘變育種誘變育種：指人為地、有意識地將對象生物置于誘變因子中，使該生物體發(fā)生突變，從這些突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。提高了菌種發(fā)生突變的頻率和變異幅度，提高獲優(yōu)機(jī)率。突變：在自然狀況下發(fā)生的突變—自然突變（10-6~10-9）誘變：人為地利用物理或化學(xué)因素誘發(fā)的突變（10-4~10-5）誘變劑：能夠顯著提高突變頻率的物理或化學(xué)因素。第35頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（一）常見誘變劑及作用基本原理物理誘變因子紫外線、X射線、快中子等化學(xué)誘變因子硫酸二乙酯（DES）、亞硝酸、吖啶橙生物誘變因子噬菌體、轉(zhuǎn)座子等第36頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）誘變基本方法及影響因素誘變劑的選擇：作用機(jī)理；突變譜誘變劑量選擇：最適劑量（致死率70-80%時）增效（變）劑：氯化鋰（0.5%）外部環(huán)境條件：如溫度、氧氣、pH、水分出發(fā)菌株的選擇：生產(chǎn)菌株、野生菌株出發(fā)菌株的生理狀態(tài)：細(xì)菌--對數(shù)生長期；幼年孢子；營養(yǎng)體；濕態(tài)敏感（真菌：106cfu/mL孢子懸浮液；細(xì)菌：108cfu/mL的菌液）誘變效應(yīng)的測定：直接法和濃縮法，培養(yǎng)后測定目的產(chǎn)物量誘變方法：單因子、復(fù)合誘變優(yōu)良突變株的篩選方法：隨機(jī)篩選或半理性化篩選第37頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（三）誘變育種流程第38頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)菌種保藏與復(fù)壯第39頁,共56頁，2024年2月25日，星期天一、菌種的衰退菌種衰退（degeneration）生產(chǎn)菌種或篩選出來的較優(yōu)良菌株，由于進(jìn)行接種傳代或保藏之后，群體某些形態(tài)特征及生理特征逐漸減退甚至完全喪失的現(xiàn)象。由于菌種的自發(fā)突變使其典型性狀，特別是產(chǎn)量性狀發(fā)生負(fù)變的現(xiàn)象。菌種退化的主要表現(xiàn)產(chǎn)量下降，目的代謝產(chǎn)物減少，原料轉(zhuǎn)化率下降；生長速度緩慢，目的代謝產(chǎn)物合成能力下降，發(fā)酵周期延長；產(chǎn)孢子能力變?nèi)酰咦有纬蓴?shù)量減少；抗逆性減弱；形態(tài)畸形等。第40頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（一）引起菌種退化變異的因素遺傳基因型的分離絲狀真菌、多細(xì)胞組成、有的單核、有的多核，遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)有多樣性的復(fù)雜性，為群體繁殖，往往出現(xiàn)遺傳基因型的分離---數(shù)量遺傳的自體調(diào)節(jié)現(xiàn)象。自發(fā)變異的產(chǎn)生負(fù)向變異為多數(shù)，結(jié)果：目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量下降，生長逐步變?nèi)踝兟?，孢子形成能力低下等。原因：長期保藏；頻繁傳代（例斜面保藏、發(fā)酵廠種子制備）；菌體在代謝過程中產(chǎn)生具有誘變作用的物質(zhì)；存在增變。人工誘變導(dǎo)致的退化變異基因突變（退化的根本原因）連續(xù)傳代（加速退化的直接原因）第41頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）衰退的防止控制傳代次數(shù)：不超過7代，易變異的不過5代砂土管、凍干管保藏的原種，開啟不能超過3次，以防污染。選擇良好保藏方法：保證菌不死、不衰、保存活性及原有典型性狀良好的培養(yǎng)條件：注意斜面菌株的培養(yǎng)條件（保藏、活化培養(yǎng)基）采用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種產(chǎn)孢子霉菌細(xì)菌第42頁,共56頁，2024年2月25日，星期天二、菌種的復(fù)壯廣義——是指在菌種的生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識的進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定，從而使菌種的生產(chǎn)性能逐步提高的一種措施。狹義——指菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后，再通過純種分離和性能測定的辦法從衰退的群體中找出尚未衰退的個體，以達(dá)到保持該菌種原有典型性狀的一種措施。復(fù)壯的方法純種分離淘汰已衰退的個體通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯第43頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（一）純種分離

菌落純用稀釋平板法或平板劃線法，取得單細(xì)胞菌落，再通過菌落和菌的特征分析和性能測定，獲得具有原來性狀或性狀更好的菌株。菌株純（細(xì)胞純）只有菌絲的：在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取只有一個核的菌；有孢子的：在顯微鏡下用毛細(xì)管挑取單個孢子。一般只要求達(dá)到菌落純的水平——用于退化不太嚴(yán)重的情況。

純度操作方法適用情況菌落純稀釋平板法、劃線法、表面皿法退化不嚴(yán)重菌株純（細(xì)胞純）單細(xì)胞分離法（或二者結(jié)合）退化不嚴(yán)重第44頁,共56頁，2024年2月25日，星期天（二）淘汰已衰退的個體可通過物理、化學(xué)方法處理菌體或孢子，使其大部分死亡(80%以上)，存活的菌多為生長健壯者，從中選出優(yōu)良菌株。用10%酒精處理，能耐之的一般為原菌株（啤酒酵母）。在培養(yǎng)基內(nèi)加青霉素，抗藥性較強(qiáng)的細(xì)菌一般為原菌株(產(chǎn)抗生素)。適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度加乳酸，淘汰酸奶菌種中的衰退個體。一般可將單菌落分離與培養(yǎng)條件綜合進(jìn)行復(fù)壯，效果更好第45頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.202446（一）保藏原理

根據(jù)微生物的生理、生化特性，人工地創(chuàng)造條件，使之達(dá)到不死、不衰、不污染的休眠狀態(tài)。（二）菌種保藏方法斜面低溫保藏法（最簡單的菌種保存法）礦油保藏法載體吸附保藏法冷凍真空干燥法（最佳的微生物菌體保存法之一）液氮超低溫保藏法（當(dāng)前最理想的保存法）低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)三、菌種的保藏第46頁,共56頁，2024年2月25日，星期天CICC保藏菌種第47頁,共56頁，2024年2月25日，星期天GIMCC保藏菌種第48頁,共56頁，2024年2月25日，星期天

請從保藏原理、保藏適應(yīng)對象、保藏期及優(yōu)缺點(diǎn)等方面對各種保藏方法進(jìn)行比較說明。第49頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.202450保藏方法保藏原理適用菌種保藏期優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)斜面低溫液體石蠟油保藏砂土管保藏冷凍真空干燥液氮超低溫第50頁,共56頁，2024年2月25日，星期天11.04.202451保藏方法保藏原理適用菌種保藏期優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)斜面低溫低溫霉菌,放線菌,酵母菌,細(xì)菌均可霉菌,放線菌及有芽孢細(xì)菌4-6月;酵母菌3月;無芽孢細(xì)菌約1月簡便有效，適合非長期保藏的菌種保期短,傳代頻繁,易變異液體石蠟油封保藏低溫、缺氧霉菌,放線菌,酵母菌霉菌,放線菌,芽孢細(xì)菌2~3年,酵母菌1-2年,無芽孢細(xì)菌約1年制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需常移種直立保存,不便攜帶，不適石蠟碳源或敏感者砂土管保藏低溫、缺氧、缺營養(yǎng)細(xì)菌芽孢,霉菌、放線菌的孢子2-5年簡單易行工作量大,費(fèi)人力，不適干敏性無孢菌冷凍真空干燥低溫(-20℃以下)、干燥、缺氧除少數(shù)不產(chǎn)孢子只產(chǎn)菌絲體的絲狀真菌外均可5-10年保藏期長，成活率高需特定設(shè)備、操作繁瑣,要求嚴(yán)格液氮超低溫超低溫(-150～-196℃)各類微生物10年以上保存時間長需特殊設(shè)備，操作復(fù)雜第51頁,共56頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)國內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)

第52頁,共56頁，2024年2月25日，星期天單位簡稱單位名稱單位簡稱單位名稱CCCCM中國微生物菌種保藏管理委員會NICPBP衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所ACCC中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心MCCC中國海洋微生物菌種保藏管理中心CICC中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CACC中國抗生素微生物菌種保藏中心CMCC中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心IMB中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所CGMCC中國普通微生物菌種保藏中心SIA四川抗生素研究所ISF中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所IANP石家莊華北制藥廠抗生素研究所AS中國科學(xué)院微生物研究所CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心IFFI中國食品發(fā)酵工業(yè)