微生物檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)定方法及微生物檢驗(yàn)報(bào)告單

微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)的測(cè)定1原理微生物活體數(shù)量的測(cè)定方法，常用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法。它是通過(guò)將樣品制成均勻的一系列不同稀釋度的稀釋液，再取一定的稀釋液接種，使其均勻分布于培養(yǎng)皿中特定的培養(yǎng)基內(nèi)，最后根據(jù)在平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)計(jì)算出每克（或mL）樣品中的活菌數(shù)量。2材料和儀器2.1平皿：φ90mm。2.2無(wú)菌錐形瓶：容量250mL，500mL。2.3無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL個(gè)度）,10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。2.4滅菌鍋。2.5恒溫培養(yǎng)箱2.6涂棒。2.7酒精燈。2.8超凈工作臺(tái)。2.9磁力攪拌器。2.10漩渦振蕩器3檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)下圖。檢樣10g樣品+90mL無(wú)菌生理水，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇至少3個(gè)適宜樣品稀釋均液方法①↙↘方法②各取1mL分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿中加入15mL~20mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。在培養(yǎng)皿中加入15mL~20mL平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，凝固。然后在每皿中加入0.2mL樣品稀釋液，涂布均勻。↘↙在36℃±1℃倒置培養(yǎng)24～48小時(shí)計(jì)算各平板菌落數(shù)計(jì)算菌落總數(shù)4操作步驟4.1培養(yǎng)基和試劑的配制4.1.1平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（最常用）牛肉膏5g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g蒸餾水1LpH7.0～7.2將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH值，分裝錐形瓶中，121℃高壓滅菌30分鐘。4.1.2無(wú)菌生理鹽水的配制：稱(chēng)取8.5g氯化鈉溶解于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌30分鐘。4.2樣品的稀釋?zhuān)?.2.1固體樣品：稱(chēng)取10g固體樣品置于盛有90mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中（內(nèi)裝數(shù)粒無(wú)菌玻璃珠），在旋轉(zhuǎn)式搖床上200r/min充分振蕩30min，制成1：10的樣品均液，即10-1稀釋液。4.2.2用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品均液1mL（吸取前需要搖勻1：10稀釋液），緩慢加入盛有9mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不能觸及稀釋液面），用漩渦振蕩器振蕩，混合均勻，制成1：100的樣品稀釋均液。4.2.3按照4.2.2操作程序，制備10倍系列樣品稀釋液，每遞增稀釋一次，換用一次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。4.2.4根據(jù)對(duì)樣品活菌數(shù)量的估計(jì)，選擇3~4個(gè)適宜稀釋度的樣品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀釋液）。4.2平板接種與培養(yǎng)接種方法1：用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器分別吸取不同稀釋度的菌懸液1mL于一個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中（每個(gè)稀釋度做三個(gè)重復(fù)），再在培養(yǎng)皿中分別倒入10～15mL已融化并冷卻至45~50℃的培養(yǎng)基，蓋好平皿蓋子，趁熱輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混合均勻，冷凝后在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～２８ｈ，培養(yǎng)溫度為36℃±1℃注：比如1000億CFU樣品稀釋梯度可選擇為：10-8，10-9，10-10。接種方法2：用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀釋液均液于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平板上，將稀釋液涂布均勻，吸附，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～２８ｈ，培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。同時(shí)以無(wú)菌水作空白對(duì)照。（計(jì)算時(shí)需要把0.2mL的倍數(shù)也計(jì)算在稀釋倍數(shù)內(nèi)）注：比如1000億CFU樣品稀釋梯度可選擇為：10-7，10-8，10-9。４.3菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)借用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，以防遺漏。記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits,CFU）表示4.3.1選取菌落數(shù)在30~300之間，無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用3個(gè)平行平板的平均數(shù)。4.3.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時(shí)，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。4.3.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。4.3.4若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，需重新測(cè)定。5菌落總數(shù)的計(jì)算方法5.1若只有一個(gè)稀釋度的菌落數(shù)30~100的適宜計(jì)數(shù)范圍之間時(shí)，計(jì)算三個(gè)平行的平均值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克中菌落總數(shù)結(jié)果。5.2若有2個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在30~100的適宜計(jì)數(shù)范圍之間，應(yīng)按兩者菌落數(shù)之比值來(lái)決定；若其比例小于2應(yīng)計(jì)數(shù)兩者的平均數(shù)；若大于2則計(jì)數(shù)其中稀釋度較小的菌落總數(shù)。5.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均不在30~100之間時(shí)，其中一部分小于30或大于100時(shí)，則以最接近30或100的平均菌落數(shù)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)計(jì)算。5.4若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)離30~100范圍較遠(yuǎn)時(shí)，建議選擇適合的稀釋倍數(shù)重新測(cè)定。表1樣品活菌數(shù)量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)記錄樣品菌落數(shù)（個(gè)）活菌數(shù)（cfu/g或cfu/mL）平行1平行2平行3平均注意事項(xiàng)：檢測(cè)過(guò)程中盡量避免環(huán)境雜菌干擾，操作人員要用70％的酒精擦拭手和桌子。微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/ml）大腸菌群（MPN/ml）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/ml）大腸菌群（MPN/ml）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/㎡）大腸菌群（MPN/㎡）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/㎡）大腸菌群（MPN/㎡）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/）大腸菌群（MPN/）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)日期取樣地點(diǎn)驗(yàn)畢日期編號(hào)品名菌落總數(shù)（cfu/）大腸菌群（MPN/）結(jié)論檢驗(yàn)：復(fù)核：微生物檢驗(yàn)報(bào)告單檢驗(yàn)依據(jù)檢