純凈的目標(biāo)微生物可通過(guò)分離和純化獲得（第2課時(shí)）（教學(xué)課件）高二生物（浙科版2019選擇性必修3）

第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過(guò)化學(xué)信號(hào)實(shí)現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一章發(fā)酵工程第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)純凈的目標(biāo)微生物可通過(guò)

分離和純化獲得第2課時(shí)目

錄調(diào)整培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)(1)有些微生物需要以現(xiàn)成的有機(jī)物為食，如大多數(shù)細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物。(2)有些能利用光能或無(wú)機(jī)物氧化釋放的能量將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)物。(3)有些微生物為需氧型，有些微生物則是厭氧型。(4)有些微生物能固氮，而大多數(shù)微生物不能以N2作為氮源。(5)有些菌株由于突變或經(jīng)人工誘變后喪失了合成某種特定化合物的能力，必須從外界環(huán)境獲得該物質(zhì)才能生長(zhǎng)繁殖。一、調(diào)整培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物1．不同自然環(huán)境中生活著的微生物代謝類型不盡相同在培養(yǎng)光能自養(yǎng)型的藍(lán)細(xì)菌或藻類時(shí)，只需水和無(wú)機(jī)鹽提供，不需提供有機(jī)物，但必須提供光照。異養(yǎng)生物自養(yǎng)生物自養(yǎng)型微生物(藍(lán)細(xì)菌和藻類或者硝化細(xì)菌)異養(yǎng)型微生物(大多數(shù)細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物)需氧型微生物(醋酸桿菌)；厭氧型微生物(乳酸菌)兼性厭氧型微生物(酵母菌)固氮菌(以氮?dú)庾鳛榈?；非固氮菌(大多數(shù)微生物不能以氮?dú)庾鳛榈?常規(guī)微生物與營(yíng)養(yǎng)(某種氨基酸)依賴型微生物舉例

(1)某些異養(yǎng)型微生物在有有機(jī)物存在的情況下可同時(shí)將CO2轉(zhuǎn)變?yōu)樽陨淼奈镔|(zhì)，它們只是不以CO2為唯一碳源(主要的)(2)自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機(jī)物生長(zhǎng)。2．許多微生物的代謝方式并不唯一這種營(yíng)養(yǎng)方式的可變性提高了微生物在環(huán)境中的生存能力。紫色非硫細(xì)菌光照,無(wú)氧條件：CO2作為碳源；黑暗,有氧：利用有機(jī)物生長(zhǎng)3．培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度及比例都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)小思考：如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)，培養(yǎng)基的配方該如何設(shè)計(jì)？【答案】用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細(xì)菌分離出來(lái)。①蔗糖濃度

②C/N

③N/P在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)，培養(yǎng)基中的C/N為4∶1時(shí)菌體大量繁殖，當(dāng)比值降為3∶1時(shí)，菌體繁殖減緩。

選擇培養(yǎng)基4.選擇培養(yǎng)基

在培養(yǎng)基中添加（或減去）某種化學(xué)成分，使得只有某些特定的微生物能夠生長(zhǎng)，其它微生物均不能生長(zhǎng)，這樣的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。添加青霉素的培養(yǎng)基(篩選抗青霉素的超級(jí)細(xì)菌)無(wú)氮培養(yǎng)基(篩選固氮菌)以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基(篩選淀粉分解菌)以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基？(篩選尿素分解菌)

使用選擇培養(yǎng)基能從混雜的微生物群體中快速篩選出所需要種類的目標(biāo)微生物，也可以從已知種類的混雜的細(xì)胞群體中篩選出特定的細(xì)胞。二、能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)1、實(shí)驗(yàn)原理

當(dāng)培養(yǎng)基中只有尿素作為氮源時(shí)，只有能分泌脲酶的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。尿素（脲）是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物氮是所有生物的必須元素。尿素（脲）CNH2NH2O，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。植物無(wú)法直接吸收利用尿素

土壤中某些細(xì)菌能分泌脲酶，可以通過(guò)降解尿素作為其生長(zhǎng)所需要的氮源。二、能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)1、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)培養(yǎng)基中只有尿素作為氮源時(shí)，只有能分泌脲酶的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。尿素中性堿性氨根據(jù)菌落（固體培養(yǎng)基）周圍是否出現(xiàn)紅色區(qū)域，進(jìn)一步鑒定尿素分解菌。在相同培養(yǎng)條件下，圓形紅色區(qū)域愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強(qiáng)。紅色黃色能生長(zhǎng)的只有尿素分解菌么？如何確定？酚紅指示劑2、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊竽蛩嘏囵B(yǎng)基(以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基)3、實(shí)驗(yàn)材料用具土壤樣品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，瓊脂，瓊脂糖，葡萄糖，K2HPO4，酚紅，蒸餾水，尿素溶液，三角瓶，燒杯，培養(yǎng)皿，有塞試管，試管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，裝有75%酒精的廣口瓶，涂布器，酒精燈，火柴，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱等。從有哺乳動(dòng)物排泄物的地方取得土樣瓊脂為混合物含氮，瓊脂糖為純凈物，不含氮對(duì)尿素進(jìn)行過(guò)濾滅菌

瓊脂和瓊脂糖瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成成分，其優(yōu)點(diǎn)是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培養(yǎng)基固化；

實(shí)驗(yàn)是用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑，其目的是：盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以非尿素為氮源的細(xì)菌利用，有利于對(duì)這類細(xì)菌的篩選。①制備培養(yǎng)基4、實(shí)驗(yàn)步驟②滅菌③倒平板④制備土壤細(xì)菌懸液⑤接種---涂布分離⑥培養(yǎng)⑦觀察4、實(shí)驗(yàn)方法步驟（1）制備培養(yǎng)基LB全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基蛋白胨：1g酵母提取液0.48gNaCl：1g瓊脂：2g尿素培養(yǎng)基葡萄糖：0.1gNaCl：0.48gK2HPO4：0.48g瓊脂糖：2g酚紅：1mg尿素：40mL對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組尿素在制備培養(yǎng)基階段先不加置于250mL三角瓶，加水至100mL，三角瓶加上封口膜待滅菌①LB固體培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（121℃，1kg/cm2,15min）②尿素固體培養(yǎng)基G6玻璃砂漏斗過(guò)濾除菌（尿素）兩種培養(yǎng)基能否均用高壓蒸汽滅菌法？培養(yǎng)基滅菌高壓蒸汽滅菌（112℃，500g/cm2,30min）（2）滅菌培養(yǎng)基滅菌器具滅菌蒸餾水滅菌--制備無(wú)菌水稀釋細(xì)菌懸液高壓蒸汽滅菌（121℃，1kg/cm2,15min）操作環(huán)境滅菌（2）滅菌（3）倒平板培養(yǎng)基冷卻至60℃，超凈工作臺(tái)內(nèi)向尿素固體培養(yǎng)基中加入已滅菌的尿素溶液，搖勻后分裝至4個(gè)培養(yǎng)皿，冷卻至凝固。LB固體平板，尿素固體平板各4個(gè)。酒精燈旁2個(gè)9ml無(wú)菌水1g土壤10-3,10-4...得10-2的菌懸液99ml無(wú)菌水（4）制備土壤細(xì)菌懸液取土樣1gQ1:取得土樣后需要滅菌（）×Q2:欲獲得土壤中微生物，需要將土樣放入水中震蕩，使微生物分布在水中。此處所用的水要用（）A、自來(lái)水B、蒸餾水C、無(wú)菌水D、都可以C（4）制備土壤細(xì)菌懸液取土樣1g10-2土壤稀釋液＋99ml無(wú)菌水震蕩10min10-3土壤稀釋液取0.5ml＋4.5ml無(wú)菌水10-4土壤稀釋液取0.5ml＋4.5ml無(wú)菌水10-5土壤稀釋液梯度稀釋注意：取樣時(shí)，盡量只取懸液。（4）制備土壤細(xì)菌懸液

不按照稀釋度由大到小的順序依次操作會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果先取用稀釋度小的溶液，微生物濃度大，再用同一移液器吸取稀釋度大的菌液，就會(huì)提高后者的細(xì)菌數(shù)目，從而導(dǎo)致較大的統(tǒng)計(jì)誤差。涂布器使用前如何滅菌？保存在75%酒精中，酒精燈外火焰燃燒除酒精。微量移液器的使用第一檔第二檔嚴(yán)禁超越兩端極限量程使用結(jié)束后，將刻度調(diào)回最大量程微量移液器的使用（6）培養(yǎng)倒置，37℃，24-48h5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：LB培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的數(shù)量時(shí)，應(yīng)統(tǒng)計(jì)哪個(gè)稀釋度的培養(yǎng)皿?為什么?應(yīng)統(tǒng)計(jì)稀釋度為10-3的3個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)后取平均值。因?yàn)檫@個(gè)濃度的培養(yǎng)皿中菌落數(shù)比較適中，計(jì)數(shù)的結(jié)果誤差較小。為什么同一稀釋度下，LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比尿素培養(yǎng)基上多？為什么某一稀釋度下，尿素培養(yǎng)基上只有部分菌出現(xiàn)紅色圈？能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)1.不按照稀釋度由大到小的順序依次操作會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果先取用稀釋度小的溶液，微生物濃度大，再用同一移液器吸取稀釋度大的菌液，就會(huì)提高后者的細(xì)菌數(shù)目，從而導(dǎo)致較大的統(tǒng)計(jì)誤差。2.應(yīng)統(tǒng)計(jì)稀釋度為10-3的3個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)后取平均值。因?yàn)檫@個(gè)濃度的培養(yǎng)皿中菌落數(shù)比較適中，計(jì)數(shù)的結(jié)果誤差較小。3.這些微生物能夠合成脲酶而將尿素分解成氨。氨可使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，培養(yǎng)基pH升高，含酚紅指示劑的培養(yǎng)基變成紅色。而且，紅色環(huán)帶與菌落面積之比越大，說(shuō)明該菌落分解尿素的作用越強(qiáng)。討論（P21）

4.意見(jiàn)①：合理，因?yàn)樽陨痰⑸锬茉诠痰傅淖饔孟?，將N2轉(zhuǎn)化為可利用的氮源，故可在沒(méi)有氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。意見(jiàn)②：不合理，因?yàn)镕培養(yǎng)皿中微生物總數(shù)相對(duì)少于E培養(yǎng)皿，所以如果延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基仍有可能改變顏色。意見(jiàn)③：不合理，這些可能是能直接吸收尿素并作為氮源的微生物。可以挑取培養(yǎng)基未變色區(qū)域的菌落，清洗除去細(xì)胞表面的培養(yǎng)基后接種在無(wú)氮源的培養(yǎng)基上，觀察其生長(zhǎng)情況，從而證明其是否為能固氮的微生物。能分解尿素的微生物的分離與計(jì)數(shù)討論（P21）(1)尿素固體培養(yǎng)基既是選擇培養(yǎng)基也是鑒別培養(yǎng)基(4)尿素遇高溫會(huì)分解，所以需進(jìn)行過(guò)濾除菌，然后加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基中(2)土樣必須用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，否則無(wú)法判斷最后菌種來(lái)源于未滅菌的水還是土壤(