純凈的目標微生物可通過分離和純化獲得（第2課時）（教學課件）高二生物（浙科版2019選擇性必修3）

第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過化學信號實現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一節(jié)體液調(diào)節(jié)是通過化學信號實現(xiàn)的調(diào)節(jié)第一章發(fā)酵工程第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)通過下丘腦控制內(nèi)分泌系統(tǒng)第二節(jié)純凈的目標微生物可通過

分離和純化獲得第2課時目

錄調(diào)整培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)(1)有些微生物需要以現(xiàn)成的有機物為食，如大多數(shù)細菌、真菌和原生動物。(2)有些能利用光能或無機物氧化釋放的能量將CO2轉變?yōu)橛袡C物。(3)有些微生物為需氧型，有些微生物則是厭氧型。(4)有些微生物能固氮，而大多數(shù)微生物不能以N2作為氮源。(5)有些菌株由于突變或經(jīng)人工誘變后喪失了合成某種特定化合物的能力，必須從外界環(huán)境獲得該物質才能生長繁殖。一、調(diào)整培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方式可有目的地培養(yǎng)某種微生物1．不同自然環(huán)境中生活著的微生物代謝類型不盡相同在培養(yǎng)光能自養(yǎng)型的藍細菌或藻類時，只需水和無機鹽提供，不需提供有機物，但必須提供光照。異養(yǎng)生物自養(yǎng)生物自養(yǎng)型微生物(藍細菌和藻類或者硝化細菌)異養(yǎng)型微生物(大多數(shù)細菌、真菌和原生動物)需氧型微生物(醋酸桿菌)；厭氧型微生物(乳酸菌)兼性厭氧型微生物(酵母菌)固氮菌(以氮氣作為氮源)；非固氮菌(大多數(shù)微生物不能以氮氣作為氮源)常規(guī)微生物與營養(yǎng)(某種氨基酸)依賴型微生物舉例

(1)某些異養(yǎng)型微生物在有有機物存在的情況下可同時將CO2轉變?yōu)樽陨淼奈镔|，它們只是不以CO2為唯一碳源(主要的)(2)自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機物生長。2．許多微生物的代謝方式并不唯一這種營養(yǎng)方式的可變性提高了微生物在環(huán)境中的生存能力。紫色非硫細菌光照,無氧條件：CO2作為碳源；黑暗,有氧：利用有機物生長3．培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的濃度及比例都會影響微生物的生長小思考：如果讓你配制一種培養(yǎng)基，將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養(yǎng)基的配方該如何設計？【答案】用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細菌分離出來。①蔗糖濃度

②C/N

③N/P在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時，培養(yǎng)基中的C/N為4∶1時菌體大量繁殖，當比值降為3∶1時，菌體繁殖減緩。

選擇培養(yǎng)基4.選擇培養(yǎng)基

在培養(yǎng)基中添加（或減去）某種化學成分，使得只有某些特定的微生物能夠生長，其它微生物均不能生長，這樣的培養(yǎng)基稱為選擇培養(yǎng)基。添加青霉素的培養(yǎng)基(篩選抗青霉素的超級細菌)無氮培養(yǎng)基(篩選固氮菌)以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基(篩選淀粉分解菌)以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基？(篩選尿素分解菌)

使用選擇培養(yǎng)基能從混雜的微生物群體中快速篩選出所需要種類的目標微生物，也可以從已知種類的混雜的細胞群體中篩選出特定的細胞。二、能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)1、實驗原理

當培養(yǎng)基中只有尿素作為氮源時，只有能分泌脲酶的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長。尿素（脲）是蛋白質降解的產(chǎn)物氮是所有生物的必須元素。尿素（脲）CNH2NH2O，會對環(huán)境造成污染。植物無法直接吸收利用尿素

土壤中某些細菌能分泌脲酶，可以通過降解尿素作為其生長所需要的氮源。二、能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)1、實驗原理當培養(yǎng)基中只有尿素作為氮源時，只有能分泌脲酶的微生物才能在該培養(yǎng)基中生長。尿素中性堿性氨根據(jù)菌落（固體培養(yǎng)基）周圍是否出現(xiàn)紅色區(qū)域，進一步鑒定尿素分解菌。在相同培養(yǎng)條件下，圓形紅色區(qū)域愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強。紅色黃色能生長的只有尿素分解菌么？如何確定？酚紅指示劑2、實驗目的要求尿素培養(yǎng)基(以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基)3、實驗材料用具土壤樣品，蛋白胨，酵母提取物，NaCl，瓊脂，瓊脂糖，葡萄糖，K2HPO4，酚紅，蒸餾水，尿素溶液，三角瓶，燒杯，培養(yǎng)皿，有塞試管，試管架，移液器，G6玻璃砂漏斗，裝有75%酒精的廣口瓶，涂布器，酒精燈，火柴，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱等。從有哺乳動物排泄物的地方取得土樣瓊脂為混合物含氮，瓊脂糖為純凈物，不含氮對尿素進行過濾滅菌

瓊脂和瓊脂糖瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機雜質和不溶性雜質。瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成成分，其優(yōu)點是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培養(yǎng)基固化；

實驗是用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑，其目的是：盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以非尿素為氮源的細菌利用，有利于對這類細菌的篩選。①制備培養(yǎng)基4、實驗步驟②滅菌③倒平板④制備土壤細菌懸液⑤接種---涂布分離⑥培養(yǎng)⑦觀察4、實驗方法步驟（1）制備培養(yǎng)基LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基蛋白胨：1g酵母提取液0.48gNaCl：1g瓊脂：2g尿素培養(yǎng)基葡萄糖：0.1gNaCl：0.48gK2HPO4：0.48g瓊脂糖：2g酚紅：1mg尿素：40mL對照組實驗組尿素在制備培養(yǎng)基階段先不加置于250mL三角瓶，加水至100mL，三角瓶加上封口膜待滅菌①LB固體培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌（121℃，1kg/cm2,15min）②尿素固體培養(yǎng)基G6玻璃砂漏斗過濾除菌（尿素）兩種培養(yǎng)基能否均用高壓蒸汽滅菌法？培養(yǎng)基滅菌高壓蒸汽滅菌（112℃，500g/cm2,30min）（2）滅菌培養(yǎng)基滅菌器具滅菌蒸餾水滅菌--制備無菌水稀釋細菌懸液高壓蒸汽滅菌（121℃，1kg/cm2,15min）操作環(huán)境滅菌（2）滅菌（3）倒平板培養(yǎng)基冷卻至60℃，超凈工作臺內(nèi)向尿素固體培養(yǎng)基中加入已滅菌的尿素溶液，搖勻后分裝至4個培養(yǎng)皿，冷卻至凝固。LB固體平板，尿素固體平板各4個。酒精燈旁2個9ml無菌水1g土壤10-3,10-4...得10-2的菌懸液99ml無菌水（4）制備土壤細菌懸液取土樣1gQ1:取得土樣后需要滅菌（）×Q2:欲獲得土壤中微生物，需要將土樣放入水中震蕩，使微生物分布在水中。此處所用的水要用（）A、自來水B、蒸餾水C、無菌水D、都可以C（4）制備土壤細菌懸液取土樣1g10-2土壤稀釋液＋99ml無菌水震蕩10min10-3土壤稀釋液取0.5ml＋4.5ml無菌水10-4土壤稀釋液取0.5ml＋4.5ml無菌水10-5土壤稀釋液梯度稀釋注意：取樣時，盡量只取懸液。（4）制備土壤細菌懸液

不按照稀釋度由大到小的順序依次操作會影響實驗結果。如果先取用稀釋度小的溶液，微生物濃度大，再用同一移液器吸取稀釋度大的菌液，就會提高后者的細菌數(shù)目，從而導致較大的統(tǒng)計誤差。涂布器使用前如何滅菌？保存在75%酒精中，酒精燈外火焰燃燒除酒精。微量移液器的使用第一檔第二檔嚴禁超越兩端極限量程使用結束后，將刻度調(diào)回最大量程微量移液器的使用（6）培養(yǎng)倒置，37℃，24-48h5.實驗結果：LB培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基在估算土壤中能分泌脲酶的微生物的數(shù)量時，應統(tǒng)計哪個稀釋度的培養(yǎng)皿?為什么?應統(tǒng)計稀釋度為10-3的3個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)后取平均值。因為這個濃度的培養(yǎng)皿中菌落數(shù)比較適中，計數(shù)的結果誤差較小。為什么同一稀釋度下，LB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比尿素培養(yǎng)基上多？為什么某一稀釋度下，尿素培養(yǎng)基上只有部分菌出現(xiàn)紅色圈？能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)1.不按照稀釋度由大到小的順序依次操作會影響實驗結果。如果先取用稀釋度小的溶液，微生物濃度大，再用同一移液器吸取稀釋度大的菌液，就會提高后者的細菌數(shù)目，從而導致較大的統(tǒng)計誤差。2.應統(tǒng)計稀釋度為10-3的3個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)后取平均值。因為這個濃度的培養(yǎng)皿中菌落數(shù)比較適中，計數(shù)的結果誤差較小。3.這些微生物能夠合成脲酶而將尿素分解成氨。氨可使培養(yǎng)基的堿性增強，培養(yǎng)基pH升高，含酚紅指示劑的培養(yǎng)基變成紅色。而且，紅色環(huán)帶與菌落面積之比越大，說明該菌落分解尿素的作用越強。討論（P21）

4.意見①：合理，因為自生固氮微生物能在固氮酶的作用下，將N2轉化為可利用的氮源，故可在沒有氮源的培養(yǎng)基上生長。意見②：不合理，因為F培養(yǎng)皿中微生物總數(shù)相對少于E培養(yǎng)皿，所以如果延長培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基仍有可能改變顏色。意見③：不合理，這些可能是能直接吸收尿素并作為氮源的微生物。可以挑取培養(yǎng)基未變色區(qū)域的菌落，清洗除去細胞表面的培養(yǎng)基后接種在無氮源的培養(yǎng)基上，觀察其生長情況，從而證明其是否為能固氮的微生物。能分解尿素的微生物的分離與計數(shù)討論（P21）(1)尿素固體培養(yǎng)基既是選擇培養(yǎng)基也是鑒別培養(yǎng)基(4)尿素遇高溫會分解，所以需進行過濾除菌，然后加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基中(2)土樣必須用無菌水進行稀釋，否則無法判斷最后菌種來源于未滅菌的水還是土壤(