生物強(qiáng)化處理

關(guān)于生物強(qiáng)化處理一、生物強(qiáng)化技術(shù)產(chǎn)生背景兩個(gè)基本概念Bioaugmentation：生物強(qiáng)化，生物增強(qiáng)，投菌法Bioremediation：生物修復(fù)，生物整治產(chǎn)生背景

二十世紀(jì)七十年代中期

Superbugsrescuewasteplant.(Anon,1977,ChemicalWeek)

對(duì)采用生物強(qiáng)化技術(shù)存在的爭議普遍存在適者生存第2頁,共47頁，2024年2月25日，星期天BioremediationandBioaugmentationBioremediation

willbedefinedastheuseofselectedmicroorganismstoaccomplishabiologicalcleanupofaspecifiedcontaminatedarea,suchassoilorwater.

Bioaugmentation

willbedefinedastheapplicationofselectedmicroorganismstoenhancethemicrobialpopulationsofanoperatingwastetreatmentfacilitytoimprovewaterqualityorloweroperatingcosts.Inotherwords,bioremediationdealswithafiniteprojectorarea,whilebioaugmentationinvolvesworkingtoimproveacontinuousprocess.

第3頁,共47頁，2024年2月25日，星期天二、生物強(qiáng)化技術(shù)的作用機(jī)理及特點(diǎn)作用機(jī)理直接作用共代謝作用基因水平轉(zhuǎn)移作用應(yīng)用特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)操作簡單，因地制宜，應(yīng)用靈活針對(duì)性強(qiáng)，見效快缺點(diǎn)

系統(tǒng)中高效菌數(shù)量和活性不易控制第4頁,共47頁，2024年2月25日，星期天共代謝就是對(duì)于一些有毒有害物質(zhì)，微生物不能以其為碳源和能源生長。但在其它基質(zhì)存在下能夠改變這種有害物的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其降解。如以甲烷、芳香烴、氨、異戊二烯和丙烯為主要基質(zhì)生長的一些菌可以產(chǎn)生一種氧合酶，這種酶可以共代謝三氯乙烯(TCE)。第5頁,共47頁，2024年2月25日，星期天生物強(qiáng)化作用機(jī)理第6頁,共47頁，2024年2月25日，星期天如何實(shí)現(xiàn)生物強(qiáng)化技術(shù)？.高效菌種的培育從自然界篩選構(gòu)建基因工程菌.高效菌種在投加系統(tǒng)內(nèi)的保持及活力表達(dá) 原生動(dòng)物捕食，水力流失，有毒有害物質(zhì)抑制，DO，pH微生物檢測技術(shù).對(duì)目標(biāo)物的有效去除或?qū)δ撤矫嫘阅艿母纳频?頁,共47頁，2024年2月25日，星期天三、生物強(qiáng)化菌劑的來源從自然界篩選構(gòu)建基因工程菌直接購買商業(yè)菌劑第8頁,共47頁，2024年2月25日，星期天從自然界篩選

高效菌種的步驟

選擇環(huán)境（水或土壤）分離適應(yīng)性菌株選擇特殊降解性菌株選擇高效菌株接受突變劑進(jìn)一步篩選增強(qiáng)酶活性增強(qiáng)胞外酶分泌增強(qiáng)效應(yīng)因子分子作用降低阻礙分子作用發(fā)酵培養(yǎng)單一菌株第9頁,共47頁，2024年2月25日，星期天搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵罐培養(yǎng)第10頁,共47頁，2024年2月25日，星期天菌劑富集反應(yīng)器（off-lineenrich-reactor)富集反應(yīng)器典型活性污泥工藝出水剩余污泥有毒有害廢水富集基質(zhì)和誘導(dǎo)物第11頁,共47頁，2024年2月25日，星期天獲得特定的目標(biāo)基因目標(biāo)基因片斷載體（質(zhì)粒或病毒）質(zhì)粒DNA片斷重組DNA重組DNA進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增并表達(dá)具目標(biāo)基因表達(dá)功能的重組體核酸內(nèi)切酶切割核酸內(nèi)切酶切割細(xì)胞外重組轉(zhuǎn)化（質(zhì)粒）、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染（病毒）利用遺傳標(biāo)記篩選基因工程菌構(gòu)建過程第12頁,共47頁，2024年2月25日，星期天GenecloningandExpressionusingPlasmidpBR322第13頁,共47頁，2024年2月25日，星期天基因工程菌應(yīng)用實(shí)例BurkholderiacepaciaG4，在芳香族化合物存在的條件下能夠共代謝三氯乙烯(TCE)，但降解中間產(chǎn)物會(huì)對(duì)該菌起毒害抑制作用。通過Tn5插入產(chǎn)生BurkholderiacepaciaG45223-PR1，能夠從結(jié)構(gòu)上表達(dá)降解TCE的鄰甲苯單氧合酶，因此在沒有誘導(dǎo)物（如芳香族化合物）的情況下也可降解TCE（Winkleretal.,1995）。第14頁,共47頁，2024年2月25日，星期天商業(yè)菌劑形態(tài)干化和液態(tài)組成自養(yǎng)、異養(yǎng)和兼性菌選擇注意事項(xiàng)(1)在較低或較高溫度下生長的能力;(2)抵抗高濃度污染物的能力(3)抗重金屬的能力(4)在較寬泛的環(huán)境和介質(zhì)中生存的能(5)產(chǎn)生生物表面活性劑，更利于與污染物接觸。第15頁,共47頁，2024年2月25日，星期天四、生物強(qiáng)化技術(shù)在

水污染治理中的應(yīng)用現(xiàn)狀高濃度有機(jī)廢水；有毒、有害難降解污染物的治理；脫氮除磷；改善系統(tǒng)污泥特性，降低污泥產(chǎn)量；強(qiáng)化廢水中油脂的液化和降解江河湖泊等的水體修復(fù)地下水生物修復(fù)第16頁,共47頁，2024年2月25日，星期天生物強(qiáng)化技術(shù)在水污染治理中的應(yīng)用實(shí)例第17頁,共47頁，2024年2月25日，星期天Groundwaterbioremediation第18頁,共47頁，2024年2月25日，星期天Groundwaterbioremediation第19頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PlumberbestfriendBioOne第20頁,共47頁，2024年2月25日，星期天ADaphniaspecies

Actualsize--2mm.

BeforebioaugmentationAfterbioaugmentation第21頁,共47頁，2024年2月25日，星期天生物強(qiáng)化技術(shù)在

水污染治理中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

提高對(duì)目標(biāo)去除物的去除效果改善污泥性能，減少污泥產(chǎn)生加快系統(tǒng)啟動(dòng)，增強(qiáng)耐負(fù)荷沖擊能力和系統(tǒng)穩(wěn)定性第22頁,共47頁，2024年2月25日，星期天對(duì)目標(biāo)去除物的去除效果提高Selvaratnam等人篩選到一株苯酚的高效降解菌，PseudomonasputidaATCC11172，將這種菌投加到SBR反應(yīng)器中，這種菌在40天內(nèi)對(duì)苯酚的降解率始終維持在95%-100%，而那些沒有接種高效菌種的反應(yīng)器，苯酚的去除率由初始100%降低到40%。Chin在附著生長生物床加入降解BTX（苯、甲苯、二甲苯）的混合優(yōu)勢菌，在HRT為1.9小時(shí)時(shí)，生物增強(qiáng)系統(tǒng)可去除10mg/l的BTX，而非強(qiáng)化系統(tǒng)去除僅為3.2mg/l。第23頁,共47頁，2024年2月25日，星期天改善污泥性能，減少污泥產(chǎn)生生物增強(qiáng)作用不僅可以有效消除污泥膨脹，增強(qiáng)污泥沉降性能，而且大大減少了污泥的產(chǎn)生，一般可使污泥容積降低17%到30%。Chamber研究生物增強(qiáng)技術(shù)在延時(shí)曝氣、曝氣塘和氧化溝三種不同系統(tǒng)中的應(yīng)用。在延時(shí)曝氣系統(tǒng)中，接種生物增強(qiáng)劑三周后就成功地消除了污泥膨脹，而在氧化溝中四周后污泥膨脹消除。

第24頁,共47頁，2024年2月25日，星期天加快系統(tǒng)啟動(dòng)，

增強(qiáng)耐負(fù)荷沖擊能力和系統(tǒng)穩(wěn)定性

Belia和Smith發(fā)現(xiàn)，向傳統(tǒng)活性污泥中加入10%的降解磷的純菌，那么整個(gè)系統(tǒng)成為一個(gè)高效脫磷系統(tǒng)（脫磷率達(dá)90%以上）只需14天，而只用活性污泥馴化達(dá)到此脫磷率需要58天時(shí)間。

Edgehill等人用降解五氯酚（PCP）的純菌來增強(qiáng)活性污泥系統(tǒng)，當(dāng)加入10%（相對(duì)于固有菌量）的純菌，就會(huì)使PCP廢水馴化期大大縮短。當(dāng)PCP負(fù)荷由40mgl-1升高到120mgl-1時(shí)，出水則達(dá)到60mgl-1，單純的活性污泥系統(tǒng)恢復(fù)正常需48h，但加入5%或7%的純菌（相對(duì)于固有菌量），系統(tǒng)在18h內(nèi)就使PCP出水達(dá)到15mgl-1，表現(xiàn)出良好的抗負(fù)荷沖擊的能力。第25頁,共47頁，2024年2月25日，星期天生物強(qiáng)化技術(shù)在水污染治理中

應(yīng)用失敗及原因探索（一）

廢水成分復(fù)雜，用生物增強(qiáng)技術(shù)本身難以達(dá)到治理目的和要求。廢水中微生物可利用其生長的底質(zhì)的濃度太低，不足以維持其生長。投入的菌不如系統(tǒng)中固有菌的競爭能力強(qiáng)，不能強(qiáng)有力地?cái)z取有限的營養(yǎng)物質(zhì)。系統(tǒng)中原生動(dòng)物等捕食性動(dòng)物將優(yōu)勢菌捕食。第26頁,共47頁，2024年2月25日，星期天生物強(qiáng)化技術(shù)在水污染治理中

應(yīng)用失敗及原因探索（二）優(yōu)勢菌優(yōu)先利用其他易于利用的底質(zhì)，對(duì)目標(biāo)降解物作用緩慢。廢水中存在抑制性基質(zhì)，抑制菌的生長和代謝。投入菌的量不足以使其在菌群中占優(yōu)勢，或由于控制不當(dāng)菌體流失。不利的環(huán)境因素如廢水的pH、溫度、DO的影響。第27頁,共47頁，2024年2月25日，星期天五、現(xiàn)代生物技術(shù)

在生物強(qiáng)化研究中的應(yīng)用PCRFISHPCR-RFLPPCR-DGGEPCR-RISA第28頁,共47頁，2024年2月25日，星期天傳統(tǒng)的微生物定量化及群落分析方法活皿計(jì)數(shù)法（CFU)

生境可培養(yǎng)細(xì)胞百分比（％）海水0.001-0.1

淡水0.25

中營養(yǎng)型湖泊0.1-1

活性污泥1-15

沉積物0.25

土壤0.3最大可能數(shù)法（MPN)第29頁,共47頁，2024年2月25日，星期天平板培養(yǎng)法缺點(diǎn)：環(huán)境中可通過平板培養(yǎng)的微生物不超過百分之十幾，污水和底泥中有些微生物群落不能夠用培養(yǎng)的方法分析。培養(yǎng)所需時(shí)間較長，不能夠提供生物反應(yīng)器實(shí)時(shí)、有意義信息。難以獲得微生物群落結(jié)構(gòu)和空間分布的有關(guān)信息。第30頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PCR(Polymerasechainreaction)基本步驟：變性:采用高溫使DNA變性，形成單鏈DNA;退火:降低溫度，引物在與單鏈DNA互補(bǔ)的鄰位結(jié)合，形成復(fù)合物.

延伸:將溫度調(diào)至DNA聚合酶的最適宜溫度,該以dNTP為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則，按照模板DNA序列組成，從引物的3’端開始逐一將dNTP聚合上去，合成一條新的DNA雙鏈。第31頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PCRAmplifyingDNA第32頁,共47頁，2024年2月25日，星期天PCR技術(shù)在環(huán)境檢測中的應(yīng)用主要有:應(yīng)用PCR技術(shù)研究某一特定環(huán)境中微生物區(qū)系的組成，進(jìn)而了解其菌群動(dòng)態(tài)。應(yīng)用PCR技術(shù)監(jiān)測環(huán)境中特定種群（如致病菌、工程菌等）的動(dòng)態(tài)。第33頁,共47頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用PCR技術(shù)檢測樣品中的特定微生物種群，其基本步驟包括：

從環(huán)境樣品中提取核酸（DNA或RNA）；以提取的DNA或RNA樣品為模板進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測與分析。第34頁,共47頁，2024年2月25日，星期天熒光原位雜交技術(shù)

（fluorescenseinsituhybridization,FISH）

FISH是目前單個(gè)細(xì)胞水平上分析微生物群落結(jié)構(gòu)的常用的分子生態(tài)學(xué)方法，是用標(biāo)記過的DNA寡聚物去探測未損傷的微生物群落。第35頁,共47頁，2024年2月25日，星期天原理微生物細(xì)胞在載玻片上脫水后，與帶有熒光染料標(biāo)記的寡核糖探針在一定溫度下混合。具有與探針堿基對(duì)完全互補(bǔ)序列的RNA隨即與探針發(fā)生雜交，從而使該菌體在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。第36頁,共47頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞在測定過程中不被破壞，形狀不改變，能夠真實(shí)反映在自然微環(huán)境下的情況及分布

特異性強(qiáng)

能定量化

操作簡單迅速。特點(diǎn)第37頁,共47頁，2024年2月25日，星期天將染色體、細(xì)胞或組織固定；標(biāo)記探針；將探針與固定材料上的靶序列（DNA或RNA）進(jìn)行雜交；檢測雜交的結(jié)果。FISH基本步驟：第38頁,共47頁，2024年2月25日，星期天適用于所用菌種的EUB338;Alf968適用于Proteobacteria的α亞綱;BET42適用于Proteobacteria的β亞綱;GAM42適用于Proteobacteria的γ亞綱;CF319a適用于Cytophaga-Flavobacterium;

ACA適用于Acinetobacter;Nso190適用于Proteobacteria

的β亞綱的氨氧化菌;NEU23a適用于Nitrosomonas屬的耐鹽及嗜鹽菌;NIT3可用于Nitrobacter;S-S-Mae-1414-a-A-18適用于M.erodenitrificans

。一些常用的分子探針第39頁,共47頁，2024年2月25日，星期天微生物群落解析應(yīng)用1用FISH法解析UASB顆粒污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)。圖中同時(shí)采用了兩個(gè)探針進(jìn)行FISH檢測。探針EUB338能與絕大多數(shù)細(xì)菌雜交，發(fā)出綠色熒光；探針ARC915能與古細(xì)菌雜交，發(fā)出紅色熒光。（A）低放大倍數(shù)；（B）高放大倍數(shù)。第40頁,共47頁，2024年2月25日，星期天污泥膨脹中絲狀菌的鑒別，比例和分布用FISH法檢測某污水處理廠活性污泥中的絲狀菌。(A）相差顯微鏡下的污泥絮體；（B）同一顯微鏡視野下同時(shí)用探針G2M（綠色）和G123（紅色）進(jìn)行FISH法檢測。黃色表示同時(shí)與兩個(gè)探針結(jié)合，為絲狀菌Eikelboomtype021NII，紅色則為絲狀菌Thiothrix。應(yīng)用2第41頁,共47頁，2024年2月25日，星期天污泥中聚磷菌的鑒別應(yīng)用3用FISH法和DAPI染色同時(shí)檢測活性污泥中的聚磷菌。圖中，藍(lán)色作為DAPI染色的結(jié)果，代表在細(xì)胞體內(nèi)聚集了大量聚合磷的細(xì)菌；而紅色是FISH法的結(jié)果，代表與標(biāo)記熒光染料的探針MP2發(fā)生雜交的菌體細(xì)