流式細胞儀的原理與應(yīng)用

關(guān)于流式細胞儀的原理與應(yīng)用12

流式細胞術(shù)(flowcytometry,FCM)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種以流式細胞儀為工具，能快速測量細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等，并可對其分類、收集的高新技術(shù)。概述第2頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3

流式細胞術(shù)（FCM）借鑒了熒光顯微鏡技術(shù),同時利用計算機技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)的發(fā)展,將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光,使之具有更好的單色性與激發(fā)效率,因而大大提高了檢測靈敏度,同時將固定的標(biāo)本臺改為流動的單細胞懸液,用計算機進行數(shù)據(jù)處理,從而大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從同一個細胞中可以同時測得多項參數(shù),被譽為是細胞分析領(lǐng)域的“CT”。第3頁,共145頁，2024年2月25日，星期天4

流式細胞術(shù)（FCM）以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實踐各個方面，包括細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。第4頁,共145頁，2024年2月25日，星期天流式細胞術(shù)是一種能快速測量細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)的高技術(shù)。利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術(shù)。與傳統(tǒng)熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù)。

第5頁,共145頁，2024年2月25日，星期天6國內(nèi)使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產(chǎn):BECKMAN-

COULTER公司Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）

綜合型（又稱大型機、分析型）除具備檢測分析功能外,還具有高速細胞分選功能,多用于科學(xué)研究。

第6頁,共145頁，2024年2月25日，星期天流式細胞儀的原理與應(yīng)用一流式細胞儀的原理二流式細胞儀在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第7頁,共145頁，2024年2月25日，星期天8流式細胞儀（FlowCytometer)研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量1973年世界第一臺商用流式細胞儀FACSI（FluorescenceActivatedCellSorter）1980年中國第一臺流式細胞儀FACSII北師大生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗等領(lǐng)域第8頁,共145頁，2024年2月25日，星期天9流式細胞儀的工作原理待測樣品制成單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料對細胞（或表面抗原等）染色后放入上樣管中，在清潔氣體的壓力下將待測樣品壓入流動室，與此同時，不含細胞的磷酸鹽緩沖液（鞘液）在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。

第9頁,共145頁，2024年2月25日，星期天10

前向角散射，即FSC，與細胞直徑成正相關(guān)，所以我們平時上機的時候，有時用FSC做閾值，排除碎片及其它顆粒，避免干擾。

側(cè)向角散射，即SSC，是指與激光束正交90度方向的散射信號，它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感，可以提供細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的信息這兩種信號同時被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。前向光散射信號在前向小角度進行檢測，這種信號基本上反映了細胞體積的大小。

熒光信號的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號。這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度。第10頁,共145頁，2024年2月25日，星期天11流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。第11頁,共145頁，2024年2月25日，星期天12第12頁,共145頁，2024年2月25日，星期天13

鞘液的作用有二：一是約束樣品使之在噴嘴中心以提高測量精度；二是防止樣品靠近噴孔壁以避免堵塞噴孔。在這種約束作用下，細胞排成單列一個跟隨一個地在鞘液包裹下由流動室下面的噴嘴中心噴出，形成細胞液柱。液柱與入射的高度聚焦的激光束相交，此時，細胞上的熒光染料被激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光。在與入射激光和液柱都垂直的方向設(shè)置有熒光測量系統(tǒng)，包括透鏡、光闌、濾片、檢測器等，將細胞的熒光信號變成電信號輸出到計算機，用專用軟件進行分析。第13頁,共145頁，2024年2月25日，星期天14液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱第14頁,共145頁，2024年2月25日，星期天15

另外，通過選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，我們可以利用FCM同時測定一個細胞上的多種不同特征；如果對具有某種特征的細胞有興趣，我們還可以利用流式的分選功能將其分選出來，以便進一步培養(yǎng)、研究。

第15頁,共145頁，2024年2月25日，星期天16應(yīng)用范圍凡是能被熒光素標(biāo)記的細胞或顆粒都可用流式細胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細胞儀是不可多得的一機多用的儀器。第16頁,共145頁，2024年2月25日，星期天17流式細胞儀（FlowCytometer）是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段，可以每秒鐘分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)。其應(yīng)用范圍非常廣泛，而且還在不斷增加。當(dāng)然，細胞分選也是它的重要應(yīng)用之一。它能夠根據(jù)每個細胞的光散射和熒光特征，將特定的細胞從細胞群體中分選出來。每次一個細胞。所以人們又常常將流式細胞儀稱為熒光激活細胞分選儀（fluorescence-activatedcellsorter,FACS）

第17頁,共145頁，2024年2月25日，星期天18流式細胞儀特點單細胞懸液或生物顆粒

分析速度快多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進的細胞定量分析技術(shù)細胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細胞第18頁,共145頁，2024年2月25日，星期天19流式細胞儀的檢測范圍細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體第19頁,共145頁，2024年2月25日，星期天20

1．流式細胞儀的分析速度：

一般流式細胞儀每秒檢測3000～

6000個細胞,大型機可達每秒幾萬個細胞。

2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。

3．前向角散射光（FSC）檢測靈敏度：前向角散射光（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。

流式細胞儀主要技術(shù)指標(biāo)第20頁,共145頁，2024年2月25日，星期天214．流式細胞儀的分辨率：這里的分辨率與其它地方的解釋差異太大。通常，“分辨率”被表示每一個方向上的像素數(shù)量，分辨率越高圖像越清晰。這里的分辨率是衡量FCM儀器測量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV來表示。如果一群含量完全相同的樣本，用流式細胞儀測量，CV值越小則曲線分布越窄越集中，測量誤差就越小，分辨率越高。一般的FCM在最佳狀態(tài)時CV<2%。這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達到的。

5．流式細胞儀的分選指標(biāo)：分選指標(biāo)主要包括：分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指FCM每秒從液體中提取所要細胞的個數(shù)。分選純度指被分選出細胞中目標(biāo)細胞所占的百分率。分選收獲率指被分選出細胞占原來溶液中該細胞的百分率。

第21頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)

光學(xué)系統(tǒng)液流系統(tǒng)電子系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分選系統(tǒng)19第22頁,共145頁，2024年2月25日，星期天23經(jīng)特異熒光染色的細胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。

FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。

為使細胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會聚。為了進一步使檢測的發(fā)射熒光更強，并提高熒光訊號的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長區(qū)段的光線濾除或通過。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過。長(短）波通過二向色性反射鏡只允許某一波長以上（下）的光線通過而將此波長以下的另一特定波長的光線反射。在免疫分析中常要同時探測兩種以上的波長的熒光信號，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來有效地將各種熒光分開。

流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)第23頁,共145頁，2024年2月25日，星期天24FACSCalibur流式細胞儀的光路圖FACSCalibur

光路圖第24頁,共145頁，2024年2月25日，星期天25我中心檢測型流式細胞儀：BDFACSCalibur激光：488nm,633nm常用熒光標(biāo)記：FL1：GFP;CFSE;FITC;AlexaFlouro488FL2：PE;PIFL3：7-AAD;PE-Cy5;PerCP;PerCP-Cy5.5;PE-Cy5.5;PE-Cy7FL4：APC;AlexaFlouro647一般檢測項目：細胞凋亡檢測細胞周期檢測細胞內(nèi)活性氧檢測細胞表面標(biāo)記檢測細胞內(nèi)因子檢測第25頁,共145頁，2024年2月25日，星期天26激光(Laser)熒光素與熒光FACS檢測的信號參數(shù)第26頁,共145頁，2024年2月25日，星期天27激光--

激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照單色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力激光波長:488nm,635nm細胞微弱熒光快速分析的理想光源第27頁,共145頁，2024年2月25日，星期天28FACSCalibur的激光系統(tǒng)第28頁,共145頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)常使用的熒光素FITCFluoresceinisothiocyanatePEPhycoerythrinPerCPPeridininchorophyllproteinAPCAllophycocyaninPIPropidiumiodide第29頁,共145頁，2024年2月25日，星期天PerCP（470-670）PE（488-575）APC（635-660）TexasRed（488-525）PE-CY5.5（488-667）PI（536-617）FITC（488-525）600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLines第30頁,共145頁，2024年2月25日，星期天熒光信號熒光素標(biāo)記特異抗體熒光素吸收激光能量，產(chǎn)生躍遷回到基態(tài)，熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為振動能和熱能，釋放較入射光波長更長的光量子熒光抗體與細胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強

第31頁,共145頁，2024年2月25日，星期天雙激光立體空間激發(fā)系統(tǒng)雙激光，兩點激發(fā)，實現(xiàn)4色熒光分析最大程度地減少熒光信號之間的補償，提高檢測靈敏度雙激光的應(yīng)用大大擴展了染料的選擇范圍，亦相應(yīng)地擴大了儀器的應(yīng)用領(lǐng)域第32頁,共145頁，2024年2月25日，星期天33

當(dāng)細胞攜帶兩種熒光素如PE和FITC,受激光激發(fā)而發(fā)射出兩種不同波長的熒光時，理論上，可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測器檢測到，而不會檢測到另一種熒光。但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間各自發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，F(xiàn)ITC探測器會探測到少量的PE光譜，而PE探測器則檢測到較多的FITC光譜?？朔@種誤差的最有效方法是使用熒光補償電路光譜重疊的校正第33頁,共145頁，2024年2月25日，星期天34第34頁,共145頁，2024年2月25日，星期天35流式細胞儀可檢測到的細胞參數(shù)

1前向角散射（FSC）：前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，也就是說，同一個細胞群體，F(xiàn)SC強的，其細胞大一些，而FSC弱的，其細胞小一些。

2側(cè)向角散射（SSC）：側(cè)向角散射又稱90°散射或大角散射。側(cè)向角散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，對胞內(nèi)較大的顆粒也會有反應(yīng)。所以，側(cè)向角散射光的強弱可反應(yīng)細胞內(nèi)精細結(jié)構(gòu)和顆粒的性質(zhì)。第35頁,共145頁，2024年2月25日，星期天36

3熒光強度（FL）：是細胞或細胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。通過熒光強度可將同一個細胞群體中的有熒光標(biāo)記的細胞與無熒光標(biāo)記的細胞區(qū)分開來，也就是我們通常所說的陽性細胞，也可以將陽性細胞中的高FL的細胞與低FL的細胞區(qū)分開來，也就是可以把強陽性細胞和弱陽性細胞區(qū)分開來。一般的流式細胞儀只裝有一個激光光源（488nm），可測出三個FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細胞儀裝有兩個或三個激光光源（488nm、633nm和325nm），可測出4或6個FL。第36頁,共145頁，2024年2月25日，星期天前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細胞相對大小及其表面積

側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）

細胞粒度及細胞內(nèi)相對復(fù)雜性RightAngleLightDetector

CellComplexityForwardLightDetector

CellSurfaceAreaIncidentLightSource散射光信號第37頁,共145頁，2024年2月25日，星期天38

FSC和SSC兩種信號都是來自于激光原光束，其波長與激光相同，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細胞處理后外周血白細胞中淋巴細胞、單核細胞和粒細胞三個細胞群體，或在未進行裂解紅細胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細胞等細胞群體。

外周血細胞散射光雙參數(shù)點圖（裂解紅細胞后）第38頁,共145頁，2024年2月25日，星期天39

測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第39頁,共145頁，2024年2月25日，星期天使用不同熒光素標(biāo)記不同單克隆抗體對細胞進行染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號第40頁,共145頁，2024年2月25日，星期天熒光信號雙色直接染色39第41頁,共145頁，2024年2月25日，星期天FACSCalibur流式細胞儀液流系統(tǒng)40第42頁,共145頁，2024年2月25日，星期天43液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計和制作均很精細，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。流動室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號可發(fā)生振動。第43頁,共145頁，2024年2月25日，星期天44液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱第44頁,共145頁，2024年2月25日，星期天流式細胞儀的電子系統(tǒng)進行信號檢測和分析當(dāng)細胞攜帶熒光素標(biāo)記物,通過激光照射區(qū)時,受到激發(fā),產(chǎn)生不同波長的、代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號經(jīng)熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號而進行測量的。光電倍增管（PMT）最為常用。從PMT輸出的電信號仍然較弱，需要經(jīng)過放大后才能輸入分析儀器。

數(shù)字信號傳送到計算機，計算機把所測量到的各種信號進行處理、儲存、作圖、統(tǒng)計分析,將分析結(jié)果顯示

在計算機屏幕上，也可以打印出來，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上以備日后的查詢或進一步分析。第45頁,共145頁，2024年2月25日，星期天強大的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Macintoshi系統(tǒng)，靈活多樣的圖形處理能力

目前公認的最佳圖像處理系統(tǒng),使流式細胞儀的功能發(fā)揮更加完美。強大的軟件支持，靈活方便的數(shù)據(jù)處理功能儀器自動校檢軟件FACSComp主軟件CELLQuest全面的自動化臨床應(yīng)用軟件： 淋巴細胞自動檢測軟件SimulSET；MultiSET

干細胞自動檢測軟件ProCOUNT HLA-B27；

ModFIT；第46頁,共145頁，2024年2月25日，星期天47流式細胞儀數(shù)據(jù)分析

根據(jù)分析目的不同，對制備好的樣本在流式細胞儀上測量其光散射和熒光強度。一般在測樣本前先應(yīng)用熒光標(biāo)準微球校準儀器，多色分析時還應(yīng)進行顏色補償，以避免多色熒光間信號的相互干擾。儀器校準后測量樣本，每個細胞的光散射及熒光測量數(shù)據(jù)一般以列表或矩陣方式儲存于計算機中，然后進行數(shù)據(jù)的顯示、圖象分析和結(jié)果統(tǒng)計處理，最終獲得所分析細胞的信息，也可在測定的同時進行結(jié)果分析。第47頁,共145頁，2024年2月25日，星期天流式細胞儀數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)存儲:ListMode第48頁,共145頁，2024年2月25日，星期天49

數(shù)據(jù)的顯示

儲存的數(shù)據(jù)文件雖然易于加工、處理、分析，但由于數(shù)據(jù)大，又缺乏直觀性，不利于觀察各參數(shù)及其相互的關(guān)系。因此，將數(shù)據(jù)用圖形顯示更直觀，然后再進行統(tǒng)計分析，這是FCM結(jié)果分析中最常用的分析方法。FCM數(shù)據(jù)顯示通常有一維直方圖、二維點圖、二維密度圖、二維等高圖、假三維圖等。第49頁,共145頁，2024年2月25日，星期天50

由一維參數(shù)(散射光或熒光)與顆粒計數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。單參數(shù)直方圖第50頁,共145頁，2024年2月25日，星期天51單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量熒光信號相對強度值（對數(shù)）

圖中已根據(jù)陰性對照設(shè)定適當(dāng)?shù)摹伴T”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）

第51頁,共145頁，2024年2月25日，星期天52圖中100～101（M1）為陰性細胞，101以上的（M2）為陽性細胞第52頁,共145頁，2024年2月25日，星期天53雙參數(shù)散點圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。雙參數(shù)散點圖第53頁,共145頁，2024年2月25日，星期天541.雙參數(shù)散點圖綠色熒光強度紅色熒光強度第54頁,共145頁，2024年2月25日，星期天55雙參數(shù)點圖第55頁,共145頁，2024年2月25日，星期天562.二維等高圖由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高(越里面的線)所代表的細胞數(shù)愈多。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。第56頁,共145頁，2024年2月25日，星期天57等高圖和密度圖分析

二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。第57頁,共145頁，2024年2月25日，星期天583.假三維等高圖第58頁,共145頁，2024年2月25日，星期天59三參數(shù)直方圖三個熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C-、A+B-C-、A-B+C+、A-B+C-、A-B-C+、A+B-C+、A-B-C-）。

第59頁,共145頁，2024年2月25日，星期天60流式細胞計是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)設(shè)的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。⑸、樣品分選第60頁,共145頁，2024年2月25日，星期天61細胞分選的原理

當(dāng)經(jīng)熒光染色或標(biāo)記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內(nèi)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列，以一定速度從流動室噴口噴出。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)過帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。第61頁,共145頁，2024年2月25日，星期天62流式細胞分選的特點

1.少量細胞分選時，流式細胞分選精確度高（99%以上），速度快。目前，先進的流式細胞儀的分選速度可達25000個細胞/秒以上，比傳統(tǒng)的分選速度提高了很多倍，原來需要一天的工作現(xiàn)在只需要幾小時就能完成。不過流式細胞儀分離細胞的量還是有一定的限制，一次分離的最大合理量約為108個細胞。如果細胞量超過109個，則需要耗費10小時以上，分選后細胞的活力會受到很大的影響。

2.可以同時進行多個Marker分選，正選負選同時進行。以前的流式細胞儀只能給液滴充上正電荷或負電荷，因此在電場中只能向左或向右偏轉(zhuǎn)，即兩路分選?，F(xiàn)在的儀器可以給液滴充以不同的電量，從而調(diào)整液滴的偏轉(zhuǎn)角度，實現(xiàn)多路分選。BD的FACSAria流式細胞儀就可以進行四路分選。

第62頁,共145頁，2024年2月25日，星期天633.不僅僅限于表面抗原，流式細胞儀可以根據(jù)任何能檢測到的發(fā)光度（如細胞體積）或熒光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原）散射度差異來分離細胞。如果能保證流式細胞儀的無菌狀態(tài)，那么分選后的細胞還可以進行培養(yǎng)或其他分析。

4.如果只是偶爾做幾次細胞分選的話，用流式分選還是比較劃算的，只需要準備樣品和抗體，交納一定的儀器使用費即可，不需要購買配套的設(shè)備。第63頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞分選原理第64頁,共145頁，2024年2月25日，星期天3、配套設(shè)施數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)——Macintoshi系統(tǒng)Autoloader自動進樣系統(tǒng)：40管輪盤，軟件支持，簡單易操作，真正實現(xiàn)無人操作樣本制備儀： 免疫樣本制備儀DNA樣本制備儀第65頁,共145頁，2024年2月25日，星期天664、流式細胞儀的分類第66頁,共145頁，2024年2月25日，星期天67第67頁,共145頁，2024年2月25日，星期天68大型機——FACSVantageSE多激光多波長八特征參數(shù)設(shè)計靈活高速分選單細胞點對點分選第68頁,共145頁，2024年2月25日，星期天69臺式機——FACSCalibur雙激光：488nm/635nm四熒光六分析參數(shù)自動化程度高分析速度快靈活的設(shè)計細胞分選系統(tǒng) 細胞富集系統(tǒng)第69頁,共145頁，2024年2月25日，星期天70BDFACSDiva

型流式細胞儀三激光八熒光十參數(shù)分析自動補償四通道分選點對點分選第70頁,共145頁，2024年2月25日，星期天71BDFACSCount

型流式細胞儀最簡化的樣本處理過程，很好地防生物污染完善的自動采樣，自動分析出報告系統(tǒng)，防人為因素干擾嚴格完整地質(zhì)控及對照系統(tǒng)，確保結(jié)果的準確性，可靠性完善的CD4，CD8，CD3絕對計數(shù)系統(tǒng)專為HIV監(jiān)測設(shè)計的經(jīng)濟普及型流式細胞儀

第71頁,共145頁，2024年2月25日，星期天72BD：FACSAria型流式細胞儀自助式液流車，

高速分選，達到50000個細胞/秒使得分析速度提升到70000個/秒，兩路或四路分選，分選收集裝置可選細胞培養(yǎng)板，微管，12x75，15ml試管；

智能化分選設(shè)定，軟件控制；

自動監(jiān)控液流，具有報警功能

第72頁,共145頁，2024年2月25日，星期天73BDLSR型流式細胞儀三激光，六熒光八參數(shù)分析固定校準第73頁,共145頁，2024年2月25日，星期天74Beckman-Coulter公司FC500型雙激光五色七參數(shù)分析自動補償Windows操作系統(tǒng)第74頁,共145頁，2024年2月25日，星期天75德國PARTEC公司CyFlowML型流式細胞儀三激光十三熒光十六參數(shù)可移動性強第75頁,共145頁，2024年2月25日，星期天76德國PARTEC公司CyFlow型流式細胞儀可選激光三熒光六參數(shù)分析兩種熒光分析與絕對計數(shù)不需Beads第76頁,共145頁，2024年2月25日，星期天77德國PARTEC公司PAS型流式細胞儀可選多激光六熒光九參數(shù)分析細胞分選500/sec可選全自動組件可選CCD攝像機第77頁,共145頁，2024年2月25日，星期天4、流式細胞術(shù)樣本來源及處理流式細胞術(shù)樣本來源流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個問題熒光染色的步驟第78頁,共145頁，2024年2月25日，星期天流式細胞術(shù)樣本來源細胞懸液：培養(yǎng)細胞、細胞系灌洗液、體腔積液分離PBMC、PRP等：操作復(fù)雜，分離、離心步驟導(dǎo)致細胞特定群體丟失，并可能引入某些誤差直接使用外周血、骨髓：最接近生理狀況，操作簡便，樣本用血量小實體組織：Medimachine(Medimachine系統(tǒng)是一套安全的,標(biāo)準化的樣本制備系統(tǒng),可對植物或動物的實體組織進行自動機械分離

)病理組織：新鮮樣本/石蠟包埋樣本針吸組織：新鮮樣本鞘液、洗液、PMA等：清潔無顆粒雜質(zhì)第79頁,共145頁，2024年2月25日，星期天80流式樣品的制備中應(yīng)注意的幾個問題

㈠熒光素和抗體的選擇⒈熒光素的選擇：現(xiàn)在國內(nèi)引進的大多數(shù)流式細胞儀只裝有一個激光光源，即488nm光源，所以我們在選擇熒光素時要選擇能被488nm激光激發(fā)的熒光素，常用的熒光素有：①測細胞DNA和RNA含量：PI、7-AAD。②測細胞蛋白、抗體或抗原：FITC、PE、Per-CP、PE-CY5、PerCP-CY5.5。③測細胞膜電位：Rho-123。④測鈣離子：Fluo-3。第80頁,共145頁，2024年2月25日，星期天81⒉抗體的選擇：

一定要選擇商業(yè)化的流式用單克隆抗體，此類抗體在制備過程中有嚴格的質(zhì)控，非特異熒光弱。最好用直標(biāo)抗體，如果是用間標(biāo)抗體，二抗的選擇更應(yīng)嚴格。第81頁,共145頁，2024年2月25日，星期天82

（二）樣品的準備評價一個樣品制備的優(yōu)劣，可有三個評價指標(biāo):①細胞的密度，不能低于1×106/ml②非特異熒光，不超過1％③細胞碎片和聚集體，不能出現(xiàn)肉眼可見的團塊。第82頁,共145頁，2024年2月25日，星期天83

流式細胞儀對一個樣品提供的結(jié)果是否可信，雖然與儀器操作者的水平有很大關(guān)系，但在很大程度上取決于樣品制備的優(yōu)劣。細胞密度太低，影響測試速度并造成測試參數(shù)調(diào)整的困難，尤其是在做DNA分析時，由于細胞太少，勢必要提高樣品的流速，人為地增大了G0/G1期的CV值，影響了結(jié)果的可靠性；非特異熒光強，則造成樣品結(jié)果的假陽性；聚集體增多，尤其是肉眼可見的細胞聚集體，可造成流式細胞儀進樣針的阻塞，影響儀器的性能，碎片可干擾測試結(jié)果，造成結(jié)果分析的困難。

第83頁,共145頁，2024年2月25日，星期天84

流式樣品制備過程中常見的問題及解決對策常見問題原因解決對策細胞密度低制備過程中細胞損失增加離心時間、吸棄上清非特異熒光強抗體不純、死亡細胞多選擇純度高的抗體、用同型對照抗體或雙標(biāo)記排除非特異熒光碎片多細胞死亡、機械損傷在細胞生長狀態(tài)良好時測試、避免反復(fù)吹打細胞聚集消化不完全、酒精固定造成的細胞粘連徹底消化、在用酒精固定細胞時加入終濃度為1.5-3％的小牛血清熒光弱靈敏度不夠、抗體加入量不飽和、反應(yīng)時間短改用生物素-親和素、增加抗體用量、延長反應(yīng)時間測不出亞二倍體峰凋亡測試方法選擇不當(dāng)改用原位末端標(biāo)記或Annexin-V和PI雙標(biāo)記法第84頁,共145頁，2024年2月25日，星期天85熒光染色對照的設(shè)置空白對照自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越高自發(fā)熒光越強實驗樣本特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細胞抗原特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結(jié)合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光自發(fā)熒光同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）FMO合適？第85頁,共145頁，2024年2月25日，星期天86同型對照同型對照（IsotypeControl）：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型（即Fc段相同，F(xiàn)(ab’)2段不同）與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標(biāo)記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結(jié)合到細胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標(biāo)記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標(biāo)記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應(yīng)用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分別標(biāo)記FITC和PE第86頁,共145頁，2024年2月25日，星期天87熒光染色－染色步驟表面染色：細胞表面抗原抗體反應(yīng)溶血：溶解紅細胞破膜：細胞膜打孔，使胞內(nèi)染料滲入清洗：除去多余的染料及打孔劑胞內(nèi)染色：細胞內(nèi)抗原抗體反應(yīng)清洗：除去多余的染料固定：固定細胞，準備上機分析第87頁,共145頁，2024年2月25日，星期天88

樣品培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測表型測定細胞分選流式細胞術(shù)操作流程統(tǒng)計學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)第88頁,共145頁，2024年2月25日，星期天二流式細胞儀的應(yīng)用淋巴細胞亞群分析凋亡分析細胞周期分析細胞因子分析血小板分析HLA-B27分析第89頁,共145頁，2024年2月25日，星期天90

FCM提供了一種簡捷地監(jiān)測細胞亞群的方法。即通過熒光抗體和抗原檢測技術(shù)對淋巴細胞膜表面分化抗原(CD分子)、細胞分類和各亞群進行分析，并計算出淋巴細胞各亞群的百分比，從而對人體細胞免疫狀態(tài)進行評估。在某些病毒性疾病的感染血液病、原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷病、腫瘤的療效觀察和預(yù)后判斷以及器官移植的監(jiān)測上起著重要的指導(dǎo)作用。

1、淋巴細胞亞群分析第90頁,共145頁，2024年2月25日，星期天淋巴細胞亞群分析根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B淋巴細胞（CD19+），與體液免疫有關(guān)T淋巴細胞（CD3+），與細胞免疫有關(guān)NK細胞（CD3-CD16+56+），行使免疫監(jiān)控功能根據(jù)CD4、CD8表達，T淋巴細胞又分為ThT輔助/誘導(dǎo)細胞（CD3+CD4+）TsT抑制/細胞毒性細胞（CD3+CD8+）Th/Ts升高：自身免疫性疾?。愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、SLE）Th/Ts降低：病毒感染、惡性腫瘤、再生障礙性貧血第91頁,共145頁，2024年2月25日，星期天臨床意義了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài)輔助臨床疾病的診斷探索疾病的發(fā)病機理、病程、預(yù)后監(jiān)測、指導(dǎo)臨床治療方案免疫系統(tǒng)疾病免疫缺陷病，AIDS移植病人排斥反應(yīng)或移植物抗宿主反應(yīng)的檢測腫瘤病人化療后免疫力檢測第92頁,共145頁，2024年2月25日，星期天SimulTESTIMK-Lymphocyte

淋巴細胞雙色分析樣本使用EDTA抗凝全血，用血量600uL使用雙色分析試劑使用SimulSET自動軟件，進行樣本的獲取和分析SimulSET軟件自動做質(zhì)量檢查，幫助發(fā)現(xiàn)樣本運輸、處理等過程中造成的錯誤醫(yī)生報告T、B、NK淋巴細胞及Th、Ts百分含量和Th/Ts比值，并報告參考值范圍第93頁,共145頁，2024年2月25日，星期天淋巴細胞分析——SimulSETCD45/CD14(LeucoGATE)：自動定義淋巴細胞的光散射門，并評估其有效性IsotypeControl(

1/2a)：陰性對照，確定FL1和FL2的非特異性結(jié)合水平，界定陰性和陽性細胞群體CD3/CD19：鑒別T淋巴細胞和B淋巴細胞CD3/CD4：鑒別T輔助/誘導(dǎo)淋巴細胞CD3/CD8：鑒別T抑制/毒性淋巴細胞CD3/CD16+56：鑒別T淋巴細胞和NK細胞第94頁,共145頁，2024年2月25日，星期天淋巴細胞分型步驟第95頁,共145頁，2024年2月25日，星期天SimulTESTIMK-Lymphocyte

淋巴細胞雙色分析第96頁,共145頁，2024年2月25日，星期天97CD45/CD14LeucoGATE：Back-Gating，準確圈定淋巴細胞門，并評估門的有效性第97頁,共145頁，2024年2月25日，星期天IsotypeControl(

1/2a)：陰性對照，確定FL1和FL2的非特異性結(jié)合水平，界定陰性和陽性細胞群體第98頁,共145頁，2024年2月25日，星期天CD3/CD19：鑒別T淋巴細胞和B淋巴細胞第99頁,共145頁，2024年2月25日，星期天CD3/CD4：鑒別T輔助/誘導(dǎo)淋巴細胞第100頁,共145頁，2024年2月25日，星期天CD3/CD8：鑒別T抑制/毒性淋巴細胞第101頁,共145頁，2024年2月25日，星期天CD3/CD16+56：鑒別T淋巴細胞和NK淋巴細第102頁,共145頁，2024年2月25日，星期天103BDSimulTESTIMK-LymphocyteKit(反向設(shè)門法雙色淋巴細胞表型分析)健康中國人參考范圍（使用SimunlSET自動軟件）項目百分含量（%淋巴細胞）TotalBlymphocyte(CD19+)5-18%NKcell(CD3-/CD16+56+)7-40%TotalTlymphocyte(CD3+)50-84%Thelper/inducercell(CD3+/CD4+)27-51%Tsupressor/cytotoxiccell(CD3+/CD8+)15-44%Th/Ts0.71-2.78正常參考值:第103頁,共145頁，2024年2月25日，星期天HIV感染T淋巴細胞總數(shù)減少T細胞亞群比例倒置，Th/Ts<1.0Th細胞(CD4+細胞)絕對計數(shù)<200個/mlTs細胞增高NK細胞減少或活力下降B細胞正常第104頁,共145頁，2024年2月25日，星期天

HIV感染第105頁,共145頁，2024年2月25日，星期天HIV感染68%3.6%3.4%6.7%10%8.9%第106頁,共145頁，2024年2月25日，星期天2、細胞凋亡分析

凋亡（或程序性細胞死亡）是一個生理性的細胞自我毀滅的過程，在胚胎發(fā)育、生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及多細胞生物防御外在及內(nèi)在傷害方面均起著非常重要的作用。凋亡過程的紊亂，可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系，如腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性變及局部損傷等。能夠誘發(fā)細胞凋亡的因素很多，如射線、能夠引起染色體損傷的藥物、細胞自身表達的一些受體分子等。

第107頁,共145頁，2024年2月25日，星期天第108頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡的檢測細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學(xué)檢查Ladders實驗流式細胞儀檢查細胞發(fā)生凋亡或壞死，其細胞DNA均發(fā)生斷裂，細胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細胞的凋亡，并可與壞死細胞區(qū)別。

第109頁,共145頁，2024年2月25日，星期天110流式細胞儀檢測凋亡，是常用的方法。由于流式細胞儀固有的特點――可以準確的進行凋亡細胞的計數(shù)。因此，具有其它方法無可比擬的優(yōu)越性。在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下*細胞色素C和apaf－1形成復(fù)合體，線粒體的功能發(fā)生衰退；*細胞內(nèi)酶改變：Caspase-3活化*細胞膜不對稱性改變，磷脂酰絲氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：AnnexinV/PI*細胞核DNA的斷裂改變：TUNEL實驗*凋亡相關(guān)蛋白：

FasBcl-2第110頁,共145頁，2024年2月25日，星期天111流式細胞術(shù)檢測凋亡的研究內(nèi)容

1、線粒體功能

2、DNA3、Caspases

4、AnnexinVAssay5、DNAFragmentationAssays6、凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2第111頁,共145頁，2024年2月25日，星期天1121、線粒體功能線粒體功能檢測的試劑盒有深圳達科為公司代理的試劑盒（產(chǎn)品編號為BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是：正常細胞中，染料可以在線粒體內(nèi)聚集，發(fā)出明亮的紅色熒光；而細胞凋亡后，其線粒體膜電位發(fā)生改變，染料無法進入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，發(fā)出綠色的熒光?？梢栽跓晒怙@微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發(fā)，其檢測波長分別是527nm和590nm。整個實驗過程操作簡單，只需要30min就可以見到結(jié)果。第112頁,共145頁，2024年2月25日，星期天1132、DNA含量DNA周期檢測原本是用來反應(yīng)細胞各個期，即細胞增殖狀況的。利用細胞內(nèi)DNA能夠和熒光染料，如PI結(jié)合的特性。細胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同，流式檢測的熒光強度也不一樣。G2－M期DNA含量是G0－G1的兩倍，而S期介于兩者之間。但是由于發(fā)現(xiàn)凋亡的細胞DNA含量較少，因而可以在細胞G0－G1期前面有一個亞二倍體峰，從而認為是凋亡細胞。但是由于死亡的細胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難于區(qū)分凋亡和死亡的細胞。在90年代，該方法曾經(jīng)風(fēng)靡一時，現(xiàn)在看來，那時的實驗結(jié)果需要推敲。盡管，經(jīng)典的流式檢測資料給出的圖是認為凋亡的細胞是緊挨著G0－G1期峰的一個峰，死亡的細胞峰離G0－G1期峰較遠，但是這種典型的結(jié)果似乎很難獲得。有其它的替代方法，完全可以不用這種方法。第113頁,共145頁，2024年2月25日，星期天114下圖橫軸代表PI的熒光強度，縱軸代表細胞數(shù)目，各個期根據(jù)熒光強度可以簡單的進行區(qū)分。第114頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡——ActiveCaspases-3第115頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡——Caspases-3第116頁,共145頁，2024年2月25日，星期天117

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將正常細胞、凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開磷脂酰絲氨酸外翻分析(AnnexinV法)聯(lián)合PI法第117頁,共145頁，2024年2月25日，星期天118結(jié)果判斷：正常活細胞AnnexinV、PI均低染；凋亡早期細胞AnnexinV高染、PI低染；壞死細胞、凋亡晚期AnnexinV/PI均高染。

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應(yīng)用價值：細胞發(fā)生凋亡時，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此AnnexinV聯(lián)合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又AnnexinV聯(lián)合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色檢測細胞凋亡時因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，AnnexinV聯(lián)合PI法更加省時，結(jié)果更為可靠。是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。第119頁,共145頁，2024年2月25日，星期天120第120頁,共145頁，2024年2月25日，星期天121TUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。第121頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡第122頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡第123頁,共145頁，2024年2月25日，星期天124

流式細胞儀最初的應(yīng)用之一便是檢測細胞的DNA含量，它可快速將細胞循環(huán)中的其它階段與有絲分裂期區(qū)別開來。這些檢測是基于對細胞內(nèi)DNA以化學(xué)定量方式的染色（染料著色數(shù)量直接與細胞內(nèi)DNA含量相關(guān)）。有相當(dāng)多的對DNA有高親合力的染料可用于此應(yīng)用。而不同的染料與DNA分子結(jié)合的位點不同。當(dāng)運用DNA結(jié)合熒光染料后，經(jīng)流式分析可觀察到一個有特征的圖譜，那就是由各種細胞組成的一個細胞周期分布圖。3、細胞周期分析第124頁,共145頁，2024年2月25日，星期天細胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量細胞數(shù)量2N4N

細胞周期中各個環(huán)節(jié)在流式細胞儀上分析時的圖譜特征第125頁,共145頁，2024年2月25日，星期天126流式細胞術(shù)PI染色進行細胞周期分析的原理

PI,即碘化丙錠,可以與細胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過流式細胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不同,通常正常細胞的G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),而G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此,通過流式細胞術(shù)PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。值得注意的是,PI不能通過細胞膜完整的細胞第126頁,共145頁，2024年2月25日，星期天127當(dāng)細胞沒有進入分裂過程時（我們機體中的絕大部分細胞），它們處于細胞周期的G1期的位置上。因此G1細胞在數(shù)量上絕對是居各期細胞之首并在流式圖譜上形成最高的信號峰。在G1期細胞中有一群細胞特別安靜并且沒有進入細胞循環(huán)的任何生物學(xué)特征，我們稱這些細胞為G0期細胞。第127頁,共145頁，2024年2月25日，星期天128

當(dāng)二倍體細胞被化學(xué)定量式DNA染料著色后并在流式細胞儀上分析，會觀察到一個很“窄”熒光峰。它將出現(xiàn)在以熒光強度為X軸、細胞數(shù)量為Y軸的坐標(biāo)上。因為G1期細胞具有相同的DNA含量，理論上G1期細胞的DNA含量熒光強度應(yīng)當(dāng)一致，并在直方圖上的一個通道上出現(xiàn)信號（在直方圖上出現(xiàn)一條G1期細胞的熒光直線）。如果流式細胞儀十分完美且DNA染料的特異性絕對專一，這種情況將會發(fā)生。而在實際中，流式細胞儀本身存在著許多變異性，此外DNA染料的著色也存在生物學(xué)的變異。因此，檢測得出的G1期細胞的熒光分布正常的是呈高斯曲線分布。這種“鐘”型分布與檢測的變異相關(guān)。檢測中的變異越大，高斯曲線的寬度越寬。有一個名為“變異系數(shù)”（CV）的指標(biāo)用于描述峰的寬度。第128頁,共145頁，2024年2月25日，星期天129分別顯示了一個理想狀態(tài)中一臺完美的流式細胞儀無偏差檢測的直方圖（A）和實際分析得到的呈高斯分布的直方圖（B）。在B圖中，使用Dean和Jett多項式S期分析模型進行分析識別出的G