電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

關(guān)于電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

從光鏡組織化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)，任務(wù)是研究細(xì)胞內(nèi)各種成分在超微結(jié)構(gòu)水平上分布情況以及這些化學(xué)成分在細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。酶的細(xì)胞化學(xué)，免疫細(xì)胞化學(xué)，放射自顯影以及各種細(xì)胞組成的生化分析等都屬于電鏡細(xì)胞化學(xué)的范圍。第2頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶細(xì)胞化學(xué)的發(fā)展情況酶細(xì)胞化學(xué)是從50年代末開始發(fā)展。酶在生命活動(dòng)中占有極其重要的地位，離開了酶，一切生命活動(dòng)所需的物質(zhì)代謝將成為不可能。目前已知有2000多種酶。

LM組織化學(xué)方法----顯示出酶100多種

EM細(xì)胞化學(xué)-----顯示出酶80多種南醫(yī)大電鏡室----EM----顯示出酶30多種第3頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶細(xì)胞化學(xué)的意義酶的細(xì)胞化學(xué)定位對(duì)研究細(xì)胞的生理功能和病理過(guò)程有重要意義；很多酶可以作為細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器的標(biāo)志酶，而且有些細(xì)胞還有其特有的標(biāo)志酶，這就為研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能，細(xì)胞器的相互關(guān)系以及細(xì)胞的鑒別提供了一種新的武器。第4頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞器標(biāo)志酶內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高爾基體TPP（硫胺素焦磷酸酶），NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）GERL和溶酶體ACP酶（酸性磷酸酶）線粒體細(xì)胞色素氧化酶，琥珀酸脫氫酶微粒體過(guò)氧化氫酶（H2O2酶）細(xì)胞膜（膜性結(jié)構(gòu)）核糖核苷酸酶（如ATP酶），堿性磷酸酶細(xì)胞器和它們的標(biāo)志酶第5頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶細(xì)胞化學(xué)的基本原理

在生物化學(xué)中，按照催化反應(yīng)的性質(zhì)將酶分成水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)換酶、裂合酶、合成酶和異構(gòu)酶六大類。但在細(xì)胞化學(xué)上可以檢出的酶多數(shù)屬水解酶和氧化還原酶兩大類。第6頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、水解酶底物酶＋條件初級(jí)反應(yīng)產(chǎn)物捕捉劑最終反應(yīng)產(chǎn)物捕捉劑通常是重金屬（如鉛、鋇、銅等）一般來(lái)說(shuō)，這些最終產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的位置代表酶促反應(yīng)的位置，也就是酶的定位。以酸性磷酸酶為例：?－甘油磷酸鈉酸性磷酸酶PH5.0ROH＋H3PO4Pb2+Pb3(PO4)2第7頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、氧化還原酶包括氧化酶和脫氫酶，在氧化還原酶細(xì)胞化學(xué)方法中，包含著兩個(gè)既分開又緊密聯(lián)系的底物，在細(xì)胞化學(xué)中一個(gè)底物被還原，另一個(gè)被氧化。兩個(gè)底物中，有一個(gè)是酶的理想底物，另一個(gè)是專門選擇的在氧化還原時(shí)會(huì)起重要化學(xué)變化的某種物質(zhì)，后一種底物有很多方面可看作是捕捉劑的等效物，稱捕捉底物。第8頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天氧化酶H2O2H2O氧化酶DABDAB氧化聚合物OsO4（鋨酸）鋨黑（高電子密度）第9頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫氫酶琥珀酸鹽延胡索酸鹽琥珀酸脫氫酶高鐵氰化物[Fe(CN)63ˉ]亞鐵氰化物[Fe(CN)64ˉ]Cu2+亞鐵氰化銅以琥珀酸脫氫酶為例注：Cu2+存在在檸檬酸鈉或酒石酸鉀鈉條件下第10頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用的酶細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)步驟

一、取材與固定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織最好用灌注固定，人體活檢標(biāo)本以浸泡固定為主。用2％戊二醛固定液經(jīng)血管灌注固定動(dòng)物組織5分鐘左右，然后取下所需的組織，切成寬1mm，長(zhǎng)5－10mm長(zhǎng)方形組織塊，在同樣的固定液中繼續(xù)固定，固定時(shí)間隨組織大小、種類而定。各種酶對(duì)固定液敏感度和耐受性也不同，必須根據(jù)具體情況選擇固定液的溫度、濃度、時(shí)間和PH。第11頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用固定劑對(duì)超微結(jié)構(gòu)和酶活性保存情況保存情況保存情況超微結(jié)構(gòu)的情況酶活性超微結(jié)構(gòu)的情況酶活性乙醛差好羥基乙二醛好好丙烯醛好—優(yōu)秀差乙-甲基丙烯醛好好巴豆醛尚可好丙酮醛差差甲醛尚可優(yōu)秀琥珀醛尚可好戊二醛優(yōu)秀好丙醛尚可好乙二醛尚可，好好第12頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

二、漂洗組織

用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液（PH7.4）在4℃下漂洗組織，洗去戊二醛固定液，漂洗時(shí)間最少2小時(shí)以上，可以過(guò)夜。二甲胂酸鈉緩沖液是最理想的漂洗液，因?yàn)樗桓蓴_任何酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)。第13頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

三、切組織片

將長(zhǎng)條組織塊埋在7％瓊脂中，用組織切片機(jī)切成25μm－75μm的組織片，將切下的組織片浸泡在4℃的0.1M二甲胂酸鈉緩沖液中；或?qū)⒔M織塊用冰凍切片機(jī)切成所需厚度的組織片，但需防止冰晶的產(chǎn)生。也可用振蕩切片機(jī)切成45μm左右的組織片。當(dāng)被檢查的材料被充分固定時(shí)，用冰凍切片機(jī)制作切片能較好的保持微細(xì)結(jié)構(gòu)。當(dāng)材料不能充分固定或不能被固定時(shí)，由于冷凍溶解能引起組織結(jié)構(gòu)的損傷，所以用組織切片機(jī)或振蕩切片機(jī)。對(duì)一些有方向性的組織，在切薄片前必須注意樣品的定向，事先確定所需要細(xì)胞的位置。第14頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

四、置換緩沖液

將組織片放入配制孵育液用的緩沖液中，換液2－3次，每次5－10分鐘，使組織內(nèi)部建立細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)所需的PH條件，緩沖液溫度須保持4℃左右。有些細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)中有預(yù)孵育步驟，即將組織片浸在沒有底物的孵育液里20分鐘左右，在酶與底物相遇之前使組織內(nèi)部建立起所需的PH以及足夠的捕捉劑的濃度。第15頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

五、孵育

將組織片放在新鮮配制的孵育液中，在室溫或37℃水浴箱中孵育30分鐘至2小時(shí)，孵育過(guò)程中不斷振蕩孵育液，使其容易擴(kuò)散到組織內(nèi)。孵育液要求現(xiàn)配現(xiàn)用，成分一般不能有大的變動(dòng)，底物和捕捉劑的濃度、緩沖液的緩沖能力等必須保持在很窄的限度內(nèi)；在一些孵育液的配方中，某些成分已接近溶解度的極限，因此在混合各種成分時(shí)必須特別小心。各種酶有其相應(yīng)的孵育時(shí)間、溫度、PH，必須嚴(yán)格遵守。第16頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

六、漂洗組織

首先用配制孵育液的緩沖液清洗組織，以去除孵育液中過(guò)剩試劑，一般換洗2－3次，每次5分鐘，然后用0.1M二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，所用緩沖液保持在4℃左右。第17頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

七、后固定

用1％鋨酸固定液對(duì)組織作后固定，由于組織較薄，在4℃下固定時(shí)間一般不超過(guò)1小時(shí)。為了更好的顯示細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)，可以用亞鐵氰化鉀還原的鋨酸作后固定。

第18頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

八、脫水包埋按超薄切片技術(shù)中的常規(guī)方法進(jìn)行脫水和環(huán)氧樹脂包埋，但脫水時(shí)間縮短一半，且不用醋酸雙氧鈾作塊染。對(duì)超薄切片染色要慎重，因?yàn)殡娮尤旧赡軙?huì)模糊細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的細(xì)節(jié)，染色液也可能會(huì)模糊細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的細(xì)節(jié)，染色液也可能與細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物起作用。因此，首先必須觀察未經(jīng)染色的切片，只有確證染色對(duì)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物沒干擾的情況下才能做常規(guī)超薄切片染色。第19頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用第20頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第24頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫電子顯微技術(shù)第25頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究抗原抗體反應(yīng)的部位并研究其動(dòng)態(tài)變化。

1959年，Singer首先提出用電子密度較高的鐵蛋白(Ferritin)標(biāo)記抗體的方法，使在細(xì)胞超顯微水平上研究抗原抗體反應(yīng)成為可能。在此基礎(chǔ)上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術(shù)、鐵蛋白抗鐵蛋白復(fù)合物技術(shù)、免疫酶技術(shù)及膠體金標(biāo)記技術(shù)等。第26頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)標(biāo)記物的要求標(biāo)記物必須是電子密度高的物質(zhì)，在電鏡下可識(shí)別標(biāo)記物與抗體或與抗原反應(yīng)必須不改變抗體或抗原的活性標(biāo)記物在電子的轟擊下不改變形狀常用的標(biāo)記物有鐵蛋白、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、膠體金等第27頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本操作組織固定與取材：固定要求保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和保持組織的抗原性，取材要求迅速、精細(xì)。固定液：過(guò)碘酸－賴氨酸－多聚甲醛液（PLP液），多聚甲醛－戊二醛混合液，4%多聚甲醛液免疫染色：包埋前染色、包埋后染色、超薄冰凍切片染色包埋：樹脂包埋、低溫包埋第28頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋前染色即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、包埋。包埋前染色的組織以中層較為理想；表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)往往保存不好；深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無(wú)。在做超薄切片前應(yīng)先做半薄切片，找出免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位。第29頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點(diǎn)：

1.標(biāo)本染色前不經(jīng)過(guò)鋨酸固定、脫水、包埋等過(guò)程，抗原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應(yīng)。

2.可在免疫反應(yīng)陽(yáng)性部位定位做超薄切片，提高電鏡下的檢出率。

3.適于含抗原量較少的組織。

缺點(diǎn)：

由于經(jīng)過(guò)一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結(jié)構(gòu)的損傷。第30頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋后染色

組織標(biāo)本經(jīng)固定、脫水及樹脂包埋，制成超薄切片后，再進(jìn)行免疫組化染色。

注意點(diǎn)：

1、OsO4可使抗原活性明顯降低。

2、銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。

3、在免疫組化處理的全過(guò)程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面濕潤(rùn)，以免影響抗原活性。第31頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點(diǎn)：

超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡(jiǎn)便，陽(yáng)性結(jié)果有高度的可重復(fù)性，同一張切片上可進(jìn)行多重免疫染色。缺點(diǎn)：

抗原活性在電鏡生物樣品處理過(guò)程中可能減弱甚至喪失；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等。第32頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天超薄冰凍切片染色將組織置于2.3mol/l蔗糖液中，投入液氮中速凍，在冰凍超薄切片機(jī)上切片。優(yōu)點(diǎn)：樣品抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)：需配備冰凍超薄切片機(jī)，且技術(shù)難度較大。第33頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

不論哪一種免疫電鏡技術(shù)都面臨微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存和組織中抗原活性的保存這一對(duì)矛盾。如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存，但抗原活性有影響；而H2O2能增加樹脂穿透性，但對(duì)微細(xì)結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品的處理過(guò)程中，應(yīng)同時(shí)注意到這兩方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應(yīng)注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會(huì)影響特異性反應(yīng)物的顯示和觀察。第34頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫電鏡膠體金標(biāo)記法第35頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

金標(biāo)法是Faulk和Taylor在1971年提出的，并首先用于免疫電鏡。金標(biāo)法是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負(fù)電荷的性質(zhì)，使其與抗體相吸附，從而將抗體標(biāo)記。

LM:金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，呈鮮艷的櫻紅色

EM:金顆粒具有很高的電子密度，清晰可見第36頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記抗體不復(fù)雜，對(duì)微細(xì)結(jié)構(gòu)損傷小。金顆粒電子密度高，在TEM下清晰可見。利用不同直徑的金顆粒標(biāo)記不同的抗體，是研究突出小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)共存的有力工具。由抗原抗體反應(yīng)部位結(jié)合金顆粒數(shù)量的多少可以進(jìn)行粗略的免疫細(xì)胞化學(xué)定量分析?？梢詫?duì)培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行標(biāo)記定位。金具有強(qiáng)烈的激發(fā)電子能力----可以用于TEM和SEM的觀察。金標(biāo)液無(wú)毒性，對(duì)人體無(wú)害。膠體金被科技工作者認(rèn)為是當(dāng)前最理想的標(biāo)記物之一。第37頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天操作步驟

應(yīng)用于電鏡水平的免疫金染色法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對(duì)細(xì)胞膜的穿透性差，一般只用于細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記；細(xì)胞內(nèi)部的抗原標(biāo)記普遍采用包埋后染色。第38頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天包埋后染色1.超薄切片厚50~70nm左右，載于200~300網(wǎng)孔的鎳網(wǎng)上。

2.置1%H2O2內(nèi)10min至1h，增進(jìn)樹脂穿透性，有利于抗體進(jìn)入。滴入1%H2O2液1滴于蠟板上，將網(wǎng)的載片面輕浮于液滴上。

3.雙蒸水洗3次，每次10min，第一、二次洗法如步驟2，浮于液滴上，第三次以盛有雙蒸水的加樣器沿鎳網(wǎng)面沖洗，水流應(yīng)有適當(dāng)壓力，但不易過(guò)強(qiáng)，用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。

4.浮于正常羊血清（1:50~1:100）滴上，室溫30~60min，以飽和固定劑中的游離醛基占據(jù)非特異性結(jié)合部位，以阻斷非特異性吸附。

5.PBS漂洗3min，3次。第39頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.濾紙吸干，孵育于第一抗體血清上，先室溫預(yù)孵1h，再置于4℃冰箱24~36h。（從冰箱取出后需室溫放置1h）

7.PBS漂洗3min，3次。

8.PBS（內(nèi)含1%的牛血清白蛋白，PH8.2）中5min，此步為膠體金結(jié)合做準(zhǔn)備。

9.膠體金標(biāo)記抗體液1:30~1:100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育1h。

10.雙蒸水洗3min，3次。如作雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過(guò)來(lái)，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟2~10。

11.枸櫞酸鉛染色5min，然后雙蒸水洗。

12.飽和醋酸鈾染色5min，雙蒸水洗凈。

13.電鏡觀察。第40頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天應(yīng)用第41頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第42頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第43頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天組織內(nèi)雌激素受體的CG-HRP-E2標(biāo)記技術(shù)第44頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天

雌激素受體(ER)除存在于性器官外，幾乎在全身器官或多或少的存在。對(duì)相應(yīng)的組織進(jìn)行ER的定性、定量檢查，對(duì)研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療都有重要意義。有生化法、組化法、組化免疫法及新近發(fā)展起來(lái)的單克隆抗體，已有學(xué)者對(duì)這些方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。近來(lái)有的作者用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)雌二醇(E2)檢測(cè)乳腺癌水平，并廣泛地得到應(yīng)用。上述方法均缺乏精確的定性和定量研究南醫(yī)大電鏡室首次將膠體金(CG)與HRP偶聯(lián)E2結(jié)合作為配體形成了CG-HRP-E2，使ER在電鏡下顯示，可在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行定位和定量分析。第45頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)果HRP-E2在LM下顯示CG-HRP-E2在EM下顯示相應(yīng)的靶細(xì)胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)有不同程度的膠體金顆粒分布附表：細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)的ER平均密度(顆粒數(shù)/0.12nm2)種類例數(shù)胞漿內(nèi)胞核內(nèi)增生期間腺細(xì)胞102.15±1.802.96±2.233.26±2.54增生期間質(zhì)細(xì)胞101.50±1.22腺癌細(xì)胞61.34±1.813.22±1.28第46頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天第47頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天討論CG穩(wěn)定，迅速吸附蛋白質(zhì)而不改變生物活性E2對(duì)靶細(xì)胞內(nèi)ER有高度親和力與專一性HRP和CG都是標(biāo)記物創(chuàng)新之處在于把CG與HRP-E2（有售）相結(jié)合，形成CG-HRP-E2標(biāo)記物，能很好標(biāo)記靶細(xì)胞內(nèi)的胞漿和胞核受體HRP-E2與CG-HRP-E2結(jié)果完全吻合在超微結(jié)構(gòu)水平上進(jìn)行精確的定性和定量方法可靠，試劑來(lái)源易，價(jià)格低廉本科研（國(guó)家自然科學(xué)基金資助—免疫電鏡細(xì)胞化學(xué)部分）結(jié)果證明靶細(xì)胞中，核內(nèi)ER明顯多于漿內(nèi)ER，為30年來(lái)關(guān)于核受體或漿受體的爭(zhēng)論提供了一個(gè)有力的科學(xué)檢測(cè)手段第48頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞形態(tài)立體計(jì)量學(xué)第49頁(yè),共56頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞形態(tài)立體計(jì)量學(xué)的意義是對(duì)細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)成分的形態(tài)進(jìn)行定量分析的一種方法，也就是用立體學(xué)的方法來(lái)分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（膜結(jié)構(gòu)、顆粒結(jié)構(gòu)、纖維結(jié)構(gòu)）從二維圖像推導(dǎo)三維空間結(jié)構(gòu)，要用到幾何概率論等一些數(shù)學(xué)方法，這一套方法稱為立體學(xué)（Stereology）。將立體學(xué)的方法用在細(xì)胞形態(tài)的分析上，就是形態(tài)計(jì)量學(xué)（CellMorphometry）第50頁(yè),共56頁(yè)，2024年2