組織學技術特殊染色

關于組織學技術特殊染色特殊染色用于顯示標本中的一些結構，使其在顯微鏡下與其它組織或細胞區(qū)別.

特殊染色單一特殊染色復合特殊染色一種染料對一種組織結構或細胞進行染色多種染料對多種組織結構或細胞進行染色第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天糖原染色方法：

糖原為細胞內(nèi)的多糖或粘多糖，肝細胞和肌細胞內(nèi)的糖原最多。糖原的多少，可以反映機體糖代謝的情況。例如：先天性糖代謝紊亂-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、淋巴肉瘤、間皮瘤、腎上腺瘤，肝細胞內(nèi)都可聚集過多的糖原。

第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天★過碘酸-雪夫反應（periodicacidSchiffreaction，PAS)原理：

用過碘酸氧化多糖結構的碳鍵，

使其形成2-醛基，與無色的品紅結合生成紫紅色品紅復合物，沉淀于細胞內(nèi)糖原分布部位，從而可證明多糖或粘多糖的存在。

第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1、試劑配制（1）1%過碘酸水溶液：過碘酸1g

雙蒸水100ml

將過碘酸溶于雙蒸水中（2）Schiff試劑：雙蒸水200ml

堿性品紅1g1mol/L鹽酸20ml偏重亞硫酸鈉2g（或亞硫酸氫鈉）活性炭300mg第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

※

雙蒸水煮沸后離火，慢慢加入品紅，攪拌至完全溶解，冷卻至50℃時過濾，加入鹽酸，冷卻至25℃時加入偏重亞硫酸鈉搖蕩，密封置于暗處或4℃冰箱內(nèi)24h。溶液呈草黃色時，加入活性炭搖蕩1min快速過濾。避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天(3)亞硫酸氫納溶液10%偏重亞硫酸氫納5ml1mol/L鹽酸5ml蒸餾水90ml用前配制(4)1mol/L鹽酸36%鹽酸85.6ml蒸餾水914.4ml第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天2、染色步驟（1)切片入1%過碘酸液氧化2-5min。

充分水洗后，過蒸餾水。（2）入Schiff液10-20min（室溫暗處）（3）入亞硫酸氫納液洗3次每次2min

（去非特異性染色）流水沖洗10min，

過蒸餾水。（4)Mayer蘇木精復染2-3min。流水沖洗，

過蒸餾水，吸干。從95%乙醇開始脫水、透明、封片。第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3、對照用1%淀粉糖化酶處理對照片20min.或用唾液（無氣泡）消化對照片30min2次。4、結果細胞內(nèi)糖原呈紫紅色；對照片為陰性第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天5、注意事項：（1）糖原易溶于水，要用冷Carnoy液固定（2）配制Schiff試劑堿性品紅雜質(zhì)太多，或亞硫酸氫納潮解，都不能使堿性品紅脫色；盛Schiff試劑的瓶子不宜過大，以免SO2逸出；若Schiff試劑變成粉紅色即失效。Carnoy固定液:取純乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。一般固定1-2h。固定后的組織塊可直接入95%的乙醇脫水。第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天疏松結締組織各種成分顯示方法：疏松結締組織中含有：膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維；巨噬細胞、肥大細胞。

第13頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一、網(wǎng)狀纖維

分布：肝、腎、脾、淋巴結等器官內(nèi)。纖維直徑0.2-2.0μm，分支多，交織成網(wǎng)。網(wǎng)狀纖維主要由Ⅲ型膠原蛋白組成，表面被覆糖蛋白，在鍍銀切片呈黑色稱為嗜銀纖維。

第14頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Gomoris鍍銀法顯示網(wǎng)狀纖維1、取材：淋巴結2、試劑配制（1）硝酸銀溶液：硝酸銀10.2g，溶于100ml蒸餾水。（2）氫氧化鈉溶液：氫氧化鈉3.1g，溶于100ml蒸餾水。

第15頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（3）銀氨溶液的配置：取5ml

硝酸銀溶液，緩慢滴加氨水至溶液變得清亮；再加入5ml氫氧化鈉溶液，此時溶液變黑色再滴加氨水至溶液清亮后，補加4滴氨水，加蒸餾水稀釋至100ml，保存于棕色瓶中備用。第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（4）高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5g，

蒸餾水95ml，3%硫酸5ml（5）氯化金溶液：氯化金0.2g，

蒸餾水100ml（6）草酸溶液：草酸2ml，蒸餾水98ml（7）硫酸鐵溶液：硫酸鐵2g，

蒸餾水100ml（8）甲醛溶液：甲醛20ml，

蒸餾水80ml第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

3、染色程序（1）新鮮組織10%甲醛固定，石蠟切片，

常規(guī)脫蠟入水；（2）入高錳酸鉀溶液中5min，水洗1min；（3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min；（4）硫酸鐵中媒染2min，水洗1min；

第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（5）銀氨溶液中處理1-5min（25℃），

蒸餾水洗2次，各2min；（6）甲醛溶液中還原5min，

蒸餾水洗2次，各2min；（7）氯化金溶中調(diào)色1-3min，蒸餾水洗2次；（8）95%及無水乙醇脫水，

二甲苯透明，中性樹膠封片。

第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天4、結果

淋巴結內(nèi)可見黑色網(wǎng)狀纖維，粗細不等，交織成網(wǎng)。5、注意事項配制氨銀時氨液不可過多。第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、彈性纖維

分布廣泛，彈性纖維較細，直徑0.2-1.0μm，交織成網(wǎng)。富有彈性，與膠原纖維交織在一起。彈性纖維核心部分由均質(zhì)的彈性蛋白組成；外周覆蓋微原纖維。在皮膚學和檢測幼年機體組織中的彈性結構。常用的顯示彈性纖維的染色有：地衣紅染色、Gomoris醛品紅染色、Weigert染色等。第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天地衣紅染色顯示彈性纖維1、取材皮下組織2、染液配制地衣紅染液：

地衣紅0.1g，70%乙醇100ml，硝酸2ml。3、染色程序（1）石蠟切片脫蠟下行至70%乙醇。（2）地衣紅染液，室溫，12h或過夜，或37℃,15-30min.（3）70%乙醇分色，必要時可用0.5%-1%鹽酸乙醇分色，去除膠原纖維顏色。（4）常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。4、結果彈性纖維為棕紅色，背景淡棕色。第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、膠原纖維膠原纖維，粗細不等，直徑0.5-10μm，波浪狀，有分支交織成網(wǎng)。膠原纖維由Ⅰ型膠原蛋白組成。膠原纖維對酸性染料的親和力強，如常用的酸性復紅及苯胺藍等，對膠原纖維有選染性，而其它組織不易著色，從而有利于其他組織的復染。顯示膠原纖維的主要方法：如vanGieson法、Mallory法、Masson法等。第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Masson′s三色染色法顯示膠原纖維1、取材：皮下組織或腸系膜鋪片2、固定：Zenker\Bouin\10%中性福爾馬林緩沖液3、染液配制（1）Weigert鐵蘇木精A液：蘇木精10g,95%乙醇100mlB液：29%三氯化鐵水溶液4ml25%鹽酸1ml

蒸餾水95ml用時甲乙兩液等份混合，只能用數(shù)天。第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（2）Masson酸性復紅染液：酸性復紅1g，冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。（3）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液：磷鉬酸2.5g，磷鎢酸2.5g，蒸餾水100ml。（4）苯胺藍染液：苯胺藍2.5g，冰醋酸2ml，蒸餾水100ml。（5）1%醋酸水溶液：冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

4、染色步驟（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水。（2）Weigert鐵蘇木精染色，10-20min。（3）流水沖洗，10min，光鏡下查看。也可用1%鹽酸乙醇（70%）分色。流水沖洗，5min，蒸餾水浸洗。第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（4）Masson酸性復紅染液，15min，蒸餾水洗。（5）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液分色，10-15min，或至膠原纖維無紅色。（6）苯胺藍染液，10-20min，蒸餾水洗。（7）1%醋酸水溶液分色，3-5min。鏡下查看分色程度。（8）95%乙醇脫水上行，二甲苯透明，樹膠封固。

第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天5、結果：膠原纖維為藍色；肌纖維為紅色，細胞核為黑色。6、注意事項：標本為10%福爾馬林固定，切片染色前需用Bouin再固定，56℃固定1h，或室溫過夜。第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天伊紅-醛復紅染色法

同時顯示膠原纖維和彈性纖維

Gomori氏醛-復紅染液是Gomori在試驗期間偶然發(fā)現(xiàn)的由堿性品紅、三聚乙醛、濃鹽酸配制而成。一、試劑配制Gomori醛-復紅染液：70%乙醇100ml，堿性品紅0.5g，三聚乙醛1ml，濃鹽酸1ml。※注意：先將堿性品紅溶于乙醇中，然后加入三聚乙醛和濃鹽酸，靜置1-2d，待溶液變?yōu)樯钭仙螅^濾置于冰箱待用。

第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天三、制作過程1、取皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干。2、放在甲醛-乙醇固定液內(nèi)固定5min；3、水洗3min；4、置于醛-復紅染液中，室溫下染色5min；5、水洗5min；6、置伊紅染液中，染色30s；7、常規(guī)脫水、透明、封片。四、結果膠原纖維為紅色，長帶狀，波浪狀走行；

彈性纖維為紫色，細絲狀，直行，末端卷曲。二、取材皮下組織第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天甲苯胺藍染色顯示肥大細胞肥大細胞內(nèi)含粗大的嗜堿性、異染性的水溶性顆粒，顆粒內(nèi)含有組胺、肝素等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖類，能夠與甲苯胺藍、美籃、中性紅、硫堇等染料結合。

第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天1、取材皮下組織2、固定Carnoy液或10%中性福爾馬林液皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干后固定，

或石蠟切片，冰凍切片更好3、染液配制甲苯胺藍溶液：甲苯胺藍0.2g60%乙醇100ml

混勻即可反復使用。第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天4、染色過程（1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水；（2）入甲苯胺藍溶液染色，室溫10-30min；（3）蒸餾水洗；（4）丙酮或100%乙醇脫水兩次，各2min；（5）二甲苯透明，樹膠封固。5、結果肥大細胞顆粒呈紫色，核淺藍色。第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天胰島內(nèi)分泌細胞Masson′s三色染色法胰島在胰尾部分布較多，胰島細胞由A、B、D、PP四種細胞組成，細胞間有豐富的毛細血管。用Masson′s，Mallory等特殊染色方法可區(qū)別A、B、D細胞。1、取材胰腺2、固定Zenker\Bouin\10%甲醛

第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3、染液配制（1）麗春紅酸性品紅液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.4g，冰醋酸1ml，

蒸餾水99ml，用1%的冰醋酸溶解麗春紅和酸性品紅。（2）2%亮綠液：亮綠2g，冰醋酸2ml

蒸餾水98ml，用2%冰醋酸溶解亮綠。第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天4、染色程序（1）切片脫蠟至水；（2）入0.5%碘乙醇5-10min，

自來水洗，蒸餾水洗；（3）入0.5%硫代硫酸鈉3-5min；（4）Weigert鐵蘇木精10-20min，自來水洗；（5）1%鹽酸乙醇分化，自來水洗藍化；

第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天（6）入麗春紅酸性品紅液3-5min，蒸餾水速洗；（7）入1%磷酸鉬水溶液5min；（8）傾去磷酸鉬，直接用2%亮綠液染3-5min；（9）0.5%冰醋酸沖洗切片，將亮綠全部洗掉；（10）95%乙醇，無水酒精脫水，

二甲苯透明，樹膠封固。

第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天5、結果

A細胞染成紅色，位于胰島周邊；B細胞染成紫紅色，位于胰島中央；D細胞染成綠色，位于A細胞與B細胞之間。6、注意用10%甲醛固定，

再用重鉻酸鉀液處理，

也獲得較好效果。第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天甲綠-派若寧染色顯示DNA和RNA染色原理：甲綠和派若寧是堿性染料，

染色中甲綠-派若寧染色與DNA和RNA的聚合程度有關。甲綠與聚合程度高的DNA親和力較強；派若寧與聚合程度低的RNA有親和力。一、固定Zenker\Carnoy(4℃)

第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天二、染液配制1、2%甲綠水溶液：甲綠2g，蒸餾水100ml※甲綠提純法：將甲綠溶解后，放入分液漏斗中，加等量的純氯仿洗，充分搖蕩數(shù)分鐘，靜置，待液體分層，放掉下層紫色氯仿液。按此法反復洗，直至洗不下紫色為止，需洗5次左右。4℃保存。2、2%派若寧水溶液：派若寧2g，蒸餾水100ml此液提純，應按甲綠方法進行。

第46頁,共52頁，2024年2月25日，星期天3、醋酸緩沖液（pH值4.8）：0.2mol/L醋酸41ml，

0.2mol/L醋酸鈉59ml。4、甲綠-派若寧