蛋白質的空間結構

關于蛋白質的空間結構蛋白質分子中的結構層次

一級結構→二級結構→超二級結構→結構域→三級結構→亞基→四級結構第2頁,共115頁，2024年2月25日，星期天定義蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。一、蛋白質的一級(共價)結構主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。

第3頁,共115頁，2024年2月25日，星期天N末端C末端牛核糖核酸酶第4頁,共115頁，2024年2月25日，星期天一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學功能的基礎。第5頁,共115頁，2024年2月25日，星期天胰島素的一級結構

蛋白質的根本差異在于一級結構的不同第6頁,共115頁，2024年2月25日，星期天多肽鏈中氨基酸序列分析——一級結構測定準備工作：樣品純度97%以上；測定蛋白質的相對分子質量（允許誤差10%左右）測定肽的數(shù)目；測定氨基酸組成第7頁,共115頁，2024年2月25日，星期天多肽鏈中氨基酸序列分析

分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成（純度97%以上）

測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基

把肽鏈水解成片段，分別進行分析

測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序結果。第8頁,共115頁，2024年2月25日，星期天胰蛋白酶：水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵；糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：水解芳香族氨基酸【苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）】等氨基酸殘基的羧基形成的肽鍵。胃蛋白酶：專一性較差，主要水解Glu、Asp或其他氨基酸的側鏈。第9頁,共115頁，2024年2月25日，星期天則其氨基酸排列順序為：

Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys如測一個九肽測得N端氨基酸殘基為Thr又分別測得片段:

Ala-Ala-Trp-Gly-Lys

Val-Lys-Ala-Ala-TrpThr-Asn-Val-Lys第10頁,共115頁，2024年2月25日，星期天例1：某五肽先經(jīng)酸水解再經(jīng)堿水解，得到摩爾數(shù)相等的五種氨基酸（Ala、Cys、Lys、Phe和Ser）混合物，用Edman分析法進行N端分析，獲得PHT-Ser；經(jīng)胰蛋白酶水解可得到一種N端為Cys的三肽和另一種N端為Ser的二肽；用胰糜蛋白酶水解上述三肽，得到Ala和另一個二肽。問該五肽的氨基酸順序怎樣？解答：1、是一個N端為Ser的五肽；2、胰蛋白酶的水解部位是Lys或Arg的羧基端肽鍵，因為得到一種N端為Ser的二肽，因此第二位為Lys；3、經(jīng)胰蛋白酶水解可得到一種N端為Cys的三肽，所以第三位為Cys；4、因為胰糜蛋白酶只水解芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，水解上述三肽，得到Ala和另一個二肽，所以三肽為：Cys-Phe-Ala5、整個五肽的順序為Ser-Lys-Cys-Phe-Ala。第11頁,共115頁，2024年2月25日，星期天例2：

當一種4肽與FDNB反應后,用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val及3種其他氨基酸;當這4肽用胰蛋白酶水解時發(fā)現(xiàn)有兩種碎片段，其中一片用LiBH4還原后再進行酸水解,水解液內(nèi)有氨基乙醇和一種在有濃硫酸條件下能與已醛酸反應產(chǎn)生紫(紅)色產(chǎn)物的氨基酸.試問這4肽的一級結構是由哪幾種氨基酸。（LiBH4還原羧酸成為醇類，可使C-末端AA還原為相應的氨基醇。）1、分析：FDNB即2，4-二硝基氟苯，在弱堿性溶液中可與肽鏈N-末端的氨基酸生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。鹽酸水解可以打開所有的肽鏈，使蛋白質或者多肽變?yōu)橛坞x的氨基酸。LiBH4還原羧酸成為醇類，可使C-末端AA還原為相應的氨基醇。胰蛋白酶可專一性水解由堿性氨基酸（lys，Arg）羧基端形成的肽鍵。第12頁,共115頁，2024年2月25日，星期天解題：（1）四肽與FDNB反應后，用5.7mol/LHCl水解得到DNP-Val，證明N端為Val；

（2）LiBH4還原后再水解，水解液中有氨基乙醇，Gly是氨基乙酸，證明肽的C端為Gly；

（3）水解液中有在濃H2SO4條件下能與乙醛酸反應產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物的氨基酸，說明此氨基酸為Trp；

（4）根據(jù)胰蛋白酶的專一性，得知此肽鍵-COOH末端是Lys或者Arg；

根據(jù)以上結果可知道四肽的順序：Val·Lys·Trp·Gly或者Val·Arg·Trp·Gly。第13頁,共115頁，2024年2月25日，星期天二、蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。蛋白質多肽鏈本身的折疊盤繞方式。定義

主要的化學鍵：

氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力

第14頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（一）酰胺平面參與形成肽鍵的4個原子（C、O、N、H）和與之相連的2個-碳原子（

C

1、C

2）共處于同一平面上，形成酰胺平面，或稱肽鍵平面，肽平面，肽單元。C

1和C

2在平面上所處的位置為反式(trans)構型。第15頁,共115頁，2024年2月25日，星期天它是蛋白質構象的基本結構單位第16頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

（二）蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

第17頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1、

-螺旋結構要點:①從N端為起點，多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成右手螺旋，側鏈伸向螺旋外側。第18頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

第19頁,共115頁，2024年2月25日，星期天多個肽鍵平面通過α-碳原子旋轉，相互之間緊密盤曲成穩(wěn)固的右手螺旋。每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定（氫鍵是穩(wěn)定α－螺旋的主要鍵），氫鍵與螺旋長軸基本平行。主鏈呈螺旋上升，每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，沿軸旋轉1000，每3.6個氨基酸殘基上升一圈，相當于上升高度(螺距)0.54nm，螺旋的直徑約為0.5nm。α－螺旋的結構特點第20頁,共115頁，2024年2月25日，星期天例題：一個α螺旋片段含有180個氨基酸殘基，該片段中有多少圈螺旋？計算該α-螺旋片段的軸長。

解答：180/3.6=50圈，50×0.54=27nm，該片段中含有50圈螺旋，其軸長為27nm。例題：一個含有78個氨基酸殘基的α螺旋的軸長是多少？此多肽的α螺旋完全伸展時多長？

解答：78×0.15=11.7nmα螺旋每圈螺旋占3.6個氨基酸殘基，故該α螺旋圈數(shù)為：78÷3.6圈；α螺旋的直徑約為0.5nm，故每圈軸長為0.5πnm。

完全伸展的α螺旋長度約為：0.5π×（78÷3.6）≌34.01nm第21頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共115頁，2024年2月25日，星期天多肽鏈充分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。2、-折疊第23頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

-折疊②

-折疊結構的肽鏈幾乎是完全伸展的，兩段以上的β-折疊結構平行排列，兩鏈間可順向平行，也可反向平行，反平行結構更為穩(wěn)定。③兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固β-折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。第24頁,共115頁，2024年2月25日，星期天反平行第25頁,共115頁，2024年2月25日，星期天平行第26頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3、-轉角蛋白質多肽鏈經(jīng)常出現(xiàn)180?的回折，這種肽鏈回折處的稱為

-轉角（

-tern）或

-bend，或稱發(fā)夾結構（hairpinstructure）。第27頁,共115頁，2024年2月25日，星期天一般由四個連續(xù)的氨基酸殘基組成，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。第28頁,共115頁，2024年2月25日，星期天4、Ω環(huán)Ω環(huán)多存在于球狀蛋白質分子中，形狀像“Ω”，稱為Ω環(huán)（Ωloop）。由6-16個氨基酸殘基組成第29頁,共115頁，2024年2月25日，星期天5、無規(guī)卷曲（自由回轉）是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結構。酶的功能部位常位于這種構象區(qū)域H2NCOOH第30頁,共115頁，2024年2月25日，星期天氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈的氨基酸殘基的側鏈適合形成

-螺旋或β-折疊時，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。第31頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1、超二級結構（Supersecondarystructure）在蛋白質分子中，由若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結構組合體。

幾種類型的超二級結構：ααβββαβ（三）二、三級過渡態(tài)——

蛋白質的超二級結構和結構域第32頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2、結構域多肽鏈在超二級結構基礎上進一步繞曲折疊成較為緊密的近似球狀或纖維狀、具有部分生物功能的結構，稱為結構域(domain)大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。第33頁,共115頁，2024年2月25日，星期天纖連蛋白分子的結構域丙糖磷酸異構酶第34頁,共115頁，2024年2月25日，星期天三、蛋白質的三級結構（二）主要的化學鍵非共價鍵：疏水鍵:多肽鏈上疏水性較強的氨基酸的非極性側鏈避開水相自相粘附聚集在一起，形成空穴。離子鍵（鹽健）:由蛋白質中正、負電荷的側鏈基團相互接近，通過靜電吸引而形成的基團之間的作用力。氫鍵：范德華力等（一）定義：整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。由一個或多個結構域組裝而成的結構。第35頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

肌紅蛋白(Mb)N端C端第37頁,共115頁，2024年2月25日，星期天亞基之間的結合力主要是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布、亞基間通過非共價鍵聚合而成的特定構象，稱為蛋白質的四級結構。由多條多肽鏈組成的蛋白質，肽鏈間相互以非共價鍵聯(lián)結成一個活性單位，這種肽鏈就稱為該蛋白質的亞基。第38頁,共115頁，2024年2月25日，星期天血紅蛋白（Hb）的四級結構第39頁,共115頁，2024年2月25日，星期天從一級結構到四級結構血紅蛋白第40頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的一級結構是它的氨基酸序列，維系蛋白質分子的一級結構的鍵：肽鍵、二硫鍵蛋白質的二級結構是由氫鍵導致的肽鏈卷曲與折疊Primary

structureSecondary

structure第41頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的三級結構是多肽鏈自然形成的三維結構蛋白質的四級結構是亞基的空間排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure第42頁,共115頁，2024年2月25日，星期天維系蛋白質分子空間結構：疏水鍵氫鍵范德華力鹽鍵（離子鍵）第43頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質結構與功能的關系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)第44頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（一）一級結構是空間構象的基礎一、蛋白質一級結構與功能的關系牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵第45頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性第46頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（二）一級結構與功能的關系例：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)第47頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

這種由蛋白質分子一級結構的氨基酸排列順序發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。正常紅細胞鐮刀形細胞第48頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（一）肌紅蛋白與血紅蛋白的結構二、蛋白質空間結構與功能的關系目錄第49頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合，Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。第50頁,共115頁，2024年2月25日，星期天肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線第51頁,共115頁，2024年2月25日，星期天*協(xié)同效應(cooperativity)一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應。如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應

(negativecooperativity)第52頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共115頁，2024年2月25日，星期天O2血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。第54頁,共115頁，2024年2月25日，星期天變（別）構效應(allostericeffect)某些蛋白質表現(xiàn)其生物學功能時，構象發(fā)生改變，從而改變了整個分子的性質，這種現(xiàn)象稱為別構效應。第55頁,共115頁，2024年2月25日，星期天(R)relaxedstate(T)tensestate

血液中O2的運輸(HbR/T態(tài)的互換)Lung氧分子Hemoglobin血紅蛋白Myoglobin肌紅蛋白Muscle靜脈動脈環(huán)境氧濃度高時Hb快速吸收氧分子環(huán)境氧濃度低時Hb迅速釋放氧氣任何一個亞基接受O2后，會增加其他亞基吸收O2的能力釋放氧氣后Hb變回

Tstate第56頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（三）蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象疾病：若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。第57頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。第58頁,共115頁，2024年2月25日，星期天瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第59頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)蛋白質的理化性質與分離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein第60頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的兩性離解和電泳現(xiàn)象蛋白質的膠體性質蛋白質的沉淀作用蛋白質的變性蛋白質的紫外吸收一、蛋白質的理化性質第61頁,共115頁，2024年2月25日，星期天1、蛋白質的兩性解離和電泳現(xiàn)象蛋白質分子與多肽、氨基酸一樣，除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。蛋白質的兩性解離性質使其成為人體及動物體中的重要緩沖劑，調節(jié)體液正常pH。蛋白質第62頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當?shù)鞍踪|溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。在等電點時，蛋白質較穩(wěn)定，其溶解度、導電性、黏度、滲透壓等皆最小（制備或沉淀蛋白質），在電場中不移動（分離蛋白質）。第63頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電化學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。第64頁,共115頁，2024年2月25日，星期天電泳蛋白質在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現(xiàn)象。利用蛋白質的電泳現(xiàn)象，可以將蛋白質進行分離純化。第65頁,共115頁，2024年2月25日，星期天例題根據(jù)蛋白質等電點，指出下列蛋白質在所指定的pH條件下，電泳時的泳動方向：

(1)胃蛋白酶(pI

1.0)，在pH

5.0；帶負電，向正極泳動

(2)血清清蛋白(pI

4.9)，在pH

6.0；帶負電，向正極泳動

(3)α-脂蛋白(pI

5.8)，在pH

5.0和pH

9.0；

在pH

5.0時帶正電，向負極泳動；在pH

9.0帶負電，向正極泳動

第66頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。因此，它在水中能夠形成膠體溶液。*蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜第67頁,共115頁，2024年2月25日，星期天+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉第68頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現(xiàn)象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。第69頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質的沉淀作用蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質的溶解性質，在適當?shù)臈l件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。第70頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的沉淀作用根據(jù)蛋白質的親水膠體性質，當其環(huán)境發(fā)生改變（加入適當?shù)脑噭┦沟鞍踪|分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層）時，蛋白質的膠體溶液就不再穩(wěn)定并將發(fā)生沉淀作用(Precipitation)。沉淀法具有部分純化、濃縮特點。第71頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質的沉淀作用（1）可逆沉淀：在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉淀劑，可使蛋白質重新溶于原來的溶液中。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。第72頁,共115頁，2024年2月25日，星期天因為蛋白質分子量大小不同、表面所代電荷不同、表面的親水和疏水區(qū)域不同，所以可以通過可逆沉淀法將蛋白質分離出來。可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。第73頁,共115頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質的沉淀作用（2）不可逆沉淀：在強烈沉淀條件下，蛋白質發(fā)生沉淀后不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產(chǎn)生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水，不易再溶于強酸和強堿中，不能用透析等方法除去沉淀劑后使蛋白質重新溶于原來的溶液中。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。第74頁,共115頁，2024年2月25日，星期天使蛋白質沉淀的試劑：1.高濃度中性鹽：（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl

這種加入鹽中和蛋白質的電荷，使蛋白質沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質分離制備。2.有機溶劑：丙酮、乙醇

破壞蛋白質水膜3.重金屬鹽：

Hg2+、Ag+、Pb+

與蛋白質中帶負電基團形成不易溶解的鹽4.生物堿試劑：苦味酸、三氯乙酸、目酸、鎢酸等

與蛋白質中帶正電荷的基團生成不溶性鹽第75頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質的性質與它們的結構密切相關。蛋白質的變性(denaturation)：在某些物理和化學因素作用下，蛋白質特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，引起其理化性質改變并導致其生物活性喪失的現(xiàn)象。4、蛋白質的變性第76頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

變性的本質——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。

造成變性的因素熱、紫外光、乙醇等有機溶劑、激烈的攪拌、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。第77頁,共115頁，2024年2月25日，星期天蛋白質變性后的性質改變：

變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。溶解度降低粘度增加結晶能力消失生物活性喪失易受蛋白酶水解第78頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

應用舉例臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。豆腐的制作急救：中毒后灌豆?jié){、牛奶等煮熟食物方便消化防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

第79頁,共115頁，2024年2月25日，星期天若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。第80頁,共115頁，2024年2月25日，星期天

天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性第81頁,共115頁，2024年2月25日，星期天大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質在280nm附近顯示強的吸收。利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。5蛋白質的紫外吸收第82頁,共115頁，2024年2月25日，星期天6、蛋白質的顏色反應第83頁,共115頁，2024年2月25日，星期天研究蛋白質的結構、性質和功能，首先需要得到純的蛋白質樣品。(1)蛋白質來源：微生物細胞、動物細胞和植物細胞；(2)隨時測定蛋白質活性并檢測蛋白質含量。(3)分離和純化過程都必須在溫和的條件下進行。二、蛋白質分離和純化第84頁,共115頁，2024年2月25日，星期天(1)生物組織的機械破碎。常用的方法有研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等。(2)根據(jù)蛋白質的特性，選擇不同的溶劑進行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提酸性蛋白用稀堿性溶液抽提脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:離心除去固體雜質后，可通過沉淀法、超濾法、萃取法等處理，得到蛋白質粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法等進行精制。(5)成品加工：測定蛋白質的性質并干燥成成品。1．蛋白質的分離步驟第85頁,共115頁，2024年2月25日，星期天沉淀法膜分離法萃取法層析法電泳法2．蛋白質的純化方法第86頁,共115頁，2024年2月25日，星期天*鹽析：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。陰離子化合物的效果是：NH4+>K+>Na+陽離子化合物的效果是：PO43->SO42->Cl-常用的鹽為硫酸銨。不同的蛋白質由于所帶的電荷和水化程度不同，鹽析時所需的鹽的濃度也不相同，因而可以將不同的蛋白質加以分離。(1)沉淀法鹽析2．蛋白質的純化方法第87頁,共115頁，2024年2月25日，星期天在蛋白質溶液中，加入一定量的與水互溶的有機溶劑，由于這些溶劑與水的親和力強，能夠破壞蛋白質的水化層，使蛋白質的溶解度降低而沉淀。常用的有機溶劑有乙醇、甲醇和丙酮等。為了防止蛋白質在分離過程中發(fā)生變性，有機溶劑濃度不能太高(30%-50%)，而且需要在低溫條件下進行。(1)沉淀法—

有機溶劑沉淀法2．蛋白質的純化方法第88頁,共115頁，2024年2月25日，星期天(1)沉淀法—

等電點沉淀法蛋白質分子在等電點時，凈電荷為零，分子之間的靜電排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。當?shù)鞍踪|混合物溶液的pH被調到某一成分的等電點時，則該蛋白質大部或全部將沉淀出來。而那些等電點高于或低于該pH的蛋白質仍然留在溶液中。該法適用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質2．蛋白質的純化方法第89頁,共115頁，2024年2月25日，星期天（2）膜分離法——

透析法Dialysis此法是利用蛋白質分子不能透過半透膜，而使它與其它小分子化合物，如無機鹽、單糖、雙糖、氨基酸、小肽以及表面活性劑等分離。常用的半透膜有玻璃紙或高分子合成材料，截止分子量一般為一萬。2．蛋白質的純化方法第90頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法透析是將待純化的蛋白質溶液裝在用半透膜制成的透析袋內(nèi)，再將透析袋放入透析液（通常是蒸餾水或緩沖液）中進行透析。通透動力為半透膜兩側的物質濃度差。（2）膜分離法

透析法第91頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法超過濾技術是在一定的密封容器，施加一定壓力使一定分子量的物質透過超濾膜。其中包括有：中空纖維超濾器、圓筒式超濾器板式超濾器。超濾膜的截止分子量有100萬、50萬、30萬、10萬、5萬、1萬、5千和1千（道爾頓，Dr）（2）膜分離法超過濾法第92頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法超過濾法第93頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因疏水性差異而分層。不同的蛋白質在疏水層的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用兩種體系聚乙二醇－-葡聚糖聚乙二醇－-磷酸鉀（3）萃取法雙水相萃取法第94頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法由于蛋白質表面電荷性質、疏水性質不同，用有機溶劑、表面活性劑、水構成的反相膠束提取某些蛋白質。將表面活性劑溶解于有機溶劑中，等體積加入到蛋白質水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質萃取到反相膠束內(nèi)。（3）萃取法反相膠束萃取法第95頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa壓力下，CO2處于液體狀態(tài)，溫度為31.1°C，當壓力或溫度發(fā)生改變時，CO2處于氣－液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質及有機物質溶解在某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即可分離出來。（3）萃取法超臨界流體萃取法第96頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法（3）萃取法超臨界流體萃取法第97頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質進行分離的方法。離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。帶正電荷多的蛋白質與樹脂結合較強，而帶正電荷少的蛋白質與樹脂結合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質進行分離。（4）層析法

離子交換層析法第98頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法（4）層析法

離子交換層析法第99頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法此法又稱為分子篩層析、分子排阻層析。凝膠過濾所用的介質是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結構。Sephadex-葡聚糖凝膠G10-G200Sepharose-瓊脂糖凝膠2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400（4）層析法

凝膠過濾法第100頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法（4）層析法

凝膠過濾法第101頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第102頁,共115頁，2024年2月25日，星期天第103頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法利用蛋白質表面存在的疏水區(qū)域的強度、大小不同，而被吸附到連接有疏水基團的層析介質上。離子強度增大可增強吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進行梯度洗脫。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose（4）層析法疏水層析第104頁,共115頁，2024年2月25日，星期天2．蛋白質的純化方法這是一種高效分離純化蛋白的方法。