植物發(fā)育生物學(xué)研究方法

關(guān)于植物發(fā)育生物學(xué)研究方法2發(fā)育生物學(xué)遺傳學(xué)生物化學(xué)細(xì)胞學(xué)生理學(xué)分子生物學(xué)免疫學(xué)發(fā)育生物學(xué)在生命科學(xué)中的地位第2頁,共53頁，2024年2月25日，星期天植物發(fā)育生物學(xué)常用研究方法及原理突變體庫構(gòu)建基因沉默（RNAi）蛋白質(zhì)互作研究第3頁,共53頁，2024年2月25日，星期天突變體的誘導(dǎo)與選擇

正向遺傳學(xué)第4頁,共53頁，2024年2月25日，星期天突變體的誘導(dǎo)與選擇隨著大量物種全基因組序列測序完成，對基因的研究進(jìn)入了以功能基因組學(xué)為代表的后基因組時代。功能基因組學(xué)是在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)豐富信息資源的基礎(chǔ)上，利用植物全基因組序列的信息，應(yīng)用各種實(shí)驗(yàn)方法并結(jié)合統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)方法研究和分析基因的表達(dá)、調(diào)控與功能以及植物的生長、發(fā)育規(guī)律的學(xué)科。要了解植物體內(nèi)各基因的生物學(xué)功能，如何協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，參與一系列的生長發(fā)育過程，就需要我們精確了解每個基因的功能及基因間的相互作用；構(gòu)建基因突變體庫，通過突變體分析鑒定基因功能是一種最直接最有效分析鑒定基因功能的方法。第5頁,共53頁，2024年2月25日，星期天突變體的誘導(dǎo)與選擇突變體可以通過植物自發(fā)突變產(chǎn)生，不過研究中常常通過人為手段誘導(dǎo)獲得突變體。一般來說，單個植株自發(fā)突變的頻率介于千分之一至萬分之一，單個基因自發(fā)突變的頻率則介于十萬分之一至百萬分之一。除了自發(fā)突變外，體細(xì)胞無性系也會產(chǎn)生突變體。不過最常見的突變體還是通過人工誘變的方法產(chǎn)生的，如理化誘變突變體和插入突變體。自發(fā)突變是在自然條件下發(fā)生的突變，是生物變異的重要來源和自然進(jìn)化的基礎(chǔ)。但是自發(fā)突變的頻率較低，而且許多突變常常是致死型或通過表型無法鑒定而無法獲得，因此系統(tǒng)收集自發(fā)突變體存在很多困難。即使獲得感興趣的突變體，分離突變體基因和鑒定其功能也是比較困難的。第6頁,共53頁，2024年2月25日，星期天突變體選擇的概念組織培養(yǎng)篩選突變體的方法，又稱離體篩選。組織培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出的變異，體細(xì)胞無性系變異在培養(yǎng)基中加選擇壓（化學(xué)物質(zhì)）誘導(dǎo)產(chǎn)生變異，具有定向突變特征。植物細(xì)胞工程目前分為五個分支：脫毒與快速繁殖。細(xì)胞的大量培養(yǎng)。體細(xì)胞雜交。細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。無性系變異與分離突變體。后三者則主要利用遺傳變異，創(chuàng)建新種質(zhì)。第7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

離體篩選的優(yōu)點(diǎn)：離體篩選突變體的可控程度高，便于進(jìn)行定向選擇。突變頻率高，篩選群體大，在較小容器中可操作百萬到千萬個植物細(xì)胞。

離體篩選的意義：對農(nóng)作物形狀進(jìn)行遺傳改良；為細(xì)胞雜交和轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供選擇標(biāo)記，如互補(bǔ)選擇；對突變體細(xì)胞進(jìn)行遺傳及生理代謝研究。突變是遺傳變異性的終極來源，它為種群變異提供原材料。是體現(xiàn)生物多樣性和適應(yīng)多變環(huán)境的重要方式。第8頁,共53頁，2024年2月25日，星期天二、變異的類型1.農(nóng)作物的品質(zhì)改良食品的營養(yǎng)價(jià)值主要取決于種子中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，特別是氨基酸的組成和含量。谷類作物中的多數(shù)作物賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸含量偏低，而在一些豆類作物中蛋氨酸偏低。如賴氨酸含量在玉米中約為0.3%，小麥在0.34%左右。作物體內(nèi)某些特定的氨基酸在細(xì)胞內(nèi)保持一定的濃度，過高回發(fā)生毒害作用。而某些細(xì)胞一旦獲得對這些氨基酸的抗性后，可大大減輕這些毒性，從而允許細(xì)胞內(nèi)這些氨基酸及類似物的過量積累，這些氨基酸也許就是對人們特別有用的氨基酸。如獲得高賴氨酸細(xì)胞系的突變植物類型，就可達(dá)到改良品種的目的。第9頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.抗病突變體當(dāng)病原菌侵染植物組織后往往會產(chǎn)生一種毒素，破壞寄主細(xì)胞正常的代謝，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。病原毒素一般為一些次生產(chǎn)物，如糖苷、萜類、酚類或氨基酸類似物等。在培養(yǎng)基內(nèi)加入某種病原毒素可淘汰不抗病的細(xì)胞，篩選出可以抗病的細(xì)胞。第10頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3抗逆突變體耐鹽突變體的篩選是通過在培養(yǎng)基中加入高鹽濃度，甚至海水來進(jìn)行的。在鹽濃度逐漸增加的條件下，誘導(dǎo)并篩選出耐鹽的細(xì)胞系。Dix和Steet（1975）利用加入NaCl的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)辣椒和煙草，結(jié)果得到一種可在含1%～2%NaCl條件下生存的抗鹽突變細(xì)胞株，培養(yǎng)幾代在回到含鹽培養(yǎng)基中，仍具有抗鹽性。在抗鹽細(xì)胞中游離脯氨酸積累量增加，表明脯氨酸與植物抗鹽性的關(guān)系。Dix和Steet用辣椒愈傷組織細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，用甲基磺酸乙酯（EMS）作為誘變劑，在0～-3℃條件下，得到兩個抗低溫的突變細(xì)胞系?？筓V植物細(xì)胞克隆第11頁,共53頁，2024年2月25日，星期天三、變異的來源

1.離體培養(yǎng)細(xì)胞的自發(fā)突變

組織培養(yǎng)后植株變異的原因：組織培養(yǎng)過程中引起的可遺傳的變異。植株的再生方式、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、繼代培養(yǎng)的時間。由外源遺傳及生理作用引起的變異植物的細(xì)胞、組織、在離體培養(yǎng)時，由于環(huán)境條件可以人為控制和培養(yǎng)基中化學(xué)因素的影響，會發(fā)生各種各樣的變異，外植體體細(xì)胞發(fā)生的變異稱為體細(xì)胞變異第12頁,共53頁，2024年2月25日，星期天體細(xì)胞無性系變異的特征表現(xiàn)在：隨機(jī)性，無法精確地分批重復(fù)。再生植株的遺傳變異性廣，包括染色體變異，畸變，點(diǎn)突變，轉(zhuǎn)座，以及線粒體和葉綠體基因組的改變等。第13頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.人工誘發(fā)突變物理方法：主要有X射線，r射線處理，32P、14C等。有時用熱中子或快中子處理。物理誘變的好處是，使用方便，干凈，穿透力強(qiáng)，重復(fù)性好，突變頻率高，但需專門的設(shè)備?；瘜W(xué)誘變：在組織培養(yǎng)中常用化學(xué)誘變劑處理，好處是不需專門設(shè)備，操作方便，由于處理的材料是組織塊、細(xì)胞團(tuán)、游離的單細(xì)胞或原生質(zhì)體，因此可以在一定程度上克服化學(xué)誘變劑穿透力差的缺點(diǎn)。所以對培養(yǎng)組織進(jìn)行誘變，目前較多采用化學(xué)誘變劑。用各種誘導(dǎo)劑處理可以提高突變頻率10～100倍，下面介紹植物組織培養(yǎng)誘變中常用的誘變劑的種類和使用方法。第14頁,共53頁，2024年2月25日，星期天烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、乙基磺酸乙酯（EES）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲（ENH）等。烷化劑是栽培作物中誘發(fā)突變極其重要的一類化學(xué)誘變劑，它帶有許多活烷基，烷基能夠轉(zhuǎn)移到其他分子中電子密度極高的位置上去，這種通過烷基在分子內(nèi)的置換作用稱為烷基化作用。這些物質(zhì)通過磷酸基、嘌呤、嘧啶基的烷化而與DNA作用，最終引起遺傳物質(zhì)的破壞、修復(fù)與錯誤修復(fù)的各種酶促反應(yīng)而發(fā)生變異。第15頁,共53頁，2024年2月25日，星期天亞硝基胍（NTG，N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍）是已知的最強(qiáng)的化學(xué)誘變劑，在合適的條件下可產(chǎn)生很高的突變率，而致死率較低，利用濃度的不同可控制突變率的高低，常用的濃度為10～50μg/ml。用這種化學(xué)誘變劑處理后，通過離心或微孔濾膜過濾的方法收集細(xì)胞，然后用水或培養(yǎng)液洗滌后植平板。疊氮化物是在常規(guī)誘發(fā)突變中對植物誘變效果最好的一種誘變劑，在誘發(fā)大麥、豌豆、小麥、水稻等作物上都能獲得高的誘變率。對大麥葉綠素缺失突變體誘變的效果，比γ射線和中子誘導(dǎo)率高，對人毒性小，對植物引起的損傷也小。γ射線和中子誘變率為10%，疊氮化鈉誘變率為40%～50%。第16頁,共53頁，2024年2月25日，星期天四、突變體的選擇方法

1.直接選擇法通常是把細(xì)胞培養(yǎng)在一種親本細(xì)胞不能生長的培養(yǎng)基上，或親本細(xì)胞死亡的培養(yǎng)基上，即施加選擇壓。經(jīng)誘變或未經(jīng)誘變的培養(yǎng)組織都可用增加選擇壓抑制未突變細(xì)胞生長的化學(xué)物質(zhì)的方法進(jìn)行選擇。在培養(yǎng)基中施加不同的選擇壓可以對所需要的性狀進(jìn)行定向選擇。如以抗植物毒素（選擇壓）選擇抗病性，以高濃度的鹽選擇耐鹽性，以高濃度的除草劑或農(nóng)藥選擇耐藥性，以某種代謝中間產(chǎn)物為選擇壓篩選高氨基酸、高糖的優(yōu)質(zhì)谷物新品種。例如，要分離某種除草劑有抗性的突變體，首先是把培養(yǎng)的材料接種在含一系列濃度除草劑的培養(yǎng)基上，測定最低的開始抑制生長的濃度。對能進(jìn)一步生長的組織可以在含一系列濃度的除草劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行在培養(yǎng)，以確定其耐藥的最高極限濃度。第17頁,共53頁，2024年2月25日，星期天定向基因突變T-DNA插入突變轉(zhuǎn)座子插入突變第18頁,共53頁，2024年2月25日，星期天T-DNA插入法主要是利用農(nóng)桿菌Ti或Ri質(zhì)粒中的一段轉(zhuǎn)移DNA序列，從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物的基因組中。由于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)的成熟和廣泛使用，因此通過大量T-DNA獨(dú)立轉(zhuǎn)化子建立T-DNA插入突變體庫，是一種快速構(gòu)建插入突變體庫的方法之一。以擬南芥為例，目前為止，已經(jīng)構(gòu)建了22500多個擬南芥T-DNA插入突變體，獲得約360000個T-DNA插入位點(diǎn)序列，幾乎涵蓋了擬南芥整個基因組，使得研究和分析植物生長發(fā)育過程中各個相關(guān)基因的功能成為現(xiàn)實(shí)。轉(zhuǎn)座子插入法主要是利用來自于玉米的Ac和Ds轉(zhuǎn)座子能在植物基因組中跳動，且跳動后經(jīng)常以高頻率在原位點(diǎn)附近再插入從而破壞原位點(diǎn)周圍的基因?yàn)樵?。目前通過轉(zhuǎn)座子插入系統(tǒng)已經(jīng)獲得多種包括植物和微生物在內(nèi)的各種突變體庫，為分析基因在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能提高大量的材料。第19頁,共53頁，2024年2月25日，星期天基因沉默

反向遺傳學(xué)第20頁,共53頁，2024年2月25日，星期天基因沉默的概念及發(fā)現(xiàn)基因沉默（Genesilencing）是指生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)或者是表達(dá)減少的現(xiàn)象。基因沉默現(xiàn)象首先在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)現(xiàn)，接著和線蟲、真菌、昆蟲、原生動物以及才鼠中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。大量的研究表明，環(huán)境因子、發(fā)育因子、DNA修飾、組蛋白乙酰化程度、基因拷貝數(shù)、位置效應(yīng)、生物的保護(hù)性限制修飾以及基因的過度轉(zhuǎn)錄等都與基因沉默有關(guān)。第21頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi的發(fā)現(xiàn)

20多年前，在對矮牽牛（petunias）進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn)：RichJorgensen和同事將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強(qiáng)啟動子后，導(dǎo)入矮腳牽牛中，試圖加深花朵的紫顏色，結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵，多數(shù)花成了花斑的甚至白的。Jorgensen將將這種現(xiàn)象命名為協(xié)同抑制“cosuppression”，因?yàn)閷?dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中，甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。野生型

試驗(yàn)預(yù)測第22頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAinterference1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。1998，RNAi概念的首次提出。1999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。RNAi技術(shù)被《Science》評為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。至今，蓬勃發(fā)展，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。第23頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1995年，GuoS等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）中的par-1基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)：反義RNA特異性地阻斷par-1基因的表達(dá)；正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。結(jié)果:

二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。該研究小組一直沒能給這個意外以合理解釋。第24頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi的提出直到1998年2月，F(xiàn)ireA和MelloC才首次揭開這個懸疑之謎。他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱；而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。他們證實(shí)，GuoS博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNAinterference，簡稱RNAi）。

第25頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi廣泛存在于自然界隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來越為人們所重視。

第26頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi的定義

目前對RNAi(RNAinterference)的定義有很多種，如果將RNAi看作一種生物學(xué)現(xiàn)象，可以有以下定義：①RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象,它在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)。②RNAi是有dsRNA參與指導(dǎo)的，以外源和內(nèi)源mRNA為降解目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象。具有核苷酸序列特異性的自我防御機(jī)制，是一種當(dāng)外源基因?qū)牖虿《救肭趾?，?xì)胞中與轉(zhuǎn)基因或入侵病毒RNA同源的基因發(fā)生共同基因沉默的現(xiàn)象。第27頁,共53頁，2024年2月25日，星期天如果將其作為一門生物技術(shù)，則定義為：①RNAi是指通過反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的現(xiàn)象,它通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA(有義RNA和反義RNA),從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解,達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。②RNAi是指體外人工合成的或體內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性的將與之同源的mRNA降解成21nt～23nt的小片段，使相應(yīng)的基因沉默。③RNAi是將與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,能特異性地降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptionalgenesilence,PTGS)。RNAi的定義

第28頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi機(jī)制

第29頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi作用的簡單模型當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶識別，切割成21-23核苷酸長的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識別目的mRNA。識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進(jìn)行切割，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對目的mRNA進(jìn)行切割，從而使目的基因沉默，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象。第30頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.第31頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi在植物與其他生物中的差異在植物中存在系統(tǒng)性沉默(systematicRNAsilencing)現(xiàn)象，RNAi不會局限于單個細(xì)胞內(nèi)，可以在細(xì)胞與細(xì)胞之間、甚至由誘導(dǎo)部位向更遠(yuǎn)的組織傳播。植物中存在轉(zhuǎn)移性沉默(transitiveRNAi)，對于轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因，如果dsRNA誘導(dǎo)的RNA沉默區(qū)域?qū)?yīng)于基因的中間區(qū)域，能檢測到與其側(cè)翼區(qū)段對應(yīng)的siRNA。但內(nèi)源基因卻缺乏轉(zhuǎn)移性沉默，表現(xiàn)出沉默區(qū)域的保守性。這兩種現(xiàn)象在線蟲中也有發(fā)現(xiàn),但在哺乳動物和昆蟲中卻沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。植物中的RNAi跟兩種不同大小的siRNA有關(guān)：21nt和24ntsiRNA，21nt由RISC指導(dǎo)切割目的mRNA，而24nt則引發(fā)了系統(tǒng)性沉默和甲基化；而在動物中僅發(fā)現(xiàn)21nt的siRNA。第32頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi研究的一般技術(shù)路線第33頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi的效果分析可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern雜交等。蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。第34頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi在植物功能基因組研究中的應(yīng)用

RNAi為大規(guī)模高效及復(fù)雜的功能基因組學(xué)研究提供了一個便捷的平臺。Chuang等在花發(fā)育研究中采用RNA沉默技術(shù)驗(yàn)證了AG、CLV3、APl、PAN等已知功能基因,并開創(chuàng)了RNA沉默技術(shù)在植物功能基因組學(xué)中的應(yīng)用。Miki等利用水稻OsRac基因家族保守性序列設(shè)計(jì)RNA沉默載體，成功的對OsRac基因家族進(jìn)行了沉默，發(fā)現(xiàn)該突變株系生長狀況和植株高度均比正常的要差，揭示該基因家族在生長發(fā)育過程中有重要的作用第35頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RNAi在作物品質(zhì)改良中的應(yīng)用盡管產(chǎn)量問題在傳統(tǒng)育種和植物遺傳工程研究中是最重要的目標(biāo),改善植物營養(yǎng)價(jià)值方面也越來越受到重視。常規(guī)育種方法在改善食物營養(yǎng)方面取得了卓有成效的成功，然而操作耗時，并且對于作物性狀的改良只限于已經(jīng)得到的突變體材料而利用RNA沉默技術(shù)，其優(yōu)越性不僅表現(xiàn)在可操作基因的范圍和突變的種類擴(kuò)大了，而且對目的基因的表達(dá)有了可控性第36頁,共53頁，2024年2月25日，星期天利用RNA沉默產(chǎn)生抗病毒植物將病毒的某一序列設(shè)計(jì)成雙鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物體使之表達(dá),可誘發(fā)RNA沉默強(qiáng)化植物體內(nèi)天然的RNA沉默抗病毒能力，這使得高抗病毒性的轉(zhuǎn)基因植物的獲得成為可能。Waterhouse等利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構(gòu)建IRS載體進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化，獲得抗性植株。Wang等利用含有大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus，BYDV)PAV株系的復(fù)制酶基因片斷構(gòu)建成可產(chǎn)生發(fā)夾式RNA結(jié)構(gòu)的載體，并將該載體導(dǎo)入大麥得到強(qiáng)抗性植株并得到穩(wěn)定遺傳第37頁,共53頁，2024年2月25日，星期天內(nèi)源RNAi第38頁,共53頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

第39頁,共53頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性第40頁,共53頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn)(GST-pulldown）免疫共沉淀雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(BIFC)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)第41頁,共53頁，2024年2月25日，星期天一、細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)

Two-hybridsystem是90年代初發(fā)展起來的新方法，可用于分離能與已知靶蛋白質(zhì)（targetprotein）相互作用的基因。基本原理：

真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由兩個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的,如GAL4（酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白Gal4的基因）。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域，否則無法完成激活功能。第42頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

酵母激活因子GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結(jié)合域(BD)，C端：113個氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報(bào)告基因的宿主菌株。

第43頁,共53頁，2024年2月25日，星期天酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)過程第44頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第