基因的重組與轉(zhuǎn)移

關(guān)于基因的重組與轉(zhuǎn)移一、什么是受體細(xì)胞（receptorcell）?第一節(jié)受體細(xì)胞又稱hostcell，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究價(jià)值的細(xì)胞。顯然并不是所有細(xì)胞都能作為受體細(xì)胞第2頁,共40頁，2024年2月25日，星期天二、受體細(xì)胞的選擇應(yīng)符合哪些基本原則？九大原則！第3頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、能使重組DNA分子穩(wěn)定的存在于細(xì)胞中3、便于重組體的篩選。4、遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長5、安全性高無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染6、選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞。7、受體細(xì)胞在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性8、具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)。9、在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。第4頁,共40頁，2024年2月25日，星期天三、目前常用的受體細(xì)胞？這些受體細(xì)胞各有哪些特點(diǎn)？1、大腸桿菌2、枯草桿菌3、藍(lán)細(xì)菌4、棒狀桿菌5、鏈霉菌原核生物細(xì)胞6、酵母菌7、植物細(xì)胞8、動物細(xì)胞真核生物細(xì)胞第5頁,共40頁，2024年2月25日，星期天原核生物細(xì)胞？這是較為理想的受體細(xì)胞類型！沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁原因沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)基因組簡單，不含線粒體基因組培養(yǎng)簡單、繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快第6頁,共40頁，2024年2月25日，星期天原核生物細(xì)胞？原核生物細(xì)胞作為受體存在的缺陷！不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)原因缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)存在內(nèi)源性蛋白酶第7頁,共40頁，2024年2月25日，星期天真菌細(xì)胞—酵母菌外源真核基因最理想的表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚優(yōu)勢具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素培養(yǎng)簡單、利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中第8頁,共40頁，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞優(yōu)勢具有全能性第9頁,共40頁，2024年2月25日，星期天動物細(xì)胞用于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子優(yōu)勢真核生物蛋白翻譯后能被正確加工或修飾易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中組織培養(yǎng)技術(shù)要求高缺點(diǎn)第10頁,共40頁，2024年2月25日，星期天研究性作業(yè)題目：國內(nèi)外利用不同受體細(xì)胞開發(fā)生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展情況基本內(nèi)容要點(diǎn)：1、目前國內(nèi)外都開發(fā)了哪些受體細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，并分別用它們生產(chǎn)了哪些基因工程產(chǎn)品？為什么要選擇它作為生產(chǎn)該產(chǎn)品的反應(yīng)器？2、生物反應(yīng)器這一領(lǐng)域目前存在哪些問題？將來發(fā)展趨勢如何？3、目前，國內(nèi)外有哪些從事生物反應(yīng)器開發(fā)的企業(yè)？你認(rèn)為如果今后你去這里求職應(yīng)該從知識上做哪些儲備？要求：中文參考文獻(xiàn)不少于20篇英文參考文獻(xiàn)不少于5篇第11頁,共40頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞一、重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞二、重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞第12頁,共40頁，2024年2月25日，星期天一、如何將重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物細(xì)胞？以大腸桿菌為例轉(zhuǎn)化途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第13頁,共40頁，2024年2月25日，星期天什么是轉(zhuǎn)化（transformation）？重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。第14頁,共40頁，2024年2月25日，星期天格里菲斯的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（Diplococcuspneumoniae）,1928

愛弗萊證實(shí)轉(zhuǎn)化物質(zhì)是DNA第15頁,共40頁，2024年2月25日，星期天感受態(tài)（competent）：細(xì)菌細(xì)胞在一定的生長階段，自身或通過人為處理而具有攝取外源DNA，并使其基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的能力。感受態(tài)細(xì)胞：能夠吸收DNA的細(xì)胞。第16頁,共40頁，2024年2月25日，星期天1.目的增加受體菌細(xì)胞膜的通透性。一、感受態(tài)大腸桿菌的制備第17頁,共40頁，2024年2月25日，星期天2.菌種的選擇野生型的大腸桿菌并不是理想的受體細(xì)胞1）、hsdR-2）、recA-

recB-

recC-3）、易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)4）、有明顯的選擇性差異5）、感染寄生缺陷型實(shí)驗(yàn)室常用菌株JM109，DH5α，Top10，DH10BHB101第18頁,共40頁，2024年2月25日，星期天用CaCl2處理大腸桿菌，能增加膜的通透性。3.制備原理第19頁,共40頁，2024年2月25日，星期天4.制備過程培養(yǎng)大腸桿菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃離心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重懸4℃離心收集菌4℃離心收集菌分裝、-70℃凍存用冰冷的60mMCaCl2重懸Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重懸第20頁,共40頁，2024年2月25日，星期天（1）轉(zhuǎn)化（transformation)大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（2）轉(zhuǎn)染（transfection)大腸桿菌捕獲噬菌體DNA的過程。（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction)借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程。第21頁,共40頁，2024年2月25日，星期天每

gDNA轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌克隆數(shù)。3.轉(zhuǎn)化方法2.轉(zhuǎn)化率簡單，但轉(zhuǎn)化效率不高（106-108/gDNA）。（1）熱休克法（heatshock）轉(zhuǎn)化效率高（高于109/gDNA）。（2）電轉(zhuǎn)化法第22頁,共40頁，2024年2月25日，星期天10ng載體DNA100L感受態(tài)菌Onice混合，靜置10分鐘42oC1分鐘加入1mLLB培養(yǎng)基37℃搖1小時(shí)10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱休克法第23頁,共40頁，2024年2月25日，星期天LB培養(yǎng)受體菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分鐘，2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心集菌冰冷的水重懸菌體2℃離心收集菌體少量冰冷的水重懸分裝成50-300L電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV,25F脈沖控制器200-400

0.5g質(zhì)粒DNAOnice混合加入1mLSOC培養(yǎng)液37℃中速震蕩60分鐘10-100

L轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板轉(zhuǎn)化（2）電轉(zhuǎn)化法第24頁,共40頁，2024年2月25日，星期天4.平板培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌10-100

L轉(zhuǎn)化液涂于含抗菌素的平板37℃過夜第25頁,共40頁，2024年2月25日，星期天環(huán)形重組質(zhì)粒質(zhì)粒自我連接線性載體或DNA片段進(jìn)入細(xì)菌會被降解。①環(huán)形質(zhì)粒數(shù)（1）重組質(zhì)粒5.影響轉(zhuǎn)化率的因素第26頁,共40頁，2024年2月25日，星期天①生長狀態(tài)制備感受態(tài)菌必須使用對數(shù)生長期的菌。②必須在冰冷的條件下制備。要充分，使細(xì)菌細(xì)胞膜失去一些蛋白。④儲存感受態(tài)菌要在-70℃以下③CaCl2處理⑤使用感受態(tài)菌時(shí)必須迅速融化融化后一般不能再次凍存使用。（2）感受態(tài)細(xì)胞（competentcells)第27頁,共40頁，2024年2月25日，星期天把重組的噬菌體

DNA或Cosmid質(zhì)粒DNA包裝成具有感染能力的

噬菌體顆粒。6.體外包裝的噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)（1）體外包裝（invitropackaging）（2）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）通過受體菌細(xì)胞表面的

DNA接受器位點(diǎn)（receptorsite)，使帶有外源基因的重組體DNA注入受體大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增。第28頁,共40頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化率高的菌株；有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）；不育的菌株（不會與其他酵母接合）。第三節(jié)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞1.菌株選擇如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his3

1第29頁,共40頁，2024年2月25日，星期天（1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化2.酵母的轉(zhuǎn)化方法

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母載體PEG（聚乙二醇）使細(xì)胞壁具有通透性，允許DNA進(jìn)入。CaCl2使細(xì)胞膜具有通透性，允許DNA進(jìn)入。轉(zhuǎn)化第30頁,共40頁，2024年2月25日，星期天

酵母0.1mol/LLiCl處理插入外源基因的酵母載體感受態(tài)40%PEG4000（2）利用Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化第31頁,共40頁，2024年2月25日，星期天葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡看護(hù)培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗二、導(dǎo)入植物細(xì)胞1.葉盤法（leafdisk）第32頁,共40頁，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25

F電擊愈傷組織幼苗分化2.電擊法（electroporation)第33頁,共40頁，2024年2月25日，星期天又稱高速微型子彈射擊法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入3.基因槍法（genegun）4.農(nóng)桿菌（agrobacterium）介導(dǎo)第34頁,共40頁，2024年2月25日，星期天（1）原理：三、導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞1.磷酸鈣沉淀法HEPES緩沖鹽水與含有氯化鈣和DNA的溶液緩慢混合，會形成含磷酸鈣和DNA的沉淀。依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有10%的細(xì)胞能吸收DNA沉淀。第35頁,共40頁，2024年2月25日，星期天不需要載體。（2）特點(diǎn)：第36頁,共40頁，2024年2月25日，星期天脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如LifeTechnologies）。2.脂質(zhì)體（lipofectin）載體法脂類包埋DNA，通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。第37頁,共40頁，2024年2月25日，星期天直接把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。3.