蛋白質(zhì)聚焦層析課件

蛋白質(zhì)聚焦層析

谷春嬌

馬力

任重

王聰

1可編輯課件PPT定義聚焦層析是一種操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)的柱層析技術(shù)其流動(dòng)相為多緩沖液，固定相為多緩沖交換劑利用層析過程中固定相偶聯(lián)的具有兩性解離功能的有機(jī)分子為配基，與流動(dòng)相中某些兩性物質(zhì)發(fā)生等電聚焦反應(yīng)而進(jìn)行的一種分離方法2可編輯課件PPT等電聚焦

聚焦層析柱層析發(fā)展3可編輯課件PPT優(yōu)點(diǎn)有聚焦作用，蛋白峰尖、帶狹，帶寬度為0.04~0.05pH單位在柱內(nèi)自動(dòng)形成pH梯度，不需要pH梯度裝置

操作方便

分辨率高4123近年來(lái)，由瑞典Pharmacia公司設(shè)計(jì)了一種新的分離技術(shù)，叫做聚焦層析(Chromatofocusing)，其產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)以及商業(yè)化其優(yōu)點(diǎn)如下：4可編輯課件PPT關(guān)鍵技術(shù)多緩沖液

多緩沖液離子交換樹脂

兩種材料分別作為流動(dòng)相以及固定相發(fā)展了兩類新材料5可編輯課件PPT多緩沖液(Polybuffer)屬于兩性電解質(zhì)一類的緩沖液含有多種緩沖液用NaOH滴定的滴定曲線近似平滑的直線該公司有Polyboffer96和Polybuffer74兩種產(chǎn)品，即分別代表緩沖力范圍為pH9-6和pH7-46可編輯課件PPT多緩沖液離子交換樹脂(polybufferexehangers)帶有堿性緩沖基團(tuán)的陰離子交換樹脂把帶電基團(tuán)通過醚鍵與Sepharose6B的單糖連接的也有兩種產(chǎn)品：PBE94、PBE118應(yīng)用范圍分別是pH9-4和pH11-8但后者要與兩性電解質(zhì)Pharmalyte（pH8-10.5）聯(lián)合使用

7可編輯課件PPT原理聚焦層析PH梯度溶液的形成

蛋白質(zhì)的行為

聚焦效應(yīng)

8可編輯課件PPTpH梯度溶液的形成聚焦層析介質(zhì)上偶聯(lián)的多氨基多羧基的有機(jī)分子，具有相應(yīng)的酸性和堿性離子交換基團(tuán)這些基團(tuán)本身所帶的正負(fù)電荷與緩沖液中的氫離子和氫氧根離子作用而形成的pH梯度在層析過程中能與溶液中某些陰離子或陽(yáng)離子發(fā)生聚焦反應(yīng)，聚焦在不同區(qū)域，使物質(zhì)得到分離。

9可編輯課件PPTpH梯度溶液的形成例如，當(dāng)柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時(shí)，先用起始緩沖液平衡到pH9，再用含pH6的多緩沖劑物質(zhì)（作流動(dòng)相）的淋洗液通過柱體這時(shí)多緩沖劑中酸性最強(qiáng)的組分與堿性陰離子交換對(duì)結(jié)合發(fā)生中和作用隨著淋洗液的不斷加人，柱內(nèi)每點(diǎn)的pH值從高到低逐漸下降照此處理一段時(shí)間，從層析柱頂部到底部就形成了pH6-9的梯度。10可編輯課件PPTpH梯度溶液的形成但是隨著淋洗的進(jìn)行，pH梯度會(huì)逐漸向下遷移，從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6，并最后恒定于此值，這時(shí)層析柱的pH梯度也就消失了11可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)（pI）和層析柱中的pH值當(dāng)柱中的pH低于蛋白質(zhì)的pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向前移動(dòng)，固定相中的pH值是隨著淋洗時(shí)間延長(zhǎng)而變化的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至環(huán)境pH高于其pI時(shí)，蛋白質(zhì)由帶正電荷變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交換劑結(jié)合

12可編輯課件PPT蛋白質(zhì)的行為由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境pH再次低于pI時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來(lái)隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)進(jìn)行，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點(diǎn)被洗下來(lái)，從而達(dá)到了分離的目的不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，它們?cè)诒浑x子交換劑結(jié)合以前，移動(dòng)之距離是不同的，洗脫出來(lái)的先后次序是按等電點(diǎn)排列的13可編輯課件PPT14可編輯課件PPT聚焦效應(yīng)蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做聚焦效應(yīng)pH梯度的形成是聚焦效應(yīng)的先決條件如果一種蛋白質(zhì)是加到已形成pH梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，它將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處從此位置開始，其蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出

15可編輯課件PPT聚焦效應(yīng)若在此蛋白質(zhì)樣品被洗出前，再加人第二份同種蛋白質(zhì)樣品時(shí)，后者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動(dòng)，而不被固定相吸附，直到其遷移至近似本身等電點(diǎn)的環(huán)境處（即第一個(gè)樣品的緩慢遷移處）然后兩份樣品以同樣的速度遷移，最后同時(shí)從柱底洗出16可編輯課件PPT聚焦層析的介質(zhì)大多數(shù)都是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體，通過共價(jià)鍵結(jié)合將多氨基多羧基化合物偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠載體上目前用的較多的層析介質(zhì)是多聚緩沖液交換劑（固定相）PBE118，PBE94，前者屬于偏堿性層析介質(zhì)（pH

8-11），后者屬于中性層析介質(zhì)（pH4-9）常用多緩沖劑（流動(dòng)相）有Polybuffer96和Polybuffer74（分別在pH6-9和pH7-4范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力如將他們混合在一起，則較強(qiáng)緩沖能力的pH范圍為4-917可編輯課件PPT緩沖液和交換樹脂的選擇緩沖液和多緩沖液交換樹脂每次最大操作范圍是3pH單位若是樣品的pl是已知的，只要選擇對(duì)應(yīng)的pH緩沖液和樹脂即可，最好洗脫位置在pH梯度的1/3-1/2以后若是未知樣品，應(yīng)先定出pl值。也可用公司配套提供的聚焦層析試劑箱測(cè)定pI一旦決定了pl，就可選擇了18可編輯課件PPT緩沖液和交換樹脂的選擇交換樹脂量的選擇是取決于樣品數(shù)量，樣品性質(zhì)和雜質(zhì)多少等，一般20~30毫升床體積可分離1-200毫克蛋白/pH單位19可編輯課件PPT操作先將懸浮的多緩沖液交換樹脂裝柱。要求無(wú)氣泡(可先脫氣)用一個(gè)高于多緩沖液pH的起始緩沖液平衡柱子。當(dāng)流出液pH與起始緩沖液pH相同即可上樣樣品溶在所選擇的多緩沖液中，再用同樣的多緩沖液洗脫。這祥各種蛋白在自己的pl處聚焦，并依次洗脫下來(lái)，分部收集20可編輯課件PPT操作操作流程：聚焦層析柱起始緩沖液平衡樣液上樣多緩沖液淋洗洗脫液解吸附21可編輯課件PPT注意事項(xiàng)樣品的基本性質(zhì)在聚焦層析前，樣品最好能提供一些必要的參數(shù)，如：等電點(diǎn)、溶解度、穩(wěn)定性等樣品制備要求樣品中不能含有鹽或強(qiáng)離子型有機(jī)化合物，鹽類等強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)會(huì)影響聚焦效應(yīng)22可編輯課件PPT蛋白質(zhì)與多緩沖液的分離一般多緩沖液不干擾酶的測(cè)活或氨基酸分析雖然多緩沖液不影響考馬斯亮蘭反應(yīng)，但與銅離子會(huì)形成復(fù)合物，所以干擾Lowry反應(yīng)如用Lowry反應(yīng)測(cè)蛋白有必要將蛋白與多緩沖液分開。這時(shí)用硫酸銨沉淀法，凝膠過濾法或親和層析法等都可以將蛋白與多緩沖液分開。23可編輯課件PPT再生多緩沖液交換樹脂的再生很容易，只要用2-3倍床體積的1MNaCl在柱內(nèi)洗滌就行了如果有強(qiáng)結(jié)合力的蛋白未除去，可用0.1MHCI洗滌，但要立刻用高pH溶液洗去HCI，再用所選擇的起始緩沖液平衡后，即可使用

24可編輯課件PPT應(yīng)用簡(jiǎn)介聚焦層析最適合于分離某些蛋白質(zhì)分子量和極性方面的性質(zhì)十分相似，而等電點(diǎn)有區(qū)別的物質(zhì)。尤其對(duì)用其他的層析方法難以分離的混合物，采用此法可得到較好的效果12325可編輯課件PPT人血清載脂蛋白CⅢ亞型的分離華西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方定志等利用此方法分離了人血清載脂蛋白CⅢ亞型他們用密度梯度超速離心法,從混合人血清中分離極低密度脂蛋白，經(jīng)脫脂后再進(jìn)行聚焦層析分離其中的載脂蛋白。獲得的純品載脂蛋白CⅢ1和CⅢ2經(jīng)等電聚焦電泳均呈現(xiàn)一條帶26可編輯課件PPT具體操作將100mlPBE94混懸于100ml平衡緩沖液(25mmol/L咪唑,7.2mol/L尿素,1mmol/LNa2EDTA,pH7.4)裝入1.5cm×75cm層析柱于4℃用10倍床體積平衡緩沖液平衡后,用溶解的apoVLDL(含蛋白45~50mg)上柱然后于4℃用1000ml洗脫緩沖液(polybuffer74∶8mol/L尿素為1∶8，pH4.0)洗脫,形成pH梯度洗脫速度為20~25ml/min，每管2.5~3.0ml分部收集測(cè)定各管280nm紫外光吸收值,收集各蛋白峰經(jīng)HTP柱層析除去polybuffer，最后對(duì)標(biāo)準(zhǔn)透析緩沖液(20mmol/LTris-HCl,0.85%NaCl,0.01%Na2EDTA,0.01%NaN3,pH7.4)于4℃透析

27可編輯課件PPT洗脫曲線28可編輯課件PPT昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分離北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的周先碗在分離純化昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶過程中也用到了聚焦層析29可編輯課件PPT具體操作首先將冷凍的蠟螟幼蟲在磷酸緩沖液中勻槳,經(jīng)10000g和100000g分級(jí)離心取上清液通過QAE-SephadexA-25離子交換柱層析除去部分色素和雜蛋白然后采用谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠親和層析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸鹽-瓊脂糖凝膠親和層析(BSP-QT4),銅離子-瓊脂糖凝膠螯合層析(Cu2+-QT4)及PBE94-Sepharose(PBE94)聚焦層析等層析技術(shù)進(jìn)一步分離純化將上述方法獲得的色譜峰以CDNB和DCNB為底物檢測(cè)生物活性具有生物活性部分的蛋白質(zhì),通過SDS測(cè)定其分子量

30可編輯課件PPT洗脫曲線31可編輯課件PPTβ-乳球蛋白A型和B型的分離美國(guó)一所大學(xué)應(yīng)用陽(yáng)離子型聚焦層析分離A型和B型β-乳球蛋白A型和B型分子量都是36000，等電點(diǎn)僅差0.1A型等電點(diǎn)為5.1B型為5.232可編輯課件PPTβ-乳球蛋白A型和B型的分離PolyCATA柱，上樣量為0