(高清版)GBT 21037-2024 飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測定

飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測定2024-03-15發(fā)布2024-10-01實施國家標準化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。高效液相色譜法》,與GB/T21037—2007相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動外，主要技術變化如下：a)增加了二甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測定方法(見第1章);b)適用范圍中增加了精料補充料和動物源性飼料原料(見第1章);c)更改了檢出限和定量限(見第1章，2007年版的第1章);d)增加了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(見第4章);e)更改了原理(見5.1,2007年版的第3章);f)更改了試驗步驟(見5.5,2007年版的第7章);g)更改了精密度(見5.7,2007年版的第9章)。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由全國飼料工業(yè)標準化技術委員會(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：四川威爾檢測技術股份有限公司、山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、通威農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。本文件及其所代替文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2007年首次發(fā)布為GB/T21037—2007;——本次為第一次修訂。1飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測定本文件描述了飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料、添加劑預混合飼料和動物源性飼料原料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測定。本文件液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限為2.5μg/kg,定量限為5.0μg/kg;高效液相色譜法的檢出限為0.25mg/kg,定量限為0.50mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(仲裁法)4.1原理試樣中的待測物在弱堿性條件下用乙酸乙酯提取、正己烷脫脂，混合型強陽離子交換小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。4.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。24.2.8乙酸鈉溶液(82g/L):稱取8.2g乙酸鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，混勻。4.2.95%乙酸溶液：移取5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。4.2.101%乙酸-乙腈溶液：移取1mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用乙腈(4.2.3)稀釋、定容，混勻。4.2.11乙腈-5%乙酸溶液：移取10mL乙腈(4.2.3)于100mL容量瓶中，用5%乙酸溶液(4.2.9)稀釋、4.2.12正己烷乙腈飽和溶液：量取80mL正己烷于100mL分液漏斗中，加入10mL乙腈(4.2.3)后，劇烈振搖5min,靜置分層后，棄去乙腈層。4.2.138%氨水-甲醇溶液：量取50mL甲醇(4.2.2)于100mL容量瓶中，再加入8mL氨水(4.2.6),用4.2.140.2%甲酸溶液：量取500mL水于1000mL容量瓶中，加入2mL甲酸(4.2.4),用水稀釋、定4.2.15乙酸銨-0.2%甲酸溶液：稱取0.154g乙酸銨(4.2.5),用0.2%甲酸溶液(4.2.14)溶解，轉(zhuǎn)移至4.2.16復溶液：移取150mL乙腈(4.2.3)于1000mL容量瓶中，用乙酸銨-0.2%甲酸溶液(4.2.15)定4.2.17標準儲備溶液(1mg/mL):稱取二甲氧芐氨嘧啶(CAS:5355-16-8,純度不低于98%)、三甲氧芐氨嘧啶(CAS:738-70-5,純度不低于98%)和二甲氧甲基芐氨嘧啶(CAS:6981-18-6,純度不低于98%)標準品各10mg(精確至0.01mg),分別置于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液(4.2.10)溶4.2.18混合標準中間溶液I(10μg/mL):分別準確移取二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶標準儲備溶液(4.2.17)各1mL于100mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液(4.2.10)稀釋、定4.2.19混合標準中間溶液Ⅱ(1μg/mL):準確移取1mL混合標準中間溶液I(4.2.18)于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液(4.2.10)稀釋、定容，混勻。臨用現(xiàn)配。4.2.20內(nèi)標標準儲備溶液(1mg/mL):稱取d?-三甲氧芐氨嘧啶(CAS:1189460-62-5,純度不低于98%)標準品10mg(精確至0.01mg)于10mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液(4.2.10)溶解、定容，混勻。-18℃以下貯存，有效期6個月。4.2.21內(nèi)標中間溶液(10μg/mL):準確移取1mL內(nèi)標標準儲備溶液(4.2.20)于100mL容量瓶中，用1%乙酸-乙腈溶液(4.2.10)稀釋、定容，混勻。-18℃以下貯存，有效期3個月。4.2.22內(nèi)標工作溶液(1μg/mL):準確移取1mL內(nèi)標中間溶液(4.2.21)于10mL容量瓶中，用1%乙4.2.23混合標準系列溶液：準確移取適量體積的混合標準中間溶液Ⅱ(4.2.19)及100μL內(nèi)標工作溶液(4.2.22)于10mL容量瓶中，用復1.0ng/mL、2.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL和內(nèi)標質(zhì)量濃度均為10ng/mL的混合標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。4.2.24混合型強陽離子交換小柱：60mg/3mL,或性能相當者。4.3儀器設備4.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源(ESI)。34.3.4冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。4.3.5超聲波清洗器。按照GB/T20195規(guī)定制備試樣，至少200g,粉碎使其全部過0.425mm試驗篩，混合均勻，裝入密平行做2份試驗。稱取試樣約2g(精確至0.1mg),置于50mL離心管中，加入100μL內(nèi)標工作乙酯(4.2.7),渦旋混合2min,超聲提取10min(5min渦旋混合1次),于4℃下10000r/min離心5min,移取上層有機相至另一50mL離心管中。再準確加入10mL乙酸乙酯(4.2.7)重復提取1次，合并有機相，混勻。準確移取2mL有機相，50℃下氮氣吹至近干，加入3mL乙腈-5%乙酸溶液(4.2.11)溶解殘渣，渦旋混合30s,再加入3mL正己烷乙腈飽和溶液(4.2.12),渦旋混合30s,于4℃下10000r/min離心5min,棄去上層正已烷溶液，取全部下層溶液，備用?；旌闲蛷婈栯x子交換小柱依次用3mL甲醇(4.2.2)、3mL乙腈-5%乙酸溶液(4.2.11)活化，取備用液(4.5.1)全部過柱。分別用3mL乙腈-5%乙酸溶液(4.2.11)、3mL甲醇(4.2.2)淋洗，抽干后加入5mL8%氨水-甲醇溶液(4.2.13)洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹至近干，準確加入1mL復溶液(4.2.16),渦旋混合30s,過微孔濾膜液相色譜參考條件如下：e)流動相：A相為乙腈(4.2.3),B相為乙酸銨-0.2%甲酸溶液(4.2.15),梯度洗脫程序見表1。4表1梯度洗脫程序時間/minA相/%B相/%00質(zhì)譜參考條件如下：a)電離方式：電噴霧電離，正離子模式(ESI+);b)檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM);e)脫溶劑氣溫度：300℃;多反應監(jiān)測(MRM)定性離子對、定量離子對及碰撞能量見表2。表2多反應監(jiān)測(MRM)離子對、碰撞能量參考值待測物名稱定性離子對m/z定量離子對m/z碰撞能量二甲氧芐氨嘧啶261.2>245.0261.2>245.0261.2>123.3三甲氧芐氨嘧啶291.3>230.2291.3>230.2291.3>261.0二甲氧甲基芐氨嘧啶275.4>259.3275.4>259.3275.4>123.3d?-三甲氧芐氨嘧啶300.2>234.0300.2>234.04.5.3.3混合標準系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取混合標準系列溶液(4.2.23)和試樣溶液(4.5.2)上機測定?；旌蠘藴嗜芤褐卸籽跗S氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶和d?-三甲氧芐氨嘧啶的定量離子色譜圖見附錄A。在相同試驗條件下，試樣溶液中待測物的保留時間應與標準系列溶液(濃度相當)中待測物的保留5GB/T21037—2024時間一致，其相對偏差在±2.5%之內(nèi)。根據(jù)表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物監(jiān)測離子對的相對離子豐度與濃度接近的標準系列溶液中對應的監(jiān)測離子對的相對離子豐度，若偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。表3定性測定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度最大允許偏差以標準溶液中待測組分的峰面積和內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，以標準溶液中待測組分的質(zhì)量濃度和內(nèi)標質(zhì)量濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線，標準曲線的相關系數(shù)應不低于0.99。試樣溶液與標準溶液中待測物的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，如超出線性范圍，應重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測組分質(zhì)量濃度與標準溶液質(zhì)量濃度相差不超過30%。4.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶含量以質(zhì)量分數(shù)w;計，數(shù)值以微克每千克(μg/kg)表示。多點校準按公式(1)計算；單點校準按公式(2)計算 (1)式中：p——由標準曲線得到的試樣溶液中待測物質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);V?——試樣提取用乙酸乙酯總體積，單位為毫升(mL);V?——凈化、氮氣吹至近干后復溶試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL);V?——凈化用試樣提取溶液體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g);1000——換算系數(shù)。 (2)式中：A——試樣溶液待測物色譜峰面積；A——標準溶液內(nèi)標物色譜峰面積；p、——標準溶液待測物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)p?——試樣溶液內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL);V?——試樣提取用乙酸乙酯總體積，單位為毫升(mL);V?——凈化、氮氣吹至近干后復溶試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL);A、——標準溶液待測物色譜峰面積；A;—-試樣溶液內(nèi)標物的色譜峰面積；p—標準溶液內(nèi)標物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)V?——凈化用試樣提取溶液體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g);1000——換算系數(shù)。測定結(jié)果以平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數(shù)字。6在重復性條件下，2次獨立測定結(jié)果與其算術平均值的絕對差值不大于該算術平均值的15%。5高效液相色譜法試樣中的待測物在弱堿性條件下用乙酸乙酯提取、正己烷脫脂，混合型強陽離子交換小柱凈化，高效液相色譜儀測定，外標法定量。5.2試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.2.5乙酸乙酯。5.2.6乙酸鈉溶液(82g/L):稱取8.2g乙酸鈉，用水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，混勻。5.2.75%乙酸溶液：移取5mL冰乙酸于100mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。5.2.81%乙酸溶液：移取10mL冰乙酸于1000mL容量瓶中，用水稀釋、定容，混勻。5.2.9乙腈-5%乙酸溶液：移取10mL乙腈(5.2.3)于100mL容量瓶中，用5%乙酸溶液(5.2.7)稀釋、5.2.10正己烷乙腈飽和溶液：量取80mL正己烷于100mL分液漏斗中，加入10mL乙腈(5.2.3),劇5.2.118%氨水甲醇溶液：量取50mL甲醇(5.2.2)于100mL容量瓶中，再加入8mL氨水(5.2.4),用5.2.12磷酸二氫鉀溶液(0.05mol/L):準確稱取6.80g磷酸二氫鉀于1000mL容量瓶中，用水溶解、5.2.13標準儲備溶液(1mg/mL):稱取二甲氧芐氨嘧啶(CAS:5355-16-8,純度不低于98%)、三甲氧芐氨嘧啶(CAS:738-70-5,純度不低于98%)、二甲氧甲基芐氨嘧啶(CAS:6981-18-6,純度不低于98%)標準品各10mg(精確至0.01mg),分別置于10mL容量瓶中，用1%乙酸溶液(5.2.8)溶解、定容，混勻。2℃~8℃貯存，有效期3個月。5.2.14混合標準中間溶液(20μg/mL):分別準確移取二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶標準儲備溶液(5.2.13)各1mL于50mL容量瓶中，用1%乙酸溶液(5.2.8)稀釋、定容，混勻。臨用現(xiàn)配。5.2.15混合標準系列溶液：準確移取適量混合標準中間溶液(5.2.14)于10mL容量瓶中，用1%乙酸5.0μg/mL和10.0μg/mL的混合標準系列溶液。臨用現(xiàn)配。5.2.16混合型強陽離子交換小柱：60mg/3mL,或性能相當者。5.3儀器設備5.3.1高效液相色譜儀：配紫外檢測器或二極管陣列檢測器。75.3.2分析天平：精度為0.1mg和0.01mg。5.3.3渦旋混合器。5.3.4冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。5.3.5超聲波清洗器。5.3.6固相萃取裝置。同4.4。5.5試驗步驟平行做2份試驗。稱取試樣約2g(精確至0.1mg),置于50mL離心管中，加入10mL乙酸鈉溶液(5.2.6)、0.5mL氨水(5.2.4),渦旋混合2min,準確加入10mL乙酸乙酯(5.2.5),渦旋混合2min,超聲提取10min(5min渦旋混合1次),于4℃下10000r/min離心5min,上層有機相移至另一50mL離心管中，再準確加入10mL乙酸乙酯(5.2.5)重復提取1次，合并有機相，混勻。準確移取10mL有機相，50℃下氮氣吹至近干，加入6mL乙腈-5%乙酸溶液(5.2.9),渦旋混合30s,再加入6mL正己烷乙腈飽和溶液(5.2.10),渦旋混合30s,于4℃下10000r/min離心5min,棄去上層正己烷溶液，取全部混合型強陽離子交換小柱依次用3mL甲醇(5.2.2)、3mL乙腈-5%乙酸溶液(5.2.9)活化，準確加入3mL備用液(5.5.1)過柱。分別用3mL乙腈-5%乙酸溶液(5.2.9)、3mL甲醇(5.2.2)淋洗，抽干后加入5mL8%氨水甲醇溶液(5.2.11)洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹至近干，準確加入1mL1%乙酸溶液(5.2.8),渦旋混合30s,用微孔濾膜(5.2.17)過濾，濾液待測。5.5.3高效液相色譜參考條件高效液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C柱，柱長250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑5μm,或性能相當者；b)流動相：甲醇(5.2.2)+磷酸二氫鉀溶液(5.2.12)=25+75;5.5.4.1混合標準系列溶液和試樣溶液的測定在儀器的最佳條件下，分別取混合標準系列溶液(5.2.15)和試樣溶液(5.5.2)上機測定。二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶標準溶液的高效液相色譜圖見附錄B。以保留時間定性，試樣溶液中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶保留時間應8GB/T21037—2024與標準系列溶液(濃度相當)中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶的保留時間一致，其相對偏差在±2.5%之內(nèi)。以二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶的質(zhì)量濃度為橫坐標，色譜峰面積(響應值)為縱坐標，繪制標準曲線，其相關系數(shù)應不低于0.99。試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度應在標準曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應將試樣溶液用1%乙酸溶液(5.2.8)稀釋后，重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的質(zhì)量濃度與標準溶液的質(zhì)量濃度相差不超過30%。5.6試驗數(shù)據(jù)處理試樣中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶含量以質(zhì)量分數(shù)w;計，數(shù)值以毫克每千克(mg/kg)表示。多點校準按公式(3)計算；單點校準按公式(4)計算： 式中：p——由標準曲線得到的試樣溶液中待測物質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);V?——試樣提取用乙酸乙酯總體積，單位為毫升(mL);V?——凈化前復溶后試樣溶液體積，單位為毫升(mL);V?——凈化、氮氣吹至近干后復溶后試樣溶液體積，單位為毫升(mL);V?——移取上清液體積，單位為毫升(mL);V?——凈化用備用液體積，單位為毫升(mL);m——試樣