常用電泳技術

關于常用電泳技術Contents簡介及發(fā)展過程1234電泳的原理影響電泳分離的主要因素常用的電泳介紹2第2頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1.簡介及發(fā)展過程電泳可以定義為帶電的膠體粒子或大分子在外加直流電場中向帶相反電荷的電極做定向移動的現(xiàn)象。

帶正電荷的粒子向負極移動，帶負電荷的粒子向正極移動。電泳分離則是利用荷電溶質(zhì)在電場中泳動速度的差別來進行分離的一種方法。

電泳技術：

3第3頁,共37頁，2024年2月25日，星期天最早發(fā)現(xiàn)于1808年。俄國物理學家Pehce于1809年在濕黏土中插上帶玻璃管的正負極兩個電極，加壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變渾濁，即帶負電荷的黏土顆粒向正極移動，這就是電泳現(xiàn)象。在1937年由瑞典科學家A.tiselius利用U形玻管進行血清蛋白電泳，以界面折光率差別分離蛋白。1948年Wieland等發(fā)明以濾紙作為支持物，使電泳技術大為簡化。電泳作為一種生化分離手段已廣泛應用于生物大分子的分離、純化、分析、制備以及用于測定它們的分子量、等電點等。已成為生命科學、醫(yī)學、制藥學、食品、生物工程、環(huán)境工程等領域常用的實驗手段。

4第4頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.電泳的原理5帶有電荷生物分子在電場作用下發(fā)生移動;由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)，數(shù)量以及

分子量各不同，在同一電場作用下，各組

分的泳動方向和速度也各有差異;在一定時間內(nèi)，他們移動距離不同，從而可

達到分離鑒定的目的。

第5頁,共37頁，2024年2月25日，星期天61.蛋白質(zhì)的電荷來源從電泳的角度來看，蛋白質(zhì)分子最主要的特性就是它的帶電行為：等電點（pI）：在某一條件的PH下，蛋白質(zhì)所帶的正負電荷數(shù)相等。即凈電荷為零。當體系：pH>pI，蛋白質(zhì)分子會解離出而帶負電，向陽極移動；當體系：pH<pI，蛋白質(zhì)分子會結(jié)合而帶正電，向陰極移動；特定蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成，是一個物理化學常數(shù)。對于不同的蛋白質(zhì)，其等電點范圍很寬，在一定的PH下，不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量不同，由此可進行蛋白質(zhì)的分離和分析。pH<pIpH=pIpH>pI第6頁,共37頁，2024年2月25日，星期天72.遷移率在一定的PH條件下，蛋白質(zhì)分子會解離而帶電，帶電的性質(zhì)和電荷密度取決于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)和溶液的PH。不同的帶點顆粒在同一電場的運動速度不同，可以用遷移率來表示。遷移率（m，mobility）即帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度：m遷移率，

;v遷移速度，cm/s;E電場強度,V/cm;d遷移距離,cm；t電泳時間，s；U電壓，V；l凝膠長度，cm。第7頁,共37頁，2024年2月25日，星期天8當球形分子在電場中以恒定速率移動時，所受的動力和阻力平衡，即：

（Stoke定律）

Q被分離分子所帶凈電荷；

介質(zhì)黏度；r分子半徑。于是有：

即：蛋白質(zhì)的遷移率與帶電顆粒的分子大小、介質(zhì)的黏度、顆粒所帶的電荷有關。一般來說，所帶凈電荷越多，顆粒越小，越接近球形，則在電場中遷移速率越快，反之越慢。第8頁,共37頁，2024年2月25日，星期天9對于兩種蛋白質(zhì)來講，物質(zhì)A和B：當使用同一介質(zhì)分離兩種物質(zhì)時：物質(zhì)A在電場中移動的距離:

dA=mA·Et某物質(zhì)B在電場中移動的距離：dB=mB·Et

兩物質(zhì)移動距離差為：?d=(dA-dB)=(mA-mB)Et

若mA=mB則?d=0兩種物質(zhì)不能分離

若mA≠mB則?d≠0兩種物質(zhì)能分離結(jié)論：不同蛋白質(zhì)的m不同，蛋白質(zhì)就能夠分離開來，蛋白質(zhì)電泳正是根據(jù)此原理對不同物質(zhì)進行分離的。

第9頁,共37頁，2024年2月25日，星期天3.影響電泳分離的主要因素10

內(nèi)在因素：蛋白質(zhì)分子本身的性質(zhì)12電場強度E溶液的性質(zhì)3其他4第10頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1.蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成決定其在某個PH條件下的電性和電量，進而決定了它的電泳速度；蛋白質(zhì)分子的形狀和大小也影響它的電泳速度。2.電場強度電場強度(Electricfieldintensity)是指每厘米的電位降。電場強度對電泳速度起著正比作用，越大則帶電顆粒遷移越快，電泳時間越短（高壓電泳）；反之遷移慢，電泳時間長（常壓電泳）。第11頁,共37頁，2024年2月25日，星期天3.溶液的性質(zhì)（1）溶液的PH決定帶點顆粒的電性和電量，對于氨基酸或蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)來說，溶液的pH值離其等電點越遠，其凈電荷量就越大，遷移速度加快。因此需選擇合適的pH，使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶電荷的電性相同但是電量有較大的差異，以利于分離。（2）溶液的離子強度

離子強度越低，欲分離組分的遷移速度越快；但離子強度太低則緩沖能力太小。合適的離子強度范圍在0.02-0.2mol/L之間。（3）溶液的黏度電泳遷移率與溶液的黏度成反比，所以黏度不能過大或過小。第12頁,共37頁，2024年2月25日，星期天4.其他因素（1）電滲現(xiàn)象在電場中液體（通常指水）對固體支持物的相對移動。電滲是由于電泳支持介質(zhì)上含有帶電基團，從而吸附流動相向正極或負極移動。電泳時，帶電顆粒的遷移速度是顆粒本身的遷移速度與由于電滲攜帶顆粒的移動速度之矢量和。為消除電滲現(xiàn)象，可選擇無電滲的電泳介質(zhì)。（2）電泳的支持介質(zhì)要求介質(zhì)均勻，對樣品吸附力小。吸附會延緩電泳分離。（3）溫度電泳過程中會產(chǎn)熱，造成樣品的擴散及燒膠。因此需控制電壓或電流，或安裝冷卻系統(tǒng)。第13頁,共37頁，2024年2月25日，星期天電泳電泳分類第14頁,共37頁，2024年2月25日，星期天010203聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦（IEF）常用的幾種電泳介紹04雙向電泳（2D）第15頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質(zhì)分離與分析中最常用的電泳方法，包括常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）。聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(acrylamide)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide)在催化劑作用下合成的。第16頁,共37頁，2024年2月25日，星期天PAGE電泳原理在凝膠中存在凝膠層、緩沖液、pH值及電場強度的不連續(xù)性。大孔徑，樣品在其中濃縮，在與分離膠的界面上形成薄層，只具有電荷效應。小孔徑，具有電荷效應和分子篩效應，達到分離的目的。第17頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1.電荷效應pI不同，在恒定緩沖系統(tǒng)中不同蛋白質(zhì)間同性凈電荷的差異。2.分子篩效應蛋白質(zhì)分子的大小和形狀的差異；蛋白質(zhì)通過一定的分離膠時，受阻滯程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3.樣品的濃縮效應在不連續(xù)的凝膠電泳中，樣品首先經(jīng)過大孔徑的濃縮膠被濃縮，再經(jīng)過小孔徑的分離膠進行分離。濃縮膠與分離膠之間不僅存在凝膠孔徑的不連續(xù)性，還存在緩沖液系統(tǒng)的不連續(xù)性。第18頁,共37頁，2024年2月25日，星期天凝膠電泳的分類按被分離的蛋白質(zhì)電性陽極電泳：為通常使用的電泳方式，pH8.0-9.0，多數(shù)蛋白質(zhì)帶負電，向正極遷移。陰極電泳：僅用于分離堿性蛋白質(zhì)，pH4.0左右，蛋白質(zhì)帶正電，向陰極遷移按電泳系統(tǒng)的連續(xù)性連續(xù)電泳：系統(tǒng)中緩沖液pH和凝膠濃度保持不變。無濃縮效應。不連續(xù)電泳：體系中緩沖液離子組成、pH以及凝膠濃度的不連續(xù)性，有濃縮效應，分辨率高。第19頁,共37頁，2024年2月25日，星期天影響分離結(jié)果的因素1.緩沖系統(tǒng)的選擇緩沖系統(tǒng)中pH的選擇由于蛋白質(zhì)分離時需保持溶解狀態(tài)，且蛋白質(zhì)的分離要依據(jù)其電荷密度，因此pH的選擇很重要，一方面要使蛋白質(zhì)的電荷密度差別大有利于分離，另一方面要使蛋白質(zhì)荷電多且?guī)噪姾梢约铀俜蛛x。近半數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在pH=4.0-6.5，因此常使用pH=8.0-9.5緩沖體系的陽極電泳。對于堿性蛋白質(zhì)可采用pH=3.0的KOH-醋酸緩沖系統(tǒng)。緩沖系統(tǒng)中離子強度的選擇離子強度低，蛋白質(zhì)遷移速度快，但電泳帶較寬；離子強度高，蛋白質(zhì)遷移速度慢，電泳帶窄細，但由于高導電性而產(chǎn)生大量熱，易導致蛋白質(zhì)變性及燒膠。另外，還要使緩沖系統(tǒng)有一定的pH緩沖能力。一般離子強度應為0.01-0.1mol/L,常用的是0.05mol/L第20頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.凝膠濃度凝膠的分子篩效應與電泳分辨率、電泳速度密切相關，而凝膠的孔徑大小決定于凝膠濃度，因此凝膠濃度的選擇很重要。一般可根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度。C=2.6%C=5%凝膠濃度T/%分子量范圍/kD凝膠濃度T/%分子量范圍/kD530-200560-7001015-1001022-2801510-501510-200202-15205-150蛋白質(zhì)分子量范圍與聚丙烯酰胺凝膠濃度的關系第21頁,共37頁，2024年2月25日，星期天檢測及處理4電泳3加樣制膠12具體操作步驟任何一種凝膠電泳都要經(jīng)歷四個過程?？捡R斯亮藍染色銀染色熒光染料掃描、記錄結(jié)果凝膠貯液分離膠濃縮膠制備樣品蛋白質(zhì)標樣加樣第22頁,共37頁，2024年2月25日，星期天應用可測定蛋白質(zhì)的分子量，對蛋白質(zhì)組分進行分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。對于常規(guī)PAGE，由于電泳后蛋白質(zhì)還保持其生物活性，因此尤其適用于分離各種欲保持天然活性的蛋白質(zhì)，如酶、抗原、抗體、激素等。第23頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.SDS在電泳體系中加入了十二烷基硫酸鈉（SDS）和強還原劑。其中SDS作為陰離子去垢劑會破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，導致蛋白質(zhì)構象改變，而巰基乙醇等可以打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使其分解為亞基，因此電泳過程中蛋白質(zhì)的生物活性喪失或減弱，但電泳后可恢復或部分恢復活性。它可用于多肽相對分子質(zhì)量的分析，其特點是SDS會使蛋白質(zhì)分離并與之結(jié)合形成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，因此消除了電荷差異對結(jié)果的影響。原理第24頁,共37頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共37頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)-SDS復合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒，無形狀差別，棒的長度與蛋白質(zhì)亞基分子量有關，所以在SDS中蛋白質(zhì)分子僅存在分子大小的差異，于是可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開，因此SDS常用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量和純度鑒定。第26頁,共37頁，2024年2月25日，星期天影響分離結(jié)果的因素1.緩沖系統(tǒng)的選擇對于SDS—PAGE，由于SDS對蛋白質(zhì)的助溶作用以及負電荷的包裹作用，蛋白質(zhì)的分離僅依據(jù)于亞基的分子大小，因此緩沖液的選擇極為簡單。只要有利于分離并保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定以及不與SDS發(fā)生相互作用即可。2.凝膠濃度凝膠濃度決定孔徑大小，而凝膠孔徑影響電泳效果。特別是對于SDS—PAGE，由于電泳分離只取決于SDS蛋白質(zhì)亞基膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇尤為重要。應根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度。C=2.6%C=5%凝膠濃度T/%分子量范圍/kD凝膠濃度T/%分子量范圍/kD525-200560-1701010-701020-10015<501510-5020<40205-40蛋白質(zhì)分子量范圍與SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度的關系第27頁,共37頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)分子量的測定電泳遷移率與相對分子質(zhì)量的對數(shù)呈線性關系：

lgMr=-bmR+K第28頁,共37頁，2024年2月25日，星期天應用可測定蛋白質(zhì)的分子量，對蛋白質(zhì)組分進行分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。相對于光散射、色譜、超離心、滲透法等。SDS是測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種簡單、經(jīng)濟、快捷、高分辨的好方法。第29頁,共37頁，2024年2月25日，星期天3.等電聚焦等電聚焦（IEF）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子等電點的不同，在一個連續(xù)的、穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，從而對蛋白質(zhì)進行分離和分析的技術。由于它具有聚焦效應（濃縮效應），是目前分辨率最高的技術。根據(jù)建立pH梯度不同：載體兩性電解質(zhì)：將載體兩性電解質(zhì)溶解在電泳介質(zhì)溶液中制膠，形成聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，然后將凝膠引入電場中等電聚焦。載體兩性電解質(zhì)在凝膠中遷移形成pH梯度，而樣品則聚焦在其等電點處。分辨率為0.01pH單位，上樣量不可過高。固相pH電解質(zhì)：將弱酸、弱堿兩性基團直接引入丙烯酰胺中，在凝膠聚合時就形成pH梯度，因此pH梯度固定。分辨率達0.001pH單位，上樣量可更大。第30頁,共37頁，2024年2月25日，星期天等電聚焦原理第31頁,共37頁，2024年2月25日