高效液相色譜化學發(fā)光檢測法

高效液相色譜化學發(fā)光檢測法一.概述

高效液相色譜是一種非常有效的分離手段。它已被廣泛用于各種復(fù)雜混合物的分離和定量分析。高效液相色譜所用的檢測器可分為以下幾類：

1.紫外-可見（UV-VIS）Detector（選擇性）

2.熒光（FL）Detector（選擇性）

3.化學發(fā)光（CL）Detector（選擇性）

4.示差折光檢測器（通用）每一種物質(zhì)都有不同的折射選擇性

5.電化學檢測器

6.放射性檢測器選擇性

化學發(fā)光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡單的優(yōu)點，但選擇性較差。而高效液相色譜是非常有效的分離手段，將兩者聯(lián)用，可克服化學發(fā)光分析選擇性差的缺點。而化學發(fā)光檢測器又為高效液相色譜提供了高靈敏度的檢測手段。安培法選擇性電導法通用2．儀器

ＰｕｍｐＰｕｍｐＰｕｍｐMobilephaseLCcolumnCLreagentsmixerObservationcellwasteinject3.CL檢測法需要考慮的問題化學發(fā)光反應(yīng)必須對某類物質(zhì)響應(yīng),如果僅與某一種物質(zhì)有關(guān),在HPLC中將有限制的應(yīng)用。化學發(fā)光強度對各種環(huán)境因素是敏感的.如溫度、溶劑、離子強度、pH和其它物質(zhì)的存在。在發(fā)展HPLC分離操作時，這些因素也須加以控制。因此，分離條件和探測條件可能是不兼容的或兩者須相互妥協(xié)?；瘜W發(fā)光反應(yīng)的發(fā)射強度不是常數(shù)，而是隨時間而變化。發(fā)射強度ICL隨時間衰變曲線不同的CL反應(yīng)，有不同的衰變曲線。即使同一反應(yīng)，在不同的條件其衰變曲線也不同。

在流動體系中，整個發(fā)射強度隨時間的衰變曲線將不被觀察，被探測的ICL是反應(yīng)物流經(jīng)檢測池所需時間間隔內(nèi)對發(fā)光強度的積分。在流動體系中，t由流速和池體積所控制，若V不變，通過調(diào)節(jié)流速和流路的設(shè)計使Imax與時間窗口相吻合。如下圖：ICLICLttLucigeninLuminolcellABICLflowtime二.過氧草酸酯化學發(fā)光反應(yīng)

在HPLC中的應(yīng)用1.熒光分析物的測定多環(huán)芳烴（PAHS）

polycyclicaromatichydrocarbons

氨基多環(huán)芳烴（Amino-PAHS）蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘2.熒光衍生分析物的測定一些分析物本身沒有熒光，因此必須進行熒光衍生反應(yīng)，一般衍生在柱前完成。(1)丹磺酰氯及其衍生物

丹磺酰氯是一種非常靈敏的熒光標記

試劑，它的分子體積小，已廣泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羥基化合物。如氨基酸、兒茶酚胺、甾二醇以及某些化合物。（2）衍生物丹磺酰氯的各種衍生物已經(jīng)被合成，如下：

丹磺酰氯可用來衍生羰基化合物，如醛、酮

酮基皮質(zhì)甾類、氧代甾族化合物和膽質(zhì)酸。（3）其它衍生物試劑熒光胺已用于衍生兒茶酚胺。香豆素類試劑可用于衍生含羰基的羧酸、前列腺素、胺和氟代嘧啶類化合物。3.檢測由酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫

酶反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫在過量的熒光物質(zhì)存在下可由PO-CL測定。此反應(yīng)可在pH=7完成，接近大多數(shù)的酶反應(yīng)的pH，這是利用PO-CL測定H2O2優(yōu)于Luminol、光澤精之處。L-aminoacid+H2O+O22-oxoacid+NH3+H2O2L-aminoacidoxidaseD-glucose+H2O+O2gluconicacid+H2O2

Acetylcholineacetate+cholineCholinebetaine+H2O2GlucoseoxidaseacetylcholinesteraseCholineoxidose乙酰膽堿膽堿

這種柱后反應(yīng)器一般采用固態(tài)酶反應(yīng)器。AnalyteEnzymeDetectionlimitCholesterolLactoseFormaldehydeL-AminoacidCholesteroloxidase半乳糖甙酶β-GalactosidaseAldehydeoxidaseL-aminoacidoxidase0.1pmol12ng1pmol2pmolAnalyteEnzymeDetectionlimitAcetylcholineGlucoseL-Aminoacidspolyamines膽堿酯酶GlucoseoxidaseL-AminoacidoxidasePolyaminesoxidase1pmol2pmol1pmol5pmol4.檢測能熄滅過氧草酸酯化學發(fā)光的物質(zhì)

過氧草酸酯的化學發(fā)光反應(yīng)可被某些物質(zhì)熄滅，使發(fā)光強度大大降低。基于此原理，已研究過HPLC-熄滅化學發(fā)光檢測器，可用于溴化物、碘化物、硫化物、亞硫酸鹽、苯胺類及某些有機硫化合物。

PO-CLdetectionofhydrogenperoxideproducedbyenzymaticreactionPO-CL的特點：1.與熒光檢測法相比，PO-CL檢測通?？墒轨`敏度提高30-100%，在酶參加的反應(yīng)中該方法的選擇性也大為提高。2.與激光誘導的熒光檢測法相比，PO-CL對衍生試劑有較寬的選擇范圍，而LIF儀器價格昂貴。

三.LuminolCL體系在HPLC中的應(yīng)用1.催化劑（1）金屬離子的測定金屬離子可催化LuminolCL，因此，金屬離子用離子交換柱分離后，可用LuminolCL測定。如：Cu2+、Co2+、Ni2+

（2）利用抑制劑對LuminolCL產(chǎn)生抑制作用。a.氨基酸b.藥物（兒茶酚胺、氨基糖苷抗菌素、慶大霉素Cc.蛋白質(zhì)（球蛋白、白蛋白）2.卷入H2O2的測定利用分析物定量轉(zhuǎn)化為H2O2，主要用于光氧化的CL體系中。如脂肪族的含氧化合物：醇、醚、醛、糖類，經(jīng)HPLC分離后，經(jīng)光氧化器產(chǎn)生H2O2，可用Co2+催化的LuminolCL體系測定。3.用Luminol作為標記試劑

Luminolisoluminol和aminobutylehyliso-luminol通過-NH2與分析物反應(yīng)，測定luminol及衍生物的濃度已用于羧酸、胺、甲基睪酮、氨基酸、核苷、地谷新、人血清中脫氧麻黃堿等的測定。四、Lucigenin在HPLC中的應(yīng)用利用血液及尿液中有機還原劑（還原性糖、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、尿酸等）與光澤精的化學發(fā)光反應(yīng)。通過HPLC分離后，用光澤精體系檢測這些還原性物質(zhì)。五、生物發(fā)光反應(yīng)在HPLC中的應(yīng)用

可測ATP、膽酸、肌醇磷酸酯異構(gòu)體六、

其它化學發(fā)光反應(yīng)在HPLC中的應(yīng)用（1）釕試劑CL

釕試劑和還原劑作用可產(chǎn)生CL，發(fā)現(xiàn)脂肪胺與試劑反應(yīng)產(chǎn)生CL的次序：叔胺>仲胺>伯胺，芳香胺幾乎不發(fā)生反應(yīng)。釕試劑作為柱后CL衍生試劑，用于脂肪叔胺的HPLCCL檢測，該檢測系統(tǒng)也曾用于抗生素、氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的