農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座

代謝研究方法活體研究invivo離體研究

invitro農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第1頁組織勻漿沉淀（細(xì)胞核、組織碎片）濾液

上清液沉淀（葉綠體）上清液沉淀（線粒體）上清液（胞液、核糖體）沉淀（微粒體）100,000~105,000g,1hr9,000~11,000g,30min1,000~3,000g,10min過濾農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第2頁代謝酶

初級代謝酶水解酶、多功效氧化酶（MFO）次級代謝酶谷光甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（glucuronyltransferase）、硫酸轉(zhuǎn)移酶（sulphateesterase）、甘氨酸轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖轉(zhuǎn)移酶農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第3頁多功效氧化酶（MFO）RH＋O2

＋[2H]ROH＋H2OMFO是膜結(jié)合酶。主要由P450、NADPH-細(xì)胞色素還原酶、NADH-細(xì)胞色素b5還原酶、磷脂等成份組成。其中細(xì)胞色素P450還原形式與CO結(jié)合后在450nm附近產(chǎn)生特征吸收峰，故命名為P450。細(xì)胞色素P450幾乎在全部生物中都存在，包含動物、植物、昆蟲、細(xì)菌等。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第4頁反應(yīng)機(jī)理P450本質(zhì)上屬于血紅素－硫鐵蛋白（heme-thiolateprotein），上面有底物和氧結(jié)合位點(diǎn)。NADPH-細(xì)胞色素還原酶和NADH-細(xì)胞色素b5還原酶在酶系中起電子傳遞作用。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第5頁農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第6頁Thisentirereactioncycleusuallytakesbetween1and10seconds農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第7頁P(yáng)450多樣性

依據(jù)分類命名系統(tǒng),P450蛋白或基因全序列同源部分>40%為同一家族（family）,用一阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性>40%~65%為同一亞族（subfamily）界限，在家族表示式后加一大寫英文字母；每一亞族內(nèi)單個(gè)酶則在表示式后再加一阿拉伯?dāng)?shù)字

農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第8頁哺乳動物當(dāng)前已知哺乳動物體內(nèi)有14個(gè)CYP450家族,即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51（夏偉，）。其中CYP1～CYP4家族是代謝外來化合物主要酶系,而且各同工酶有其較固定代謝底物、反應(yīng)類型。CYP1A底物以環(huán)境致癌物為主,如多環(huán)芳烴、黃曲霉毒素。CYP2E1則主要參加乙醇等小分子化合物代謝,尤其是亞硝胺在體內(nèi)產(chǎn)生致癌、誘變產(chǎn)物必須經(jīng)CYP2E1A2羥化作用。大多數(shù)臨床口服藥品在體內(nèi)代謝酶是CYP3A。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第9頁植物植物第一個(gè)P450cDNA是CYP71A1,它是由Bozak等（1990）由鱷梨中分離出與成熟相關(guān)P450基因。至今已判定了90多個(gè)植物P450基因。它們分屬于27個(gè)家族（CYP51,CYP71,CYP72?CYP96)（劉宛等，）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第10頁昆蟲昆蟲第一個(gè)P450cDNA是Snyder和Davidson（1983）從果蠅Drosophilamdanogaster中分離，但當(dāng)初并不知道它是細(xì)胞色素P450基因，以后被重新發(fā)覺而被定名為CYP4E1。昆蟲P450基因總數(shù)尚不清楚，至今已判定昆蟲P450基因已超出50個(gè)，分屬6個(gè)基因家族(CYP4，CYP6，CYP9，CYP12，CYP28，CYP18)。其中CYP4，CYP6，CYP9，CYPI2，CYP28等5個(gè)基因家族為昆蟲所特有（潘貽武等，）。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第11頁P(yáng)450可誘導(dǎo)性P450能夠代謝許多親脂化合物，包含膽固醇、類固醇、激素、維生素D等內(nèi)源化合物和外源非極性化合物。天然化合物除蟲菊素pyrethrins、單萜類monoterpene、黃酮類flavonoid、香豆素coumarins、甾醇、異黃腦素、2－十三烷酮、2－十三烷酮、吲哚－3－甲醇、尼古丁、?－胡蘿卜素、己醇、保幼激素、蛻皮酮、等等。人工化合物苯巴比妥phenobarbital(BP)、3－甲基膽蒽（3－MC）、DDT、環(huán)戊二烯類殺蟲劑、萘napthaiene、西維因、有機(jī)磷化合物（TOCP、TPP、DEF）、丁羥基丁氧化物butylhydroxybutoxide、丁羥基甲苯butylhydroxytoluene、烷基苯alkylbenzenes、polychlorinatedbephenyls（PCBs）、增效醚piperonylbutoxide(PBO)、苯酰苯脲benzoylphenylureas、保幼激素類似物、等等（邱星輝、冷欣夫，1997）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第12頁農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第13頁依據(jù)現(xiàn)有資料，細(xì)胞色素P450能夠被大約200種化合物誘導(dǎo)，能夠催化約40種類型化學(xué)反應(yīng)，現(xiàn)有底物約1,000種（邱星輝、冷欣夫，1997）。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第14頁MFO參加代謝反應(yīng)烷基羥化芳基羥化農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第15頁O－烷基羥基化N－烷基羥基化農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第16頁環(huán)氧化脫S（活化）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第17頁S－加氧（活化）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第18頁MFO與抗藥性關(guān)系家蠅CYP6A1能夠?qū)蟿┖吐鹊し謩e氧化為狄氏劑和環(huán)氧化氯丹。重組桿狀病毒感染鱗翅目細(xì)胞系統(tǒng)中表示CYP6A2除了能夠?qū)蟿┖吐鹊ぱ趸瘜?yīng)環(huán)氧化物，還能經(jīng)過脫硫作用和氧化酯解作用分別將有機(jī)磷殺蟲劑二嗪磷diazinon代謝為diazoxon和2－異丙基－4甲基－6羥基嘧啶。果蠅CYP4E2基因在DDT抗性品系中高效表示CYP6D1mRNA高效表示與家蠅對二氯苯醚菊酯抗性相關(guān)（朱禮華等，）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第19頁CYP4mRNA高效表示與淡色庫蚊對溴氰菊酯抗性相關(guān)（朱昌亮等，）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第20頁MFO檢測

P450含量測定底物氧化法mRNA含量測定農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第21頁P(yáng)450含量測定特征光譜：還原性P450與CO結(jié)合后在450nm處有最大吸收峰在加有適量連二亞硫酸鈉試管里，加入微粒體懸液，混勻，通CO氣體1min，在分光光度計(jì)上400~500nm范圍進(jìn)行掃描。計(jì)算公式為P450=(A450一A490)／(91×Pr)×1000(nmol／mg蛋白)，其中91為吸光系數(shù)，Pr為蛋白質(zhì)濃度(mg／mL)（嚴(yán)敏芬等，）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第22頁底物氧化法7-乙氧基異吩惡唑——7-乙氧基異吩惡唑0-脫乙基酶（EROD）7-乙氧基豆香素——7-乙氧基豆香素0-脫乙基酶（ECOD）苯并芘B[a]P——芳基羥化酶(AHH)艾氏劑

——環(huán)氧化酶農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第23頁芳香基羥基化酶（arylhydroxylase，AHH）劉永杰等（）以苯并芘為底物得抗氯氟氰菊酯甜菜夜蛾品系中腸微粒體AHH比敏感品系高1.51倍農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第24頁O-烷基羥基化酶用對硝基苯甲醚，又稱對硝基茴香醚（p-nitroanisole,PNA）為底物。反應(yīng)生成對硝基酚在堿性條件下呈黃色，在400nm波長下比色：農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第25頁N-烷基羥基化酶以對氯-N-甲基苯胺為底物，每5毫升反應(yīng)體系中加入3μmol。用含6%對二甲基氨基苯甲醛3mol/L硫酸溶液中止反應(yīng)，在387納米波長下比色：農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第26頁環(huán)氧化酶用艾氏劑作底物，由氣相色譜法檢測（劉永杰等，）。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第27頁測定MFO較為靈敏方法，是以7-乙氧基異吩惡唑或7-乙氧基豆香素作底物，以熒光法測定酶脫O-烷基（EROD，ECOD）活性。測定EROD活性反應(yīng)體系中，7-乙氧基異吩惡唑添加量只需要1μmol/L,用對硝基苯甲醚和對氯-N-甲基苯胺作底物時(shí)，底物添加量分別需到達(dá)800μmol/L和600μmol/L。以熒光法測定EROD活性時(shí)，取激發(fā)波長537納米，發(fā)射波長為583納米。EROD農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第28頁酶源和輔基MFO催化反應(yīng)需要還原型輔酶II（NADPH）參加可直接使用NADPH，也能夠用NADP、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成NADPH生成系統(tǒng)作輔酶。檢測MFO催化反應(yīng)多以微粒體作為酶源農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第29頁ERODCYP1A1MRODCYP1A2PRODCYP2B1/2B2ethoxyresorufinmethoxyresorufinpentoxyresorufin農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第30頁酯酶

羧酸酯酶（B-酯酶，EC3.1.1.1）——馬拉硫磷農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第31頁芳基二烷基磷酸酯酶（A-酯酶，EC3.1.8.1，對氧磷酶）農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第32頁酯酶在害蟲有機(jī)磷抗性中起著極為主要作用，在對氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯抗性中也起一定作用。酯酶在抗性機(jī)制中含有兩個(gè)作用經(jīng)過水解作用產(chǎn)生無毒代謝產(chǎn)物結(jié)合作用殺蟲劑，形成磷?；富虬被柞；?，使殺蟲劑不能抵達(dá)靶標(biāo)。二者均能起到保護(hù)體內(nèi)靶標(biāo)－乙酰膽堿酯酶免受抑制。酯酶與抗藥性農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第33頁酯酶參加代謝反應(yīng)酰胺（水解）酶——樂果農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第34頁芳基酰胺（水解）酶——敵稗農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第35頁環(huán)楊化物水解酶——西維因農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第36頁酯酶檢測酯酶可水解α-醋酸萘酯為醋酸和α-萘酚。后者與固藍(lán)B鹽反應(yīng)生成一個(gè)藍(lán)紫色物質(zhì)（λ=550～600納米nm）。酯酶檢測也能夠用β-醋酸萘酯作底物，產(chǎn)物呈紫紅色。pH對顯色反應(yīng)有很大影響。染液中可加入4~5%SDS，一來增色，二來終止反應(yīng)。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第37頁α-和β-醋酸萘酯為非特異性底物，檢測昆蟲酯酶時(shí)，可在反應(yīng)體系中加入10-7mol/L左右毒扁豆堿，以消除膽堿酯酶活性。毒扁豆堿不能排除其它酯酶，如A-酯酶活性。所幸A-酯酶普通只存在于哺乳動物體內(nèi)。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第38頁谷光甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）依據(jù)底物不一樣，GST（EC2.5.1.18）又能夠分為谷胱甘肽-S-烷基轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-芳基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽-S-環(huán)氧化物基轉(zhuǎn)移酶。以還原型glutathione（甘氨酸＋胱氨酸＋谷氨酸）作為輔酶不論哺乳動物動物，還是昆蟲體內(nèi)GST，多以二聚體形式存在。依據(jù)等電點(diǎn)不一樣，能夠分為堿性（α）、中性（μ）、酸性（π）三種類型農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第39頁GST參加代謝反應(yīng)西維因carbaryl阿特拉津atrazine農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第40頁GST參加代謝反應(yīng)二嗪農(nóng)diazinon

對氧磷paraoxon農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第41頁

GST檢測——谷胱甘肽-S-烷基轉(zhuǎn)移酶以14C標(biāo)識碘甲烷為底物，在酶催化下，碘甲烷與谷胱甘肽生成不揮發(fā)衍生物，未反應(yīng)碘甲烷以溴甲醇除去，經(jīng)過對標(biāo)識物測定求出酶活性：農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第42頁GST檢測——谷胱甘肽-S-芳基轉(zhuǎn)移酶

以1，2-二氯-4-硝基苯（DCNB）或1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）為底物DCNB或CDNB與還原型谷胱甘肽產(chǎn)生軛合物，在360納米波長下有最大吸收峰據(jù)Fournier（1995）等報(bào)道，家蠅體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可分為兩種：酶活性最適pH為酸性（6.5）種類對1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）活性高，最適pH為堿性（8.0）種類對1，2-氯-4-硝基苯有較高活性(DCNB)。農(nóng)藥的代謝醫(yī)學(xué)宣教專家講座第43頁葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（glucuronyltransferase）